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Articolo metodologico

Colture organotipiche Slice di studi di post-natale neurogenesi

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⸱

DOI:

10.3791/52353

⸱

4 marzo 2015

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Toronto, 2Institute of Anatomy and Cell Biology, School of Medicine, National Yang-Ming University, 3Department of Education and Research, Taipei City Hospital

In questo articolo

Sommario

Qui si descrive una tecnica per lo studio dell'ippocampo la neurogenesi postnatale utilizzando la tecnica organotipica cultura fetta. Questo metodo permette la manipolazione in vitro di neurogenesi adulta e permette l'applicazione diretta di agenti farmacologici per l'ippocampo in coltura.

Abstract

Qui si descrive una tecnica per lo studio dell'ippocampo la neurogenesi postnatale nel cervello dei roditori utilizzando la tecnica organotipica cultura fetta. Questo metodo mantiene la morfologia caratteristica topografica dell'ippocampo pur consentendo l'applicazione diretta di agenti farmacologici per le sviluppo giro dentato dell'ippocampo. Inoltre, culture fetta possono essere mantenuti fino a 4 settimane e, quindi, permettono di studiare il processo di maturazione dei neuroni granulari neonati. Culture fetta consentono efficace manipolazione farmacologica di fettine ippocampali escludendo variabili complesse quali incertezze relative alla posizione anatomica profonda dell'ippocampo e la barriera ematoencefalica. Per queste ragioni, abbiamo cercato di ottimizzare culture fetta organotipiche specificamente per la ricerca neurogenesi postnatale.

Introduzione

La neurogenesi adulta nell'ippocampo dei mammiferi rappresenta un notevole esempio della capacità innata del cervello di adattabilità e plasticità. Le cellule granulari dentate (DGC) sono generate da un pool rinnovabile di cellule progenitrici neurali nel giro dentato dell'ippocampo, che è una delle due regioni neurogeniche attualmente ben caratterizzate nel cervello dei mammiferi, e si ritiene che sia particolarmente importante per l'apprendimento e la memoria. L'ippocampo fa parte del sistema limbico e ha una posizione profonda all'interno del cervello dei mammiferi, il che lo rende un bersaglio difficile per una precisa manipolazione farmacologica. Inoltre, la neurogenesi aberrante è stata implicata in condizioni come l'epilessia, la schizofrenia e il morbo di Alzheimer, che ha suscitato interesse nella comprensione dell'influenza di vari agenti farmacologici durante la maturazione e la sopravvivenza dei neuroni neonati. La distinzione tra neurogenesi postnatale e adulta è sfumata e studi precedenti hanno dimostrato che molte caratteristiche dello sviluppo neuronale in vivo nel primo periodo postnatale e nell'età adulta sono simili25. Qui sottolineiamo la neurogenesi postnatale e suggeriamo possibili applicazioni alla neurogenesi adulta.

Le colture organotipiche di fette forniscono un metodo in vitro efficiente per studiare varie proprietà fisiologiche dell'ippocampo dei mammiferi. Il valore delle colture di fette preparate da cervelli di roditori può essere riassunto in tre qualità principali: 1) il protocollo è semplice e richiede materiali prontamente disponibili; 2) le colture a fette consentono studi farmacologici che eliminano variabili complesse come la posizione anatomica profonda dell'ippocampo e aggirano la barriera ematoencefalica1; e 3) la struttura ben caratterizzata dell'ippocampo e del circuito trisinaptico è preservata2. Precedenti ricercatori hanno utilizzato la coltura ippocampale organotipica per studiare lo sviluppo sinaptico e la fisiologia3,4, la gliogenesi5-7, il danno cerebrale ischemico8,9, la neuroprotezione e la neuroriparazione10-12 e l'epilessia13-15. Le colture a fette potrebbero anche fornire un utile sistema modello che consente il monitoraggio dello sviluppo cellulare in combinazione con la marcatura delle cellule con la proteina fluorescente verde (GFP) o altri marcatori vitali.

Le colture a fette sono state precedentemente impiegate per studiare la neurogenesi ippocampale postnatale16-19, ma un fattore importante nella maggior parte di questi studi è la degenerazione ben caratterizzata che deriva dall'espianto di tessuto da animali adulti dopo circa 2 settimane in vitro20,21. Per questo motivo, le colture a fette sono tipicamente preparate da topi o cuccioli di ratto precoci post-natali (P5-P10), che utilizzano la migliore vitalità del tessuto cerebrale postnatale precoce per la coltura22. Mentre studi precedenti hanno dimostrato che l'ippocampo postnatale precoce e adulto differisce per quanto riguarda la fisiologia sinaptica e l'espressione di specifici sottotipi neuronali23,24, esiste una sostanziale conservazione del programma di sviluppo coreografato attraverso il quale le cellule dei granuli dentati neonati procedono durante la maturazione25. Inoltre, studi recenti hanno suggerito che le caratteristiche fisiologiche dei DGC neonati in coltura sono molto simili ai neuroni immaturi nella preparazione acuta della fetta ippocampale16.

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Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sugli animali conformi alle linee guida per la salute e il benessere degli animali del Dipartimento di Medicina comparata presso l'Università di Toronto.

1. Preparazione di fettine di ippocampo

  1. Sterilizzare i seguenti strumenti che utilizzano l'autoclave secco a 125 ° C: manico bisturi (# 3) (2), pinze modello standard, di grandi dimensioni (1), Piccolo dissettore forbice (angolato a lato) (1), Micro cucchiaio (cucchiaio e piatto estremità spatola) (1), Micro-spatole (arrotondati e arrotondati estremità rastremate) (2), pennello fine (1), Fuoco lucidato pipetta Pasteur (2), le piazze garza, 2 x 2 pollici (5).
  2. Quando sterili, mettere gli strumenti in un contenitore sterile e mantenere coperta fino al momento dell'uso. Immediatamente prima dissezione, immergere gli strumenti in una soluzione di etanolo al 70%.
  3. Preparare una piastra di coltura da 6 pozzetti con inserto cultura prima di iniziare la procedura di dissezione aggiungendo 1 ml di terreno di coltura / pozzetto e memorizzare la piastra nella incubatore a 35 ° C unand 5% di CO 2.

2. Disporre strumenti di dissezione in cappa sterile a flusso laminare

  1. Spruzzare la cappa a flusso laminare con il 70% di etanolo e rimuovere strumenti di dissezione sterili da alcol. Lasciare gli strumenti per asciugare mentre riposa su una piastra di Petri sterile per evitare il contatto tra l'alcol e il tessuto cerebrale sezionato.
  2. Deposito 5-7 ml di soluzione di dissezione ghiacciata sterilizzato in 2 grandi piastre sterili. Un piatto sarà raffreddare e pulire la testina (sporca), l'altro per il raffreddamento e il risciacquo del cervello scavato (pulito). Inserire un filtro di carta sterilizzata in uno dei coperchi piatto Petri per sezionare il cervello.
  3. Inserire un piccolo, carta da filtro sterilizzato in una piccola capsula di Petri coperchio per sezionare l'ippocampo. Deposito 3-5 ml di soluzione di dissezione ghiacciata sterilizzato in 2 piccoli, piastre sterili. Un piatto terrà l'ippocampo scavato, si terrà sezioni durante la separazione delle sezioni di ippocampoal microscopio dissezione.
  4. Preparare il chopper tessuto con nastro adesivo un pezzo di carta da filtro sterile per la fase di taglio e il montaggio di una lama di rasoio sterile. Bagnare la carta da filtro con una soluzione sterilizzata dissezione.
  5. Spruzzare un bio-bag pulito con alcool e collocarlo in flusso laminare banco pulito.

3. ippocampale Dissection

  1. Spruzzare il ratto pup P7 Sprague Dawley con il 70% di etanolo al di fuori del banco pulito flusso laminare e decapitarlo rapidamente l'animale con grandi forbici chirurgiche sterili all'interno del banco a flusso laminare. Lasciate che la testa cadere nella soluzione dissezione ghiacciata in una delle piastre di Petri.
  2. Nella capsula di Petri, lavare via il sangue e velocemente trasferire la testa di carta da filtro sterilizzato, lato ventrale verso il basso.
  3. Usando il bisturi, tagliare lungo la superficie dorsale nel piano sagittale per esporre il cranio sottostante. Tagliare attraverso la pelle, ma non l'osso sottostante, che è morbido e facilmente penetrabili in ratti di tla sua età. Mettere da parte il bisturi "sporco" e non usare su tessuto cerebrale.
  4. Utilizzando le piccole forbici dissettore (angolato a lato) e pinze, taglio aperto il cranio lungo sutura sagittale del cranio di bregma, il punto anatomica sul cranio dove la sutura coronale è intersecato perpendicolarmente dalla sutura sagittale. Usare pinze per tirare lembi cranio alto e lontano dalla linea mediana del cranio.
  5. Posizionare il micro cucchiaio sul lato inferiore del cervello, sotto il tronco cerebrale, per sollevare delicatamente il cervello dal cranio. Sollevare il cervello per esporre i nervi ottici e bulbo olfattivo sulla superficie basale del cervello. Tagliare queste strutture con piccole forbici per staccare completamente il cervello da teschio. Rimuovere e trasferire il cervello integro e il loro piatto Petri grande contenente soluzione dissezione ghiacciata.
  6. Utilizzando il micro cucchiaio, trasferire il cervello di un piccolo coperchio Petri-piatto contenente carta da filtro sterile. Con una pipetta Pasteur sterile, lavare il cervello con qualche goccia di dissecting soluzione per mantenere il tessuto umido.
  7. Utilizzando un "clean" bisturi tagliare i due emisferi a parte. Trasferire l'emisfero sinistro torna a grande piatto di Petri con micro cucchiaio e posizionare emisfero lato pia dalla soluzione di dissezione ghiacciata per un uso successivo.
  8. Guarda la faccia mediale dell'emisfero destro e identificare il fornice bordo, una fascia importante della sostanza bianca lungo il bordo mediale dell'ippocampo. Usando un bisturi sterile, fare un taglio sagittale attraverso il fornice, ma prendersi cura perché solo 0,5 cm di punta bisturi saranno sufficienti per tagliare il fornice.
  9. Usando 2 micro-spatole, rimuovere il primo dell'ippocampo da emisfero destro mettendo la destra-spatola su tronco cerebrale e sollevando la corteccia sovrastante con la spatola sinistra. Sollevare delicatamente la corteccia per rivelare il ventricolo laterale e la superficie mediale dell'ippocampo. Una linea curva bianca, la fimbria, dovrebbe essere visibile.
  10. Allineate la curvatura della spatola con la curvatura della fimbria e premere delicatamente la spatola sotto la fimbria. Far scorrere la spatola sinistra e corsa lungo l'asse rostrale-caudale e poi sollevare spatola in direzione dorsale per rimuovere ippocampo.
  11. Trasferire l'ippocampo di un piccolo piatto ° 2 Petri con una soluzione di dissezione ghiacciata. Ripetere la stessa procedura sul emisfero sinistro per rimuovere l'ippocampo sinistro.
  12. Usando una micro spatola, trasferire accuratamente l'ippocampo alla fase chopper tessuti. Disporre loro adiacenti e parallele fra loro e perpendicolari all'asse della lama chopper. Utilizzare un pennello per posizionare il tessuto e aggiungere qualche goccia della soluzione dissezione sulla parte superiore del ippocampi.
  13. Tagliare il tessuto in 400 micron fette senza pause per rimuovere singole fette (di solito non si atterranno alla lama). Dopo tutto ippocampo è stato tagliato, utilizzare il pennello per trasferire delicatamente le sezioni per un piccolo piatto ° 2 Petri con una soluzione dissezione.
  14. Sotto annuncioissecting microscopio, separare accuratamente le fette galleggianti con amicro-spatola e pennello.
  15. Rimuovere la piastra di coltura pre-preparati con inserto cultura dal termostato e posto in una cappa a flusso laminare.
  16. Usando una pipetta Pasteur fuoco lucido, disegnare 4-5 fette nelle fette pipetta e trasferire alla superficie apicale della membrana inserto cultura. Quindi, regolare il posizionamento con un pennello e lasciare uno spazio tra le singole sezioni e il bordo dell'inserto cultura.
  17. Usando una pipetta Pasteur sterile, rimuovere la soluzione dissezione in eccesso dalla superficie apicale di membrana.
    NOTA: Durante la rimozione soluzione evitare di tracciare sezioni di tessuto nella pipetta. In alternativa, utilizzare una pipetta regolare (P200 o P1000), con punte per pipette sterilizzate per rimuovere lentamente soluzione.
  18. Posizionare la piastra di coltura con siero contenente terreno di coltura e le fettine di ippocampo posteriore in incubatore a 35 ° C e 5% di CO 2.
    NOTA: Se le chiamate esperimentoper la generazione di colture da più animali, pulire accuratamente il banco pulito flusso laminare tra dissezioni. Strumenti Torna a soluzione alcolica e sostituire tutti Petri-piatti, filtri di carta e lame di rasoio sterile prima della seconda dissezione.

4. Alimentazione e Mantenimento Organotipica Slices

  1. Culture mangimi in un banco pulito flusso laminare sterile.
  2. Eseguire la prima alimentazione delle sezioni coltivate due giorni dopo la dissezione. Aspirare il terreno vecchia cultura usando pipetta di vetro sterilizzati.
  3. Utilizzare sterile 5 ml pipetta sierologica aggiungere 1 ml di fresco sterili, medium, il siero contenente ai pozzetti.
  4. Sostituire delicatamente l'inserto cultura e prendersi cura di eliminare eventuali bolle d'aria che possono essersi formate sotto la superficie della membrana.
  5. Dopo la prima alimentazione, cambiare media ogni altro giorno.

5. incubazione fette di tessuto con timidina Analoghi etichettare Newborn Neuroni

  1. Per studiarela maturazione e l'integrazione dei granuli dentato dell'ippocampo, incubare le fette organotipiche con un analogo della timidina, come ad esempio Bromodeossiuridina (BrdU) o Chlorodeoxyuridine (CldU). Qui, usiamo CldU causa della sua elevata solubilità in soluzione salina.
  2. Dopo 3DIV, aggiungere 1 ml di 10 mg / ml soluzione madre CldU in soluzione fisiologica a 1 ml di terreno di coltura per una concentrazione finale di 10 mg / ml. Se viene utilizzato BrdU, correggere la concentrazione delle differenze di peso molecolare. Aggiungere mezzo con CldU ai pozzetti cultura e incubare il tessuto con CldU contenenti media per 2 ore a 35 ° C.
  3. Dopo 2 h di incubazione a 35 ° C, rimuovere il terreno contenente CldU e sostituirlo con il mezzo d'alimentazione normale per riprendere programma di alimentazione normale (descritto sopra).

6. I tessuti Fissazione e bagagli

  1. Stabilire un calendario per l'applicazione di trattamenti e fissaggio campioni di tessuto prima di avviare esperimenti di coltura (Figura 2b).
  2. A un giorno prestabilito post-dissezione, preparare quanto segue in una cappa di laboratorio: un bicchiere 10-50 ml contenente 4% paraformaldeide (PFA) in tampone fosfato (PBS); un bicchiere vuoto per mezzo di coltura scartato; pinzetta; e una pipetta 1000 ml con punte monouso.
  3. Rimuovere la piastra di coltura (s) dalla camera di incubazione e trasferimento in una cappa aspirante. Inclinare singoli inserti piastre e con una pinza. Successivamente, utilizzare una pipetta per rimuovere terreno di coltura e trasferirla in un bicchiere di smaltimento. Inclinare la piastra di coltura con un angolo per contribuire a garantire che tutti i medium di coltura viene rimosso.
  4. Termina rimozione mezzo per una piastra di coltura per volta. Quando medio è stato rimosso, aggiungere 1 ml di 4% PFA per ogni cultura bene e sigillare bene piatto con parafilm. Ripetere l'operazione per il maggior numero di piastre di coltura come piatti necessari e trasferimento in frigorifero a 4 ° C per 24 ore.
  5. Dopo 24 ore, di preparare le seguenti in una cappa aspirante: 10-50 bicchiere ml contenente 0,1% di sodio azide in PBS; un vuotobecher per scartato PFA (seguire le precauzioni di sicurezza quando scartando sostanze tossiche); pinzetta; e 1.000 ml pipetta con punte monouso.
  6. Seguire la procedura descritta in 6.4 per l'aggiunta di PFA, ma aggiungere 1 ml di PBS con sodio azide invece. Una volta completamente trasferita, piastre di tenuta e per un utilizzo futuro avvolgendo bordi in parafilm e conservare in frigorifero a 4 ° C.

7. sezionamento del tessuto per immunoistochimica

  1. Eseguire il tessuto sezionamento con un vibratome. La seguente serie di passi aiutano a massimizzare la resa di sezioni di tessuto utilizzabili da colture organotipiche.
    NOTA: Immediatamente dopo dissezione dell'ippocampo e placcatura di fette, il tessuto ha uno spessore di circa 400 micron. Tuttavia, dopo 2-3 settimane nella camera di incubazione, fette di tessuto inizieranno ad appiattirsi, causando uno spessore sezione finale di 150-300 micron.
  2. Preparare le seguenti voci alla sezione di tessuto coltivato: una # 11 bisturi blade e gestire, una piastra di Petri di vetro contenente ghiaccio freddo PBS, un micro-dissezione forcipe, e una fase di taglio vibratome pulito per montare il tessuto.
  3. Utilizzare un bisturi per tagliare attentamente lungo il perimetro della membrana inserto circolare in modo che possa essere staccato dalla custodia inserto in plastica. Lasciare ampio spazio tra la fetta colta e il bisturi.
  4. Trasferire la membrana inserto distaccato di una piastra di Petri contenente PBS. Dopo lavaggio in PBS, utilizzare pinze per trasferire la membrana alla fase di montaggio vibratome.
  5. Quindi, utilizzare il bisturi per eliminare l'eccesso di membrana che circonda le fette in coltura e tagliare il materiale in eccesso per creare bordi puliti. Questo passaggio garantirà la membrana è piana e può facilmente aderire alla superficie di taglio.
  6. Mettere 1-2 gocce di colla sul palco taglio vibratome e diffondere in strato uniforme con un ago 22 G. Distribuire adesivo in una forma rettangolare, con il lato lungo parallelo alla lama di taglio del vibratome. Eseguire questo passaggiorapidamente, per evitare che l'adesivo si secchi.
  7. Utilizzare pinze per trasferire la membrana rifilato contenente fettine di ippocampo per la fase di taglio e delicatamente posizionare la membrana sulla colla e assicurarsi che non vi siano bolle d'aria.
  8. Come la supercolla asciuga, trasferire il palco vibratome con la membrana incollato torna alla piastra di Petri contenente PBS. Preparare la lama vibratome e 48 pozzetti contenente azide di sodio per memorizzare sezioni di tessuto.
  9. Utilizzare il vibratome di generare 30 micron sezioni del tessuto fetta organotipica e trasferimento in un 48 pozzetti contenente sodio azide per lo stoccaggio e la successiva colorazione immunoistochimica.
  10. Fare riferimento alle pre-esistenti protocolli per la colorazione immunoistochimica 26,29.

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Risultati

Determinare se colture organotipiche sarebbe adatto per la ricerca neurogenesi adulta richieste che soddisfano due criteri principali: 1) che le fette di mantenere le peculiari caratteristiche morfologiche delle fettine di ippocampo dopo 10-21 giorni in vitro (DIV), e 2) che DGCS neonati possono essere quantificati utilizzando tecniche di immunoistochimica standard, comunemente impiegati nella ricerca neurogenesi adulta. Per quanto riguarda il primo criterio, Figure 1A e 1B evi...

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Discussione

Dopo CldU (o BrdU) amministrazione, la linea temporale di applicazione di agenti farmacologici può essere scelto a bersaglio DGCS neonato durante particolari finestre di sviluppo. Ad esempio, un agente ipotetico può essere applicato durante la seconda settimana post-iniezione CldU, che si propone di coincidere con l'età di neuroni immaturi che sono in fase di sviluppo in cui viene depolarizzante GABA. Futuri studi che utilizzano questo protocollo potrebbe adattare l'agente farmacologico e la finestra di esposizi...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di ricerca MOP 119271 a JMW dal Canadian Institute of Health Research. Gli autori desiderano ringraziare la signora Yao Fang Tan per la sua eccezionale assistenza tecnica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
5-cloro-2'-deossiuridina (CldU)MP Biomedicals105478cancerogeni
Inserti per colture cellulari, diametro 30 mm, 0,4 &; m dimensione dei poriThermo scientific Il rivestimento 140660Nuclon delta su questi inserti offre una migliore adesione dei tessuti e migliora la qualità della fetta.
Provette da centrifuga coniche (sterili)Fisher Scientific14-432-22
Forbici per dissettore (angolate lateralmente)Strumenti perscienza fine 14082-09
Mezzo minimo essenziale (MEM)Gibco11095; liquidoConservare a 4 gradi C
Eclipse Ni-U microscopio fluorescenteColla Nikon
per tessutiKrazy GlueKG585Utilizzare una quantità minima di colla per ottenere l'adesione, poiché qualsiasi tessuto esposto alla colla sarà inutilizzabile per IHC.
Hank' s Soluzione salina bilanciata (HBSS) (500 ml)Gibco14025-092Conservare a 4 gradi; C
Siero di Cavallo Inattivato a Caldo (500 ml)Gibco16050-122Preparare 50 ml di aliquote e conservare a -20 ° C
KimwipesKimberly-ClarkeTW 31KYPBX
Pipette in vetro modificato (fondo della pipetta Pasteur rimosso e bordo levigato con fiamma Bunsen)
Piastra di Petri (100 mm x 15 mm) e (60 mm x 15 mm)Fisher BrandFB0875712 e FB0875713A
lame per bisturi #11Fine Science Tools10011-00
Manico per bisturi #3Fine Strumenti scientifici10003-12
Pipette sierologicheSorfa Medical Plastic Co.P8050
Pinze standardFine Science Tools11000-12
Filtro sterile per vuotoThermo-Scientific565-0020
Forbici chirurgicheFine Science Tools14054-13
Unità filtrante azionata da siringaMillipore-MillexSLGP033RS
Tritatessuti con tavolino mobileStoelting& nbsp;51425
Pennello
Pericolosi, la a punta fine

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