Qui presentiamo un protocollo che genera grandi quantità di monociti murini da midollo osseo eterogeneo per applicazioni traduzionali. Rispetto ad altri, questo nuovo metodo aiuta a ridurre il numero di animali sacrificati e abbassa i costi evitando metodi costosi come la separazione cellulare magnetica ad alto gradiente (MACS).
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Articolo metodologico
Isolamento e iniezione endovenosa di Murine derivate dal midollo osseo monociti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Come sottotipo di leucociti e progenitori dei macrofagi, i monociti sono coinvolti in molti processi importanti degli organismi e sono spesso oggetto di vari campi della scienza biomedica. Il metodo descritto di seguito è un modo semplice ed efficace per isolare i monociti murini dal midollo osseo eterogeneo.
Il midollo osseo del femore e della tibia dei topi Balb/c viene prelevato mediante lavaggio con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). La sospensione cellulare è integrata con fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) e coltivata su superfici di attacco ultra-basse per evitare la differenziazione dei monociti innescata dall'adesione. Le proprietà e la differenziazione dei monociti sono caratterizzate a vari intervalli. Per la fenotipizzazione viene utilizzata la selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS), con marcatori come CD11b, CD115 e F4/80. Al termine della coltivazione, la sospensione è costituita per il 45%± per il 12% da monociti. Rimuovendo i macrofagi adesivi, la purezza può essere aumentata fino all'86%± al 6%. Dopo l'isolamento, i monociti possono essere utilizzati in vari modi e uno dei metodi più efficaci e comuni per la somministrazione in vivo è l'iniezione endovenosa della vena caudale.
Questa tecnica di isolamento e applicazione è importante per gli studi su modelli murini, specialmente nei campi dell'infiammazione o dell'immunologia. I monociti possono anche essere utilizzati terapeuticamente in modelli murini di malattia.
Introduzione
L'isolamento dei monociti è importante e critico per molti studi in vitro e in vivo. Queste cellule sono bersagli di malattie come l'arteriopatia periferica, la malattia coronarica o altre malattie ischemiche, poiché la crescita dei vasi collaterali è fortemente guidata dall'infiammazione locale. Le risposte infiammatorie comprendono l'attivazione endoteliale e il reclutamento locale di leucociti, principalmente monociti, che poi maturano in macrofagi e creano un ambiente altamente arteriogenico secernendo molteplici fattori di crescita per indurre il rimodellamento di un'arteriola in un'arteria collaterale funzionale1-3. I monociti matura....
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Protocollo
Questo studio è stato condotto con il permesso dello Stato della Sassonia e della Sassonia-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, secondo la sezione 8 della legge tedesca per la protezione degli animali (24D-9168,11-1 / 2008-24).
Isolation 1 Cella
1.1 Preparazione di femore e tibia
- Anestetizzare il mouse utilizzando una concentrazione di isoflurano 5% vaporizzando isoflurano in un contenitore chiuso. Dopo che il mouse ha smesso di muoversi per 3 secondi, eseguire la dislocazione cervicale.
- Disinfettare arti posteriori con etanolo (96%). Togliere la pelle e muscoli e separare le ossa co....
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Risultati
La soluzione di cellule estratte dal midollo osseo murino costituito da vari tipi di cellule. I principali tipi di cellule sono linfociti, granulociti e monociti. Le cellule possono essere stimati in base alle dimensioni e granularità, che è mostrato in Figura 1 per entrambe le sospensioni nativi e cellule raccolte dopo 5 giorni di differenziazione. Si noti la composizione cellulare spostamento durante la coltivazione. Tuttavia, la classificazione accurata delle popolazioni deve poter contare su espress.......
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Discussione
Descriviamo un metodo semplice e conveniente per isolare grandi quantità di monociti murini da midollo osseo. In confronto ad altri protocolli che utilizzano sangue periferico, che ottengono rendimenti monociti 5 su 1.4 x10 6, siamo in grado di ottenere rendimenti più elevati di 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 monociti da un singolo mouse donatore.
Quando si considera sfide con questo metodo, è importante ricordare la possibilità di contaminazione quando si l.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Fondazione tedesca per la ricerca) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, centro di ricerca collaborativa).
Grazie a Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke University Magdeburg, Magdeburgo, Germania, per il supporto tecnico.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra a 6 pozzetti con attacco ultra basso | Corning Incorporated, NY, USA | Piastra a 6 pozzetti con attacco ultra basso, con tappo, sterile | |
| di età compresa tra 8 e 12 settimane, maschio, topi balb/c | Charles River, Sulzfeld, Germania | ||
| Piastra a 96 pozzetti | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germania | ||
| Colorazione blu a cellule morte | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germania | ||
| Albumina sierica bovina | GE Healthcare, Friburgo, Germania | Frazione V, pH 7.0 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germania | 28G, 30G | |
| CD115 | eBioscience, San Diego, Stati Uniti | 12-1152 | |
| CD11b | eBioscience, San Diego, Stati Uniti | 53-0112 | |
| Piastra per colture cellulari | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania | Con tappo, steril | |
| Centrifuga | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germania | Allegra® Centrifuga X-15R | |
| Crema depilatoria | Veet, Mannheim, Germania | ||
| Agente disinfettante | Schü lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Germania | Kodan Tinktur forte | |
| Bisturi monouso n. 10 | Feather rasoio di sicurezza Co.Ltd, Osaka, Giappone | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Amburgo, Germania | ||
| Etanolo 96% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrü cken, Germania | ||
| Unità di estrazione Pipetus | Hirschmann Laborgerä te GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germania | ||
| F4/80 | AbD Serotec, Dü sseldorf, Germania | MCA497APC | |
| tampone FACS | Prodotto dal nostro gruppo con singoli componenti | PBS, 0,5% BSA, 0,1% NaN3 | |
| FACS dispositivo | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | tubi BD FACS Canto II | |
| FACS | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Falcon® pipetta | Becton Dickenson Labware, NY, USA | ||
| Siero fetale di vitello | Sigma Aldrich, Amburgo, Germania | ||
| Pinze fini | Rubis, Stabio, Svizzera | ||
| Guanti | Rö sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germania | ||
| Gr1 | eBioscience, San Diego, USA | 53-5931 | |
| Piastra riscaldante | Labotect GmbH, Gö ttingen, Germania | Piastra riscaldante 062 | |
| Incubatore | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germania | Incu safe | |
| Isofluran | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleiß heim, Germania | ||
| Microscopio ottico | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germania | Axiovert 40 ° C | |
| Fattore stimolante la colonia di macrofagi | Sigma Aldrich, Amburgo, Germania< | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/srp3110?lang=de& region=DE">SRP3110 | |
| Agitatore meccanico | IKA, Staufen, Germania | ms2 minishaker | |
| Medium 199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso | |
| Microprovette | Eppendorf AG, Amburgo, Germania | ||
| Banco di lavoro microbiologico | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germania | Tampone | |
| di lavaggio monociti sicuro per Hera | Prodotto dal nostro gruppo con componenti | PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA | |
| Dispositivo di ritenuta per topi | Vari | ||
| NaCl | Berlin Chemie AG, Berlino, Germania | ||
| NaN3 (acido di sodio) | Sigma Aldrich, Amburgo, Germania | ||
| Camera di conteggio Neubauer | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö nigshofen, Germania | ||
| Setaccio cellulare in nylon | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | Filtro cellulare, 70 & micro; m dimensione della maglia | |
| Penicillina/streptomicina | Sigma Aldrich, Amburgo, Germania | ||
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germania | pH 7,4, sterile | |
| Pipette | Eppendorf AG, Amburgo, Germania | 10µ l/100µ l/200µ l/1.000µ l | |
| Teste di pipettaggio | Eppendorf AG, Amburgo, Germania | ||
| Pipetta sierologica | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania | Cellstar 5 ml, 10 ml | |
| Unità di aspirazione | Integra bioscience, Fernwald, Germania | Vacusafe comfort | |
| Forbici chirurgiche | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Siringa | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germania | 1 ml Omnifix® -F siringa per insulina | |
| Tubi con tappo | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germania | 15 ml/50 ml Tubi Cellstar | |
| Bagno di acqua calda | Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germania | Julabo SW22 |
Riferimenti
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Hum Gene Ther. 15 (1), 1-12 (2004).
- Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C.
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Ristampe e permessi
