Un punto di vista tecnico in Modern Tree-Ring Research - Come superare Dendroecological e legno anatomiche sfide

Sommario

Qui presentiamo un protocollo che delinea come campionare esemplari di legno per la valutazione complessiva delle loro strutture di crescita. Vengono descritte le tecniche di preparazione e visualizzazione macro e microscopiche necessarie per generare set di dati anatomici e dendroecologici del legno ben replicati e altamente risolti.

Abstract

Ricerca Dendroecological usa le informazioni contenute negli anelli degli alberi per capire come singoli alberi e persino interi ecosistemi forestali hanno risposto ai cambiamenti ambientali e di ricostruire finalmente tali cambiamenti. Questo viene fatto attraverso l'analisi le variazioni di crescita nel tempo e correlare i vari parametri specifici vegetali (per esempio) i record di temperatura. Integrare legno parametri anatomici in queste analisi rafforzerebbe ricostruzioni, anche fino a risoluzione intra-annuale. Abbiamo quindi presentiamo un protocollo su come campione, preparare e analizzare campioni di legno per le analisi macroscopiche comuni, ma anche per le successive analisi al microscopio. Inoltre si introduce una potenziale soluzione per l'analisi di immagini digitali generate da piccole e grandi esemplari comuni per sostenere le analisi di serie temporali. Il protocollo presenta i passaggi di base in quanto attualmente possono essere usati. Oltre a questo, vi è una continua necessità per il miglioramento delle tecniche esistenti, e lo sviluppo di nuovi techniques, per registrare e quantificare i processi ambientali passati e in corso. Legno tradizionale ricerca anatomica deve essere ampliata per includere informazioni ecologiche di questo campo di ricerca. Ciò sosterrebbe dendro-scienziati che intendono analizzare nuovi parametri e sviluppare nuove metodologie per comprendere gli effetti a breve e lungo termine, dei fattori ambientali specifici sulla anatomia delle piante legnose.

Introduzione

Alberi, così come arbusti, arbusti nani, e anche le erbe, mostrano modelli di risposta molteplici relativi ai cambiamenti nel loro ambiente. Questi modelli sono stati oggetto di botanica e fisiologia vegetale partire dalla metà del 19 ^° secolo. Allora, la ricerca sulle piante legnose focalizzata soprattutto su alberi e un'analisi descrittiva della struttura e variabilità dei anelli annuali in un contesto ecologico ^1. Quando Andrew Ellicott Douglass ha inventato la tecnica di cross-incontri per la ricerca degli anelli ^2, tale contesto ecologico è stato più o meno represse dalla nuova possibilità di datare con precisione i risultati di legno in archeologia. Cross-incontri per la prima volta ha permesso la datazione precisa di anelli degli alberi per l'anno civile ed è fino ad ora considerata la spina dorsale della ricerca tree-ring in tutti i campi della sua applicazione ^1.

In parallelo, a partire dalla fine del 19 ° secolo, in legno anatomia evoluta in un importante disciplina di ricerca riguardanod per molti altri campi delle scienze naturali e applicate ^3. Sono stabiliti due domini principali: l'anatomia sistematica di legno, che è la base per identificare il legno in archeologia ^4, e l'anatomia del legno applicata, legati alla tecnologia del legno, la fisiologia, la patologia, e l'ecologia ^3,5.

Nella ricerca degli anelli degli alberi, dendroecologia oggi è definito come un tema che comprende studi albero anelli legati concentrandosi su studi ambientali come i processi geomorfologici (dendrogeomorphology), temperatura e ricostruzioni precipitazioni (Dendroclimatologia), i cambiamenti del livello dell'acqua (dendrohydrology) o anche le fluttuazioni dei ghiacciai ( dendroglaciology) ^6. Poiché questa definizione indica, analisi albero-ring sono diventati sempre più importanti nel campo della datazione e di ricostruzione processi ambientali quali (i) le condizioni climatiche del passato analizzando variazioni annuali in anello larghezza ^7,8, la densità del legno ⁹ o isotopi ^10, o (ii) tha ricorrenza intervalli di processi geomorfologici ^11. Questi studi molto dettagliati su variazioni anello larghezza e il loro contenuto isotopico dimostrano la necessità di analizzare anelli più in dettaglio, cioè, per studiare la struttura anatomica degli anelli. Tuttavia, studi dettagliati di legno caratteristiche anatomiche entro gli anelli annuali relativi ai cambiamenti ambientali sono rare ^12,13. Anche se queste caratteristiche microscopiche sono noti ^14, sono state raramente applicate a livello microscopico alla ricerca dendroecological. Inoltre, la tempistica accurata di queste reazioni di crescita in alberi cresciuti naturalmente, essenziali ai fini della esatta datazione, è stato raramente documentato di recente ^15.

Per quanto riguarda gli effetti del riscaldamento globale ^16, il miglioramento delle esistenti e lo sviluppo di nuove tecniche per registrare e quantificare processi ambientali passate e in corso è necessario, soprattutto in termini di clima di ricerca di impatto ^11.Con l'espansione in legno ricerca anatomica tradizionale un'anatomia legno a base ecologica ^17, dendro-scienziati possono analizzare nuovi parametri e sviluppare nuove metodologie per comprendere gli effetti a breve e lungo termine, dei fattori ambientali specifici sulla anatomia delle piante legnose ^18. La conoscenza dettagliata sulle variazioni dei parametri cellulari diversi all'interno dei singoli anelli legati ai driver specifici (ad esempio, le forze meccaniche, variazioni climatiche) è il requisito fondamentale per la comprensione della variabilità in formazione anello albero. Rispetto alle misurazioni anello larghezza comuni, identificando legno varianti anatomiche richiede tecniche di preparazione più complesse e costose che richiedono molto lavoro e tempo. Le procedure dettagliate di taglio del campione, colorazione, e l'inclusione sono molteplici e dipendono sempre l'obiettivo dello studio ^19.

Per l'analisi macroscopica di larghezza dell'anello in conifere o strutture, anche per numero, dimensioni o distribution di imbarcazioni in legno duro, la superficie di un campione è comunemente lucido utilizzando carta abrasiva fine o rettificatrici speciali ^20. Uno svantaggio di questa procedura è il riempimento delle singole cellule con polvere che impedisce un'ulteriore semiautomatica analisi microscopica ^21. I migliori risultati per la preparazione del campione macroscopico si ottengono quando la superficie del campione vengono tagliati con una lama di rasoio o un coltello affilato.

Mentre per i piccoli campioni, lamette sono uno strumento perfetto; campioni più grandi come core richiedono il taglio di superfici piane su tutta l'estensione del core. In contrasto levigatura, le cellule non sono riempite di polvere, che consente ulteriore preparazione per l'analisi dell'immagine successiva. Inoltre, il lume aperto cellulari, le pareti cellulari correttamente tagliate, e la superficie piana dell'intero campione consentono l'applicazione di alta frequenza ²² densitometria per tutta l'estensione del nucleo. Per un'immagine analisi, la superficie dei campioni (cellulepareti) possono essere colorati con inchiostro scuro e il lume celle aperte possono essere successivamente riempito con il gesso bianco per aumentare il contrasto tra la parete cellulare e la zona lume ^19,23. Questo piuttosto semplice tecnica consente una valutazione macroscopica di base delle strutture cellulari più grandi per le misure di formato nave.

Queste tecniche di taglio superfici piane sono sufficienti per le analisi macroscopiche. Per una dettagliata anatomica in legno (cioè, microscopica) analisi, la microscopia a luce trasmessa è il metodo più comune applicata in scienze dendro. Xylem cellule differenziano attraverso processi complessi che comprendono tipo cellulare determinazione, la divisione cellulare, la differenziazione cellulare e la morte cellulare programmata ^24. Poiché la sincronizzazione e la velocità con cui questi processi avvengono determinare caratteristiche anatomiche cellule, condizioni ambientali influenzano questi processi possono generare deviazioni anatomiche nella struttura ad anello. Come un presupposto importante per questi analizzares, micro sezioni devono essere preparati con un microtomo ^19. Nel preparare campioni per il sezionamento, la visibilità del tracheidi o fibra direzione è cruciale. Si raccomanda l'uso di guidato microtomi scorrevole mano per tagliare micro sezioni perché questa tecnica facilita sezioni di alta qualità, come necessario per un'immagine analisi ^19. A seconda dello scopo specifico di un certo studio, micro sezioni sono tagliate perpendicolare o parallelo alla estensione longitudinale delle cellule. Queste sezioni sono poi fotografati sotto un microscopio e le dimensioni delle celle misurate utilizzando l'immagine specializzata analisi software.

Fino a poco tempo, la possibilità di preparare micro sezioni era limitata a campioni di piccole dimensioni solo (circa 1 cm x 1 cm). Questo è accettabile per analizzare singoli eventi come disturbi in anni specifici, ma questa tecnica non permette l'analisi di serie tempo necessario per ricostruzioni ambientali. Questo sforzo può essere realizzare solod attraverso lo sviluppo di nuovi, efficienti ed economiche le procedure di preparazione e tecniche analitiche. Negli ultimi anni, i membri del laboratorio albero-ring al Swiss WSL Istituto federale di ricerca in Svizzera hanno iniziato un intenso lavoro su questo argomento. Come risultato, nuovi dispositivi e tecniche di analisi sono state sviluppate per sostenere l'idea di integrare legno caratteristiche anatomiche a una vasta gamma di argomenti di ricerca ambientali.

Protocollo

1. tecniche di campionamento

1. Carotaggi
   1. Per albero campionamento deriva, estrarre almeno due nuclei con un carotiere incremento di ogni stelo per analizzare lo sviluppo di crescita. Variare la posizione di campionamento sul compito di ricerca, ad esempio, per ricostruzioni climatiche comuni si nuclei parallelo al pendio. Quando si lavora con specie tropicali, prendere almeno tre o più core.
   2. Utilizzare un corer incremento affilato (5, 10 o 12 mm di diametro) e posizionare il corer perpendicolare all'asse crescente dello stelo.
      NOTA: Per avere una posizione controllata e stabile del carotiere, utilizzare uno spintore per evitare movimenti del carotiere diverso sua rotazione durante la foratura si nell'albero. Bore nello stelo fino in e attraverso il midollo. Per anima in legno molto denso (cioè specie tropicali), usare i corpi speciali motoseghe riconfigurata con un adattatore di core di incremento che permettono di base anche fitti boschi come Diospyrus ebenum (Ebony).
   3. Utilizzare un estrattore e rimuovere il nucleo risultante dall'albero. Sformare il corer e rimuoverlo dallo stelo.
   4. Aggiungere un ID specifico del nucleo estratto con una matita morbida scrivendo su un nastro, che viene poi posizionato direttamente sul nucleo. Ripetere la procedura sul lato opposto dello stelo.
   5. Conservare i due campioni della struttura in tubi di plastica o di carta o scatole speciali per evitare danni.
      NOTA: cannucce di carta sono utili soprattutto in ambienti tropicali perché impediscono i nuclei da stampaggio.
   6. Infine, montare i nuclei (direzione delle fibre verticali) su travi di sostegno in legno. Usare acqua fredda in legno resistente colla e lasciate asciugare.
      NOTA: Non montare mai i core su supporti di legno se l'obiettivo dello studio comprende inoltre chimica, isotopi o l'analisi di densità. A tal fine, fissare i nuclei in canaline aperte o un singolo cartone ondulato faccia.
2. Campionamento Micro-core
   1. Utilizzare un dispositivo di perforazione specialeo ago con un'apertura di 2 mm. A seconda dello spessore corteccia di utilizzare uno scalpello per rimuovere una porzione necessaria della corteccia.
   2. Posizionare il dispositivo perpendicolare all'asse crescente sullo stelo come descritto sopra, e utilizzare un martello per penetrare lo xilema dello stelo a circa 2 cm di profondità.
   3. Ruotare l'ago per rompere il risultante micro nucleo all'interno dell'utensile e rimuoverlo dallo stelo. Conservare i micro nuclei in fiale microcentrifuga ed etichettarli.
3. Campionamento Disc
   1. In casi particolari (e soprattutto nei tropici), ad esempio, durante il campionamento ceppi e tronchi d'albero o, quando possibile, prendere i dischi (sezioni perpendicolari all'asse crescente) con una motosega. Basta etichettare i dischi e conservarli fino ulteriori analisi.
      NOTA: Questa procedura di prelievo è più comunemente applicato per tutto il materiale secco morti, storico, archeologico e sub-fossili e legni duri molto dense che non consentono l'utilizzo di defittonatrici incremento.

Preparazione 2. campione

1. Levigatura dischi
   1. Mettere i dischi su una macchina di levigatura e macinare la superficie con una sequenza di abrasivi sempre più sottili, partendo con carta vetrata di grana 80, seguito da 120, 220, 300-grana. Una lucidatura finale con 400-grana è sufficiente per la maggior parte conifere. Per legni duri e le specie tropicali, in particolare l'uso di levigatura graniglie fino a 1.200 a distinguere i confini della crescita-ring.
2. Taglio superfici piane su core
   1. Fissare i nuclei incremento nel supporto nucleo di un microtomo nucleo di nuova concezione che consente di tagliare superfici piane su carote su tutta la loro estensione.
      NOTA: correggere l'orientamento del nucleo all'interno del detentore di avere la direzione delle fibre del campione in posizione verticale, che è in un angolo retto con la lama del microtomo.
   2. Sollevare il nucleo fino a toccare leggermente la lama. Estrarre la lama, che è fissato sulla sfera orientamento cuscinetto sulla misura del nucleo a Cut off una prima parte del piano.
   3. Spingere indietro il coltello dietro il nucleo, sollevare il supporto del campione con il nucleo di circa 10 micron e ripetere la procedura di taglio. Fate questo fino a circa un terzo del diametro del nucleo è tagliato causando una superficie piana continua.
3. Preparazione micro sezioni aggiungendo soluzione di amido di mais.
   1. Per l'analisi dettagliata immagine della struttura anatomica, correggere anime o altri campioni scissi dai dischi nel supporto di un microtomo. Posizionare la lama microtomo, guidata da un cuscinetto a sfere di orientamento di un microtomo slitta recente sviluppato sul bordo superiore del campione e tirare su di esso.
   2. Riportare la lama per sollevare il campione di circa 20 a 30 micron e tirare nuovamente la lama sul campione. Ripetere questa procedura finché non viene creata una superficie continua sulla parte superiore del campione.
   3. Coprire la superficie risultante con una soluzione di amido di mais (10 g di amido di mais, 8 ml di acqua e 100 g di 7% glycerol) con una spazzola comune.
      NOTA: I granuli di amido riempiono le celle aperte del campione per stabilizzare la struttura per il successivo taglio di sezioni sottili.
   4. Sollevare il campione da 15 micron, collocare un pennello sulla superficie del campione e tirare lentamente la lama verso il campione di partenza per tagliare una sezione sottile (sotto la spazzola). Durante il taglio, la sezione risultante scivola sulla lama guidato dalla spazzola.
   5. Quando l'intera sezione viene tagliata, rimuovere il micro sezione dalla lama con una spazzola e acqua (per ridurre l'attrito) e posizionare la sezione su un vetrino per ulteriore elaborazione. Per evitare che l'essiccazione, coprire utilizzando una piccola quantità di glicerolo (33% = una parte del 100% glicerolo e due parti di acqua).

3. MicroSlide Preparazione

1. Per il seguente preparazione di vetrini permanenti, prima lavare il glicerolo dal micro sezione con una pipetta e acqua.
2. Coprire il bagnato section con qualche goccia di safranina (1 g di safranina polvere + 100 ml di acqua) e Astrablue (0,5 g di Astra azzurro polvere + 2 ml di acido acetico 100% + 100 ml di acqua) per distinguere tra lignificata e non lignificato strutture, ma anche per migliorare il contrasto per l'analisi delle immagini successive.
3. Lasciare la sezione riposare per 5 minuti coperti dal colorante e poi lavare via con una pipetta e acqua di nuovo.
4. Non appena il colorante in eccesso viene rimosso, disidratano la sezione con pipette lavandoli con una sequenza di 75% diluito, 96% e infine 100% di etanolo.
5. Utilizzare pipette per sciacquare i campioni sul vetrino anziché ponendo i campioni in un bagno di ridurre il tempo di elaborazione per circa due a 3 min per l'intero processo di disidratazione.
   NOTA: Disidratazione con etanolo impedisce campioni fragili dalla rottura.
6. Successivamente risciacquare la sezione con 100% xilolo.
   NOTA: Lo xilene è cancerogeno e la ventilazione è obbligatoria in laboratorio quando lo si utilizza. Altroprodotti esistono sostituendo xilolo, ma se c'è l'intenzione di conservare i campioni su periodi più lunghi di tempo (anni, decenni) per una potenziale nuova analisi, balsamo del Canada (fase 3.5.2) è il mezzo unico incorporamento che rimane chiaro senza cambiare colore nel tempo. Purtroppo balsamo del Canada deve essere usato in combinazione con xilolo.
7. Finché il xilolo gira latteo (biancastra), ripetere il processo di disidratazione in quanto non è sufficientemente disidratato.
8. Non appena il xilolo rimane chiaro, coprire la sezione con una goccia di 100% balsamo del Canada e coprire con un vetro di copertura di almeno la dimensione della sezione.
   NOTA: Siate consapevoli della rimozione di bolle d'aria premendo delicatamente il vetro di copertura verso il basso.
9. Posizionare la risultante micro scorrevole tra due strisce di plastica resistenti al calore e metterlo su una lastra di metallo. Collocare un peso (ad esempio, un magnete) sulla parte superiore della slitta per premere verso il basso per mantenere la sezione piatta durante il successivo processo di essiccazione.
10. Porre i vetrini in stufa a60 ° C per circa 12 ore. Dopo 12 ore, le diapositive prendere dal forno e metterli su una mensola per far raffreddare a RT (circa 20 ° C). Lasciar raffreddare e togliere il peso e la striscia di plastica e pulire il vetrino con lame di rasoio per rimuovere l'eccedenza balsamo del Canada.

4. Visualizzazione dei contenuti delle celle

1. Preparare la soluzione Nawashin ^25.
   1. Preparare una soluzione di (A) con 5 g di acido cromico, 50 ml di 96% di acido acetico e 320 ml di acqua deionizzata. Preparare un'altra soluzione (B) con 200 ml di formalina con 175 ml di acqua deionizzata.
   2. Miscelare la soluzione A e la soluzione B in un rapporto 1: 1 per creare la soluzione Nawashin.
2. Per visualizzare il contenuto della cella, fissare il campione con soluzione Nawashin per 10 min a fermare tutti i processi di degrado all'interno della cellula.
   NOTA: La fissazione conserva nuclei cellulari che consentono una stima della longevità cellulare (longevità cellulare = nuclei presenti / assenti nuclei, la presenza or assenza del nucleo indica se la cella è vivo o morto).
3. Dopo la fissazione, lavare le sezioni con acqua per rimuovere completamente la soluzione Nawashin prima di colorazione con safranina-Astra blu e prima di loro inoltre colorazione con picrico-anilina blu (1 parte saturo anilina solubile in acqua blu + 4 parti di 10% di acido picrico) .
4. Riscaldare accuratamente il campione a circa 80 ° C (in ogni caso sotto il punto di ebollizione) per accelerare il processo di colorazione. Per la disidratazione e l'inclusione dei campioni seguono il protocollo passaggi 3,4-3,8.

5. Preparare immagini digitali di caratteristiche anatomiche

1. Creare immagini digitali di superfici di base per l'analisi nave.
   1. Tagliare il piano della superficie di base con il microtomo core e macchiare la conseguente superficie nera, semplicemente utilizzando un pennarello.
   2. Non appena il colorante è asciugato, strofinare la superficie del nucleo con il gesso bianco. Premere il gesso nelle cellule semplicemente strofinando il gesso sullasuperficie con un dito. Rimuovere anche il surplus gesso da questa procedura.
      NOTA: Il risultato delle pareti cellulari sono neri e le parti lume dei vasi sono bianche. Questo contrasto è un presupposto per l'analisi delle immagini automatizzata.
   3. Posizionare il nucleo preparata sotto un microscopio binoculare dotato di una fotocamera digitale. Prendere una sequenza di sovrapposizione leggermente (circa. 10%) a partire immagini su un lato del nucleo finché l'intera superficie viene catturata. Stitch le singole immagini per creare un'immagine completa della superficie di base.
2. Creare immagini digitali da micro diapositive
   1. Posizionare i micro diapositive puliti sotto un microscopio e prendere sovrapposizione di immagini da tutta la sezione.
   2. Definire un ingrandimento specifica a seconda delle strutture da analizzare, compresa tra 40X e 1,000X ingrandimento.
   3. Stitch singole immagini per creare un'immagine completa della sezione. Per evitare possibili distorsioni durante il processo di cucitura, usare "; Plan "DI TIPO lenti dell'obiettivo con il microscopio.

6. Quantificare anatomiche Caratteristiche

1. Per rilevare le cellule e le frontiere ad anello utilizzando il ROXAS18 immagine strumento di analisi o software simile, caricare un'immagine completa di un micro sezione e la calibrazione spaziale associata per ottenere risultati quantitativi in ​​unità metriche. Calcolare la calibrazione spaziale misurando il numero di pixel tra le scale di un micrometro immagini scattate fase allo stesso ingrandimento e dividendo il valore ottenuto dalla spaziatura scala in unità metriche (ad esempio 1.000 micron).
2. Selezionare dall'elenco fornito (fornito nel software) una configurazione adatta prima di iniziare la parte automatica dell'analisi.
   NOTA: Una configurazione è un insieme precedentemente ottimizzata di impostazioni di programma che, per esempio, tiene conto del colore colorazione del campione e le dimensioni e la forma gamma delle celle da rilevare. Configurazioni su misura cosìconsentire di produrre risultati di riconoscimento ottimali per diverse specie e qualità di immagine.
   1. Selezionare altre opzioni, come l'uso delle regioni dell'immagine che devono essere inclusi o esclusi per evitare, ad esempio, i margini di immagini in bianco o crepe nel campione, se necessario.
3. Avviare l'analisi premendo il pulsante Analizza. Se scelto, definire regioni dell'immagine che devono essere inclusi o esclusi utilizzando lo strumento poligono, rettangolo o un cerchio. La seguente analisi automatica utilizza algoritmi flessibili per correggere alcune carenze immagine (ad esempio, scarsa contrasto) e migliorare il contrasto in base alla qualità dell'immagine.

Risultati

Tutte le analisi dendroecological dipendono campioni accurati, non importa se sono prese dischi, nuclei, o micro nuclei. Per questo, i dispositivi devono essere in perfetta forma (affilata precisione) per evitare microfessure all'interno del campione di legno. Nel preparare le superfici su anime di incremento, l'uso di un microtomo nucleo è essenziale. La possibilità di avere cellule aperte, che possono essere ulteriormente trattati per migliorare il contrasto per le analisi delle immagini e misurazione delle dimensioni nave (Figura 1), è un primo passo importante verso l'adeguamento delle strutture anatomiche nel tempo le analisi serie. A volte la densità di un campione di legno duro impedisce l'uso di un microtomo. In tal caso una corretta lucidatura e successiva rimozione di eccessiva segatura dalle navi con un compressore o aspirapolvere è l'opzione migliore.

Per analisi più dettagliate delle strutture cellulari più piccoli come primaticcio e tracheidi latewood di conifere, sono necessari micro sezioni di alta qualità. Qui, PotentiAL manufatti come pareti cellulari secondari essendo spogliato la necessità parete primaria da evitare (Figura 2). Se questi manufatti si verificano nelle immagini digitali, l'analisi automatizzata delle dimensioni di cella non è più possibile. I manufatti quindi devono essere corretti manualmente, che richiede tempo e in molti casi si traduce in errori di misurazione di dimensioni cellulari. La semplice applicazione di un fluido non newtoniano, cioè, una soluzione di amido di mais, all'inizio del campione sostiene la stabilità della struttura, riducendo la presenza di artefatti al minimo (figura 2) ^26. Questa applicazione di amido di mais, adatto per tutti i campioni di legno comprese le specie tropicali, rende l'applicazione della procedura embedding ai campioni prima del taglio ridondante.

Sezioni Micro consentono una determinazione più sicuro di anelli annuali. Ciò vale in particolare per le conifere che crescono su loro limiti naturali, vale a dire </ Em>, presso la linea degli alberi in zone di alta montagna. Estremamente anelli stretti sono frequenti e difficili da individuare macroscopicamente (Figura 3). In casi estremi, gli anelli sono costituiti da una o due file di celle primaticcio e una riga di celle latewood appiattite, che mancano (in contrasto con cellule latewood comuni) ispessite pareti cellulari. Per questo sono meglio o addirittura visibile solo quando si utilizza micro sezioni. Inoltre, le fluttuazioni di densità possono essere differenziati dai confini anello più chiaro, che semplifica l'individuazione di anelli annuali in particolare nel Mediterraneo e dei tropici (Figura 3).

Nell'analizzare immagini con un ingrandimento di 40X o superiore, singole cellule sono visibili e lo spessore delle loro pareti cellulari è anche rilevabile. Software di analisi semiautomatica permette la misurazione di parametri specifici lungo percorsi definiti seguito la direzione del loro sviluppo temporale e spaziale (Figura 4). Con questo, chanGES di singoli parametri come il lume cellulari o spessore di parete cellulare possono essere determinati su tutta l'estensione di un anello annuale (Figura 4). Questo può essere fatto per tutti gli anelli visibili all'interno dell'immagine e questo sostiene pienamente la necessità di un'analisi serie tempo prolungato.

Analisi di immagini possono anche essere utilizzati per determinare le fasi di sviluppo di anelli annuali entro il periodo di vegetazione (Figura 5). Quando si analizza l'immagine di una sezione colorate con safranina e Astra-blu a luce polarizzata, anche le diverse fasi di lignificazione, a partire dagli angoli più esterni delle pareti cellulari fino alla completa lignificazione della parete cellulare secondaria, diventano visibili. Questo perché le pareti lignificato (maturo) cellulari brillano in luce polarizzata (Figura 5). Informazioni dettagliate possono essere correlato a dati ambientali documentati per il rispettivo periodo di vegetazione per determinare, ad esempio un più dettagliato relati clima crescita onship.

Figura 1. Esempi di un micro sezione e una superficie piana preparata di una quercia compreso anello larghezza e misurazione delle dimensioni dei vasi sinistra:. Esterno parte di un nucleo di quercia incremento. Il nucleo 5 mm è stata tagliata con un microtomo nucleo. La superficie è stata poi tinto nero con un pennarello e le cellule sono stati riempiti con il gesso bianco dopo la macchia era asciutto. Destra: il grafico indica anello larghezza e dimensione nave misurazioni effettuate sulla superficie del nucleo mostrato a sinistra. Nessun micro sezioni sono stati necessari per fare queste misure a causa della superficie trasparente creato dal microtomo nucleo (modificato dopo ^{il 21).} In basso: sezione Micro tagliato un nucleo incremento, macchiato, disidratati e fissato in Canada balsamo. Spessore: 20 micron, Lunghezza: 25 cm. g "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Immagini di micro sezioni tagliate senza stabilizzazione contro una sezione di taglio con la soluzione di amido di mais. A sinistra: sezione Micro mostrando il taglio artefatti nelle tracheidi primaticcio di una conifera. Il campione è stato tagliato senza incorporare e di conseguenza le pareti secondarie piuttosto sottili degli cellule primaticcio sono stati divisi dalla parete primaria (frecce blu). A destra: sezione Micro senza artefatti nei tracheidi primaticcio di una conifera. Questa sezione (stesso campione, come mostrato a sinistra) è stato tagliato dopo aver applicato la soluzione di amido di mais con un pennello sulla parte superiore della superficie del campione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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. Figura 3. Esempi di confini anelli annuali difficilmente rilevabili sinistra: sezione Micro di un nucleo di incremento (qui: Larix decidua) che mostra un contorno anello (freccia nera) indicato da una sola fila di celle latewood appiattite senza ispessimento delle pareti cellulari. Questo anello non sarebbe visibile macroscopicamente. A destra: fluttuazioni di densità Intra-annuali (freccia bianca) sono comuni a specie mediterranee (micro sezione: Quercus ilex). Il graduale cambiamento della struttura delle cellule verso latewood e ritorno alla struttura primaticcio (freccia bianca) permette di differenziare le fluttuazioni di densità di confini anello reale (freccia nera). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Illustrazione di zona lumen e misure di spessore parete all'interno di un anello annuale di una conifera Top:. Immagine del ritaglio che mostra un esemplare risultati delle analisi ROXAS in un albero-anello di Pinus sylvestris (pino silvestre). Anello confini sono indicati in giallo e contorni di tracheidi lumina in ciano. Per un file radiale (blu tracheidi lumina) gli spessori della parete cellulare di misura è rappresentato da cerchi rossi. Barra della scala Nero = 100 micron. In basso:. I cambiamenti intra-annuale nella zona lume tracheidi e lo spessore tracheidi parete cellulare per l'intero anello annuale Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. example di un anello annuale formatura. L'immagine è stata catturata sotto un microscopio con luce polarizzata da un micro-tinto sezione safranina e Astra-blu ottenuto da un micro-core campionata il ⁷ luglio, 2007 da un decidua Larix crescente nel Lötschental a 1.300 m sul livello del mare. Su questo micro-sezione cellule cambiale, le cellule in fase di ampliamento, le cellule in fase di ispessimento della parete e le cellule mature sono riconoscibili. La larghezza tangenziale dell'immagine copre ~ 1 mm dal xilema sezione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Le sfide di una integrazione riuscita e sostenibile del legno anatomia in ricerca dendroecological sono, oltre a problemi analitici molteplici, soprattutto a causa di aspetti tecnici. Queste sfide vanno dal principio di campionamento si avvicina alla creazione di micro sezioni di alta qualità e la loro successiva analisi ^19.

A prima vista, il campionamento di anime o anche dischi è una procedura semplice che è stato conosciuto per molti anni. Ci sono molte cose che si possono fare male e una piccola imprecisione nel campionamento può causare gravi problemi durante le successive fasi di preparazione e di analisi. Piccole imprecisioni come carotaggio che non è esattamente perpendicolare all'asse del fusto o utilizzando un corer imperfettamente affilata non sono un problema se l'obiettivo dello studio è limitato a suonare larghezza misurazioni. Tuttavia, quando si mira per l'analisi microscopica dei campioni, una direzione di campionamento non corretta potrebbe causare distorsioni ottiche dipareti cellulari, mentre l'uso di contundenti defittonatrici risultati in microfratture all'interno del nucleo. Come risultato, quando si cerca di tagliare micro sezioni di questi nuclei, sezioni sottili appena scompone e una preparazione efficace non è garantita. Lo stesso vale per il campionamento micro-core. Una punta smussata si tradurrà in alta pressione quando il nemico viene martellato nel legno stelo. Di conseguenza, verrà compressa lo strato cambiale. Le cellule cambiale (Figura 5) sono quindi compressi e non possono essere analizzati.

Campionamento Disc è davvero la migliore strategia quando si analizzano le variazioni di crescita per loro si riferiscono ai cambiamenti ambientali. Purtroppo è semplicemente impossibile prendere i dischi da tutti gli alberi destinati ad essere campioni per ulteriori analisi. Tuttavia, soprattutto nel caso di dendrochronology tropicale, una certa quantità di dischi staminali è necessaria in combinazione con nuclei di incremento. I dischi sono utilizzati come base per definire i confini anello e per questo per supportare boundarIES definite sulla base di analisi di carote di incremento ^12,27,28.

I pro ei contro di levigatura contro taglio sono spesso discussi ^1,11,21. Come si è menzionato sopra, la procedura migliore dipende sempre dalla domanda di ricerca ed i parametri da analizzare (macroscopica e microscopica). Se le analisi isotopiche o chimici sono proiettati in un ulteriore passo avanti di lavoro, è della massima importanza che la polvere abrasiva creato da levigatura che può riempire in lumina cellulare su tutto il campione, viene accuratamente rimosso con un aspirapolvere o pressione atmosferica.

Taglio micro sezioni è per tutti microscopica analizza il modo più appropriato di preparazione dei campioni per ulteriori analisi. Prima di tutto, la sezione viene tagliato il campione, che poi può essere mantenuta senza alcuna contaminazione potenziali ulteriori analisi. Secondo queste sezioni consentono di misure ad alta risoluzione dei parametri di cella singola. Inoltre, evitando l'incorporamento tempotecnica utilizzando una soluzione di amido di mais ²⁶ per stabilizzare le cellule è un grande vantaggio in micro sezionamento.

Uno svantaggio di micro sezionamento è ancora la dimensione del campione limitato conseguente lunghi tempi di preparazione. Per la serie in tempo reale analisi tornare indietro nel tempo nel corso dei secoli o addirittura millenni, vi è la necessità di sviluppare ulteriormente i dispositivi esistenti taglio ^17,19, ma anche l'elaborazione delle immagini e analisi ^18. Un primo passo in questa direzione è lo sviluppo del microtomo nucleo ^21, inizialmente fabbricati tagliare superfici piane su carote (Figura 1). Prove recenti hanno rivelato la possibilità di tagliare micro sezioni di interi nuclei utilizzando questo dispositivo (Figura 1).

Micro sezioni di alta qualità forniscono il principio di base per un'analisi efficace immagine. Prendendo le immagini al microscopio è una procedura comune ^19, ma la loro analisi efficace è ancora un compito che richiedeessere ulteriormente sviluppati ^17. Tutti i sistemi di analisi di immagine esistenti sono semi-automatico, cioè, hanno bisogno di essere più o meno intensamente controllato dal tecnico. In molti casi, le immagini devono essere corretti o anche nuove immagini devono essere fatto per migliorare il contrasto per una migliore registrazione di strutture dal software senza modificare lo spessore della parete cellulare all'interno dell'immagine.

Strumenti di analisi dell'immagine specializzati quali ROXAS ^18, WinCell o script specifici per ImageJ ²⁹ sono in grado di fornire i dati anatomici di base, quali il numero di cellule, la dimensione delle cellule, lo spessore della parete cellulare e la posizione delle cellule all'interno dell'anello annuale. Molti parametri anatomici supplementari che sono rilevanti in un contesto dendroecological possono essere calcolate da queste misurazioni di base come la dimensione dei maggiori condotti, distribuzione delle dimensioni dei condotti, dimensione primaticcio o la prima fila di condotti, (ottica) densità del legno, intra-annuale profili di dimensioni condotto e la parete cellularedi spessore, e modelli di raggruppamento di tubazioni (solitario, multipli, ecc).

Utilizzando il software ROXAS ^18, i contorni di lumina condotto (cioè acqua cellule conduzione) e confini anello annuali vengono riconosciuti automaticamente e visivamente rappresentate come overlay sopra l'immagine originale. Algoritmi di rilevamento per tubi sono basati sul colore, la dimensione e la forma informazioni, algoritmi di rilevamento per le frontiere anello sul contesto locale di ogni conduttore. Una cassetta degli attrezzi ci permette di migliorare manualmente questi risultati modificando direttamente le caratteristiche di sovrapposizione, cioè, la cancellazione, l'aggiunta e la modifica dei confini anello e condotto contorni. Dopo la modifica, l'output finale dei dati, tra cui spessore della parete cellulare (conifere), viene generato automaticamente e salvati in un foglio di calcolo. Completamente sistemi automatici non sono attualmente disponibili, non anche per le conifere mostrano una struttura relativamente semplice, ma questo è un obiettivo per gli sviluppi futuri. Ciò sostenere con forza la fuintegrazione ll di legno parametri anatomici in serie temporali di analisi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Carotaggio incrementale			http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article & id=57& Itemid=88& lang=en
Core-Microtome	http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN
		da laboratorio	http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN
Microcarotatore			http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp
soluzione			Dieci parti di acido cromico all'1%, quattro parti al 4% formaldeide e una parte di acido acetico
		picrico-anilina	Una parte di blu anilina saturo e quattro parti di trinitrofenolo disciolto in etanolo al 95%
Safranina			Formula empirica (notazione Hill) C20H19ClN4
Astra-blue			(notazione di Hill) C47H52CuN14O6S3
Formula lineare dell'etanolo			CH3CH2OH
Xilolo (Xilene)			Formula lineare C6H4(CH3)2
Canada Balsam			Soluzione di inclusione per microscopia
Roxas Software			http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN
ImageJ Software			http://imagej.nih.gov/ij/
WinCell			http://imagej.nih.gov/ij/