Isolamento e iniezione endovenosa di Murine derivate dal midollo osseo monociti

Sommario

Qui presentiamo un protocollo che genera grandi quantità di monociti murini da midollo osseo eterogeneo per applicazioni traduzionali. Rispetto ad altri, questo nuovo metodo aiuta a ridurre il numero di animali sacrificati e abbassa i costi evitando metodi costosi come la separazione cellulare magnetica ad alto gradiente (MACS).

Abstract

Come sottotipo di leucociti e progenitori dei macrofagi, i monociti sono coinvolti in molti processi importanti degli organismi e sono spesso oggetto di vari campi della scienza biomedica. Il metodo descritto di seguito è un modo semplice ed efficace per isolare i monociti murini dal midollo osseo eterogeneo.

Il midollo osseo del femore e della tibia dei topi Balb/c viene prelevato mediante lavaggio con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). La sospensione cellulare è integrata con fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) e coltivata su superfici di attacco ultra-basse per evitare la differenziazione dei monociti innescata dall'adesione. Le proprietà e la differenziazione dei monociti sono caratterizzate a vari intervalli. Per la fenotipizzazione viene utilizzata la selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS), con marcatori come CD11b, CD115 e F4/80. Al termine della coltivazione, la sospensione è costituita per il 45%± per il 12% da monociti. Rimuovendo i macrofagi adesivi, la purezza può essere aumentata fino all'86%± al 6%. Dopo l'isolamento, i monociti possono essere utilizzati in vari modi e uno dei metodi più efficaci e comuni per la somministrazione in vivo è l'iniezione endovenosa della vena caudale.

Questa tecnica di isolamento e applicazione è importante per gli studi su modelli murini, specialmente nei campi dell'infiammazione o dell'immunologia. I monociti possono anche essere utilizzati terapeuticamente in modelli murini di malattia.

Introduzione

L'isolamento dei monociti è importante e critico per molti studi in vitro e in vivo. Queste cellule sono bersagli di malattie come l'arteriopatia periferica, la malattia coronarica o altre malattie ischemiche, poiché la crescita dei vasi collaterali è fortemente guidata dall'infiammazione locale. Le risposte infiammatorie comprendono l'attivazione endoteliale e il reclutamento locale di leucociti, principalmente monociti, che poi maturano in macrofagi e creano un ambiente altamente arteriogenico secernendo molteplici fattori di crescita per indurre il rimodellamento di un'arteriola in un'arteria collaterale funzionale^1-3. I monociti maturano anche in cellule dendritiche, che vengono spesso utilizzate per studi immunologici^4,5 e ricerca sul cancro^6,7.

Problematico nell'approccio per l'isolamento dei monociti dal sangue periferico⁸ è l'alto numero di animali donatori necessari per produrre una quantità sufficiente di monociti per la maggior parte delle analisi. I protocolli precedenti descrivono metodi come la centrifugazione in gradiente di densità e la deplezione cellulare tramite MACS⁹ durante l'isolamento dei monociti; Tuttavia, queste tecniche possono alterare le caratteristiche e la funzionalità dei monociti, il che può portare a difficoltà di interpretazione^10,11. Inoltre, questi metodi sono difficili e possono ridurre la riproducibilità sperimentale.

Il nostro obiettivo con questo protocollo è fornire un metodo semplice ed economico per generare grandi quantità di monociti derivati dal midollo osseo. Grazie all'elevata resa cellulare di 11 x 10⁶ ± 3 x 10⁶ cellule ottenute da questo protocollo, possiamo ridurre sostanzialmente il numero di topi necessari durante l'isolamento dei monociti derivati dal midollo osseo. La procedura può essere completata in un lasso di tempo minimo e senza utilizzare tecniche costose e complicate come indicato sopra. Qui, estraiamo i monociti dalla sospensione nativa del midollo osseo di topi donatori, coltiviamo la sospensione su piastre di attacco ultrabasse e integriamo la soluzione con 20 ng/ml di M-CFS. Il 5° giorno di incubazione, le cellule vengono raccolte e caratterizzate per confermare le proprietà funzionali e fenotipiche.

Per gli esperimenti nel campo dell'arteriogenesi, il trapianto endovenoso di questi monociti derivati dal midollo osseo nei topi è un metodo efficace di somministrazione sistemica di farmaci, che può essere combinato con la legatura dell'arteria femorale nei comuni modelli di arteriopatia periferica.

Protocollo

Questo studio è stato condotto con il permesso dello Stato della Sassonia e della Sassonia-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, secondo la sezione 8 della legge tedesca per la protezione degli animali (24D-9168,11-1 / 2008-24).

Isolation 1 Cella

1.1 Preparazione di femore e tibia

1. Anestetizzare il mouse utilizzando una concentrazione di isoflurano 5% vaporizzando isoflurano in un contenitore chiuso. Dopo che il mouse ha smesso di muoversi per 3 secondi, eseguire la dislocazione cervicale.
2. Disinfettare arti posteriori con etanolo (96%). Togliere la pelle e muscoli e separare le ossa con un bisturi sterile.
   1. Inizia con una incisione cutanea inguinale, ed estendere l'incisione verso il malleolo mediale ed eseguire una dissezione circolare della pelle intorno al polpaccio inferiore. Togliere la pelle delle gambe completamente peeling prossimale.
   2. Staccare il muscolo quadricipite dal femore con un bisturi affilato, rimuovere entrambi i peroneo anterioreei gruppi muscolo gastrocnemio e disarticolare la gamba alla articolazione dell'anca individuando e dissezione dei legamenti.
   3. Inizia anteriormente e procedere intorno all'articolazione ruotando con cura la gamba e sezionare i legamenti, disarticolare quindi l'articolazione.
3. Lavare femore e tibia con etanolo al 96% per un minimo di 90 sec per garantire preparazione cellulare asettica. Continua il processo di lavaggio con PBS sterile per risciacquare l'etanolo residuo.
   Nota: Tutti i passi successivi devono essere sterile per evitare contaminazioni.

1.2 La raccolta di midollo osseo

1. Tagliare l'estremità prossimale e distale di ciascun osso con un paio di forbici sottili per accedere agli alberi femorale e tibiale. Fate attenzione con questo passo, dal momento che queste ossa si rompono molto facilmente.
2. Lavare le ossa con supporto caldo (M199 + 10% di siero fetale bovino (FCS), + 1% penicillina / streptomicina). Utilizzare un ago sterile 28-G, una siringa da 1 ml, e tra 10-15 ml di mezzo perosso per il risciacquo.
3. Tenere l'osso con una pinza sottile e risciacquare uno per uno fino a quando non diventa semi-trasparente. Applicare con attenzione la pressione all'estremità dello stantuffo della siringa in modo da minimizzare lo stress cellulare.
4. Filtrare il midollo osseo attraverso un 70 micron nylon web e raccogliere il filtrato. Per estrarre la quantità massima di midollo osseo, lavare ripetutamente dalle estremità distali e prossimali.
5. Sciacquare il setaccio con PBS e raccogliere il filtrato. Rimuovere con cautela i detriti e conglomerati cellulari di blanda agitazione e pipettaggio.

1.3 Coltivazione

1. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 xg per 10 min a RT. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule con circa 25 ml di terreno. Ripetere una volta.
2. Risospendere le cellule in 6 ml di terreno dopo la seconda fase di lavaggio. Mescolare 50 ml di soluzione di cellule con 50 ml di trypan blu. Contare le cellule in una camera di conteggio al microscopio ottico. Calcolare il numero di cells nella soluzione con questa formula:
   
3. Seme le cellule su piastre di superficie ultra-bassa fissaggio 6 pozzetti per prevenire l'adesione permanente al fondo della piastra. Utilizzare una concentrazione di 10 ⁶ cellule per ml con fino a 6 ml per pozzetto.
4. Supplemento la sospensione con 20 ng / ml M-CSF per promuovere la differenziazione delle cellule.
5. Coltivare le cellule per 5 giorni a 37 ° C e 5% di anidride carbonica e di osservare tutti i giorni.

1.4 La raccolta di cellule

Nota: Queste procedure devono essere eseguite su ghiaccio. Procedere con o 1.4.1 o 1.4.2 di conseguenza.

1. A questo punto, raccogliere tutta la cultura, tra cui i macrofagi differenziati che aderiranno alla cultura-piastre, anche se sono lastre di superficie ultra-low-attaccamento.
   1. Raccolto l'intera cultura delicatamente pipettando e staccare con una soluzione di 4 ° C PBS, 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) e 2 mM EDTA. Ripetere fino a quando le piastre sono chiare di rimanere cellule aderenti - confermano al microscopio in caso di incertezza.
2. In alternativa, scartare macrofagi aderenti raccogliendo il surnatante con le cellule in sospensione, che contengono prevalentemente monociti.
   1. Raccogliere le cellule non aderenti con una soluzione di PBS senza EDTA e 0,5% BSA. Non applicare troppa forza per evitare di spostare leggermente macrofagi aderenti.

1.5 FACS-Analysis (Opzionale)

Nota: È possibile esaurire la sospensione cellulare di cellule progenitrici essendo soggetti a regimi e CD117 ⁺ dall'uso di MACS. Utilizzare protocolli produttore per questa procedura.

1. Raccogliere le cellule in base a uno i punti 1.4.1 e 1.4.2.
2. Centrifugare le cellule a 250 xg per 10 min a 4 ° C e ripetere questo passo.
3. Risospendere almeno 250.000 cellule in 300 ml di FACS bUffer per sonda.
4. Trasferire la soluzione di cellule su un 96-pozzetti-(30 microlitri per pozzetto).
5. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C.
6. Rimuovere il surnatante e aggiungere 25 ml di anticorpi ad ogni pozzetto (diluizione usare produttore).
7. Colorare le cellule con anticorpi (seguenti protocolli produttore per fenotipizzazione cellulare dopo passaggi 1.5.1-1.5.6. Marker comunemente usati per l'identificazione dei monociti / macrofagi includono CD11b, F4 / 80 (figura 3), CD115 (figura 2), e Gr- 1.
   Nota: Per una descrizione più dettagliata delle soluzioni cellulari, si consiglia l'uso di marcatori come CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G, e CD192. Caratteristiche cellulari sono stati precedentemente descritti ^12.
8. Incubare le sonde per 20 min a 4 ° C.
9. Centrifugare le sonde a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere con 200 microlitri di tampone FACS. Ripetere thè un passo due volte.
10. Trasferire le sonde in tubi FACS ed eseguire l'analisi FACS ^12.
11. Eseguire analisi FACS ¹² al giorno 0, 3 e 5 per analizzare la differenziazione cellulare.

2. Tail Vein Injection

2.1 Preparazione

1. Riscaldare gli animali su una piastra riscaldante a 37 ° C per circa 10 min. Osservare gli animali, mentre il riscaldamento a riconoscere i segni di surriscaldamento.
2. Risospendere i monociti, isolati in passaggi 1.1- 1.4, in 150 ml di NaCl, e caricare le cellule in una siringa da 1 ml di insulina con un ago 30G. Leggermente agitare la soluzione prima di caricare la siringa per assicurare tutti i monociti vengono iniettati. Maneggiare sempre le cellule in ghiaccio per evitare l'attaccamento calore mediata e l'attivazione dei monociti.

2.2 Trattenere

1. Evitare di disturbare gli altri topi in gabbia quando si sceglie un mouse per iniezione endovenosa.
2. Posizionare il mouse il limitatore. Evitare troppo prEssure e stare attenti con gli arti posteriori. (Figura 4)
   Nota: In alternativa, utilizzare l'anestesia generale per garantire stress accudimento degli animali.
3. Assicurarsi che il mouse ha spazio per respirare prima di chiudere il limitatore.

2.3 Iniezione

1. Disinfettare il sito di iniezione con disinfettante. Spruzzare sulla coda del mouse e lasciate riposare per almeno 1 min.
2. Interrompere il flusso di sangue venoso della coda, applicando una leggera pressione sul lato coda laterale sopra il sito di iniezione, per una migliore visibilità delle vene.
3. Girare la coda di 90 gradi, prima dell'iniezione. (Figura 5)
4. Iniettare un angolo di 45 gradi. Iniettare lentamente e non più di 5 ml per g di evitare gli animali danneggiare.
5. Se c'è una bolla, che è un segno di una iniezione fallito, interrompere immediatamente e ripetere l'iniezione più prossimale.
6. Fermare l'emorragia sul lato iniezione applicando dolce pressione per circa 1 min.
7. Al termine della procedura, aprire riavvolgitore e posizionare il mouse nella gabbia.
8. Osservare il mouse per 20 minuti al fine di garantire che l'animale non è stato danneggiato da iniezione e decubito sternale è mantenuta. Estendere il tempo di osservazione fino a quando il mouse riprende conoscenza sufficiente. Ritorna il mouse per la compagnia di altri animali solo dopo che ha pienamente recuperato.

Risultati

La soluzione di cellule estratte dal midollo osseo murino costituito da vari tipi di cellule. I principali tipi di cellule sono linfociti, granulociti e monociti. Le cellule possono essere stimati in base alle dimensioni e granularità, che è mostrato in Figura 1 per entrambe le sospensioni nativi e cellule raccolte dopo 5 giorni di differenziazione. Si noti la composizione cellulare spostamento durante la coltivazione. Tuttavia, la classificazione accurata delle popolazioni deve poter contare su espress...

Discussione

Descriviamo un metodo semplice e conveniente per isolare grandi quantità di monociti murini da midollo osseo. In confronto ad altri protocolli che utilizzano sangue periferico, che ottengono rendimenti monociti ⁵ su 1.4 x10 ^6, siamo in grado di ottenere rendimenti più elevati di 11 x 10 ⁶ ± 3 x 10 ⁶ monociti da un singolo mouse donatore.

Quando si considera sfide con questo metodo, è importante ricordare la possibilità di contaminazione quando si l...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra a 6 pozzetti con attacco ultra basso	Corning Incorporated, NY, USA		Piastra a 6 pozzetti con attacco ultra basso, con tappo, sterile
di età compresa tra 8 e 12 settimane, maschio, topi balb/c	Charles River, Sulzfeld, Germania
Piastra a 96 pozzetti	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germania
Colorazione blu a cellule morte	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germania
Albumina sierica bovina	GE Healthcare, Friburgo, Germania		Frazione V, pH 7.0
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germania		28G, 30G
CD115	eBioscience, San Diego, Stati Uniti	12-1152
CD11b	eBioscience, San Diego, Stati Uniti	53-0112
Piastra per colture cellulari	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania		Con tappo, steril
Centrifuga	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germania		Allegra® Centrifuga X-15R
Crema depilatoria	Veet, Mannheim, Germania
Agente disinfettante	Schü lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Germania		Kodan Tinktur forte
Bisturi monouso n. 10	Feather rasoio di sicurezza Co.Ltd, Osaka, Giappone
EDTA	Sigma Aldrich, Amburgo, Germania
Etanolo 96%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrü cken, Germania
Unità di estrazione Pipetus	Hirschmann Laborgerä te GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germania
F4/80	AbD Serotec, Dü sseldorf, Germania	MCA497APC
tampone FACS	Prodotto dal nostro gruppo con singoli componenti		PBS, 0,5% BSA, 0,1% NaN3
FACS dispositivo	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		tubi BD FACS Canto II
FACS	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® pipetta	Becton Dickenson Labware, NY, USA
Siero fetale di vitello	Sigma Aldrich, Amburgo, Germania
Pinze fini	Rubis, Stabio, Svizzera
Guanti	Rö sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germania
Gr1	eBioscience, San Diego, USA	53-5931
Piastra riscaldante	Labotect GmbH, Gö ttingen, Germania		Piastra riscaldante 062
Incubatore	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germania		Incu safe
Isofluran	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleiß heim, Germania
Microscopio ottico	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germania		Axiovert 40 ° C
Fattore stimolante la colonia di macrofagi	Sigma Aldrich, Amburgo, Germania<	a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/srp3110?lang=de& region=DE">SRP3110
Agitatore meccanico	IKA, Staufen, Germania		ms2 minishaker
Medium 199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria		Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
Microprovette	Eppendorf AG, Amburgo, Germania
Banco di lavoro microbiologico	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germania		Tampone
di lavaggio monociti sicuro per Hera	Prodotto dal nostro gruppo con componenti		PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA
Dispositivo di ritenuta per topi	Vari
NaCl	Berlin Chemie AG, Berlino, Germania
NaN3 (acido di sodio)	Sigma Aldrich, Amburgo, Germania
Camera di conteggio Neubauer	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö nigshofen, Germania
Setaccio cellulare in nylon	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		Filtro cellulare, 70 & micro; m dimensione della maglia
Penicillina/streptomicina	Sigma Aldrich, Amburgo, Germania
Soluzione salina tamponata con fosfato	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germania		pH 7,4, sterile
Pipette	Eppendorf AG, Amburgo, Germania		10µ l/100µ l/200µ l/1.000µ l
Teste di pipettaggio	Eppendorf AG, Amburgo, Germania
Pipetta sierologica	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania		Cellstar 5 ml, 10 ml
Unità di aspirazione	Integra bioscience, Fernwald, Germania		Vacusafe comfort
Forbici chirurgiche	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Siringa	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germania		1 ml Omnifix® -F siringa per insulina
Tubi con tappo	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germania		15 ml/50 ml Tubi Cellstar
Bagno di acqua calda	Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germania		Julabo SW22