Qui si descrive una tecnica per lo studio dell'ippocampo la neurogenesi postnatale utilizzando la tecnica organotipica cultura fetta. Questo metodo permette la manipolazione in vitro di neurogenesi adulta e permette l'applicazione diretta di agenti farmacologici per l'ippocampo in coltura.
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Articolo metodologico
Colture organotipiche Slice di studi di post-natale neurogenesi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Qui si descrive una tecnica per lo studio dell'ippocampo la neurogenesi postnatale nel cervello dei roditori utilizzando la tecnica organotipica cultura fetta. Questo metodo mantiene la morfologia caratteristica topografica dell'ippocampo pur consentendo l'applicazione diretta di agenti farmacologici per le sviluppo giro dentato dell'ippocampo. Inoltre, culture fetta possono essere mantenuti fino a 4 settimane e, quindi, permettono di studiare il processo di maturazione dei neuroni granulari neonati. Culture fetta consentono efficace manipolazione farmacologica di fettine ippocampali escludendo variabili complesse quali incertezze relative alla posizione anatomica profonda dell'ippocampo e la barriera ematoencefalica. Per queste ragioni, abbiamo cercato di ottimizzare culture fetta organotipiche specificamente per la ricerca neurogenesi postnatale.
Introduzione
La neurogenesi adulta nell'ippocampo dei mammiferi rappresenta un notevole esempio della capacità innata del cervello di adattabilità e plasticità. Le cellule granulari dentate (DGC) sono generate da un pool rinnovabile di cellule progenitrici neurali nel giro dentato dell'ippocampo, che è una delle due regioni neurogeniche attualmente ben caratterizzate nel cervello dei mammiferi, e si ritiene che sia particolarmente importante per l'apprendimento e la memoria. L'ippocampo fa parte del sistema limbico e ha una posizione profonda all'interno del cervello dei mammiferi, il che lo rende un bersaglio difficile per una precisa manipolazione farmacologica. Inoltre, la neur....
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Protocollo
NOTA: Tutte le procedure sugli animali conformi alle linee guida per la salute e il benessere degli animali del Dipartimento di Medicina comparata presso l'Università di Toronto.
1. Preparazione di fettine di ippocampo
- Sterilizzare i seguenti strumenti che utilizzano l'autoclave secco a 125 ° C: manico bisturi (# 3) (2), pinze modello standard, di grandi dimensioni (1), Piccolo dissettore forbice (angolato a lato) (1), Micro cucchiaio (cucchiaio e piatto estremità spatola) (1), Micro-spatole (arrotondati e arrotondati estremità rastremate) (2), pennello fine (1), Fuoco lucidato pipetta Pasteur (2), le piazze garza, 2 x ....
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Risultati
Determinare se colture organotipiche sarebbe adatto per la ricerca neurogenesi adulta richieste che soddisfano due criteri principali: 1) che le fette di mantenere le peculiari caratteristiche morfologiche delle fettine di ippocampo dopo 10-21 giorni in vitro (DIV), e 2) che DGCS neonati possono essere quantificati utilizzando tecniche di immunoistochimica standard, comunemente impiegati nella ricerca neurogenesi adulta. Per quanto riguarda il primo criterio, Figure 1A e 1B evi.......
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Discussione
Dopo CldU (o BrdU) amministrazione, la linea temporale di applicazione di agenti farmacologici può essere scelto a bersaglio DGCS neonato durante particolari finestre di sviluppo. Ad esempio, un agente ipotetico può essere applicato durante la seconda settimana post-iniezione CldU, che si propone di coincidere con l'età di neuroni immaturi che sono in fase di sviluppo in cui viene depolarizzante GABA. Futuri studi che utilizzano questo protocollo potrebbe adattare l'agente farmacologico e la finestra di esposizi.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di ricerca MOP 119271 a JMW dal Canadian Institute of Health Research. Gli autori desiderano ringraziare la signora Yao Fang Tan per la sua eccezionale assistenza tecnica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5-cloro-2'-deossiuridina (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | cancerogeni |
| Inserti per colture cellulari, diametro 30 mm, 0,4 &; m dimensione dei pori | Thermo scientific | Il rivestimento 140660 | Nuclon delta su questi inserti offre una migliore adesione dei tessuti e migliora la qualità della fetta. |
| Provette da centrifuga coniche (sterili) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Forbici per dissettore (angolate lateralmente)Strumenti per | scienza fine | 14082-09 | |
| Mezzo minimo essenziale (MEM) | Gibco | 11095; liquido | Conservare a 4 gradi C |
| Eclipse Ni-U microscopio fluorescente | Colla Nikon | ||
| per tessuti | Krazy Glue | KG585 | Utilizzare una quantità minima di colla per ottenere l'adesione, poiché qualsiasi tessuto esposto alla colla sarà inutilizzabile per IHC. |
| Hank' s Soluzione salina bilanciata (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Conservare a 4 gradi; C |
| Siero di Cavallo Inattivato a Caldo (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Preparare 50 ml di aliquote e conservare a -20 ° C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Pipette in vetro modificato (fondo della pipetta Pasteur rimosso e bordo levigato con fiamma Bunsen) | |||
| Piastra di Petri (100 mm x 15 mm) e (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 e FB0875713A | |
| lame per bisturi #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Manico per bisturi #3 | Fine Strumenti scientifici | 10003-12 | |
| Pipette sierologiche | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Pinze standard | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Filtro sterile per vuoto | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Forbici chirurgiche | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Unità filtrante azionata da siringa | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tritatessuti con tavolino mobile | Stoelting& nbsp; | 51425 | |
| Pennello |
Riferimenti
- Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D.
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Ristampe e permessi
