Modellazione il ciclo di vita Ebola Virus Sotto livello di biosicurezza 2 condizioni con particelle virus-simili contenenti Tetracistronic Minigenomes

Sommario

Lavora con virus Ebola infettivi è limitato al livello di biosicurezza 4 laboratori. Tetracistronic-minigenome contenente la replicazione e la trascrizione del virus-competente come particelle (trVLPs) rappresentano un sistema di modellazione del ciclo di vita che ci permette di modellare in modo sicuro più cicli infettivi sotto livello di biosicurezza 2 condizioni, basandosi esclusivamente sulle componenti del virus Ebola.

Abstract

Virus Ebola causano gravi febbri emorragiche nell'uomo e nei primati non umani, con casi di tassi di mortalità fino al 90%. Non esistono vaccini autorizzati o trattamenti specifici per la malattia causata da questi virus, e lavorare con virus Ebola infettivi è limitato al livello di biosicurezza 4 laboratori, limitando notevolmente la ricerca su questi virus. Sistemi di modellazione del ciclo di vita del modello del ciclo di vita del virus sotto il livello di biosicurezza 2 condizioni; Tuttavia, fino a poco tempo tali sistemi si sono limitati a entrambi i singoli aspetti del ciclo di vita del virus, o un singolo ciclo infettivo. Minigenomes Tetracistronic, che consistono di virus Ebola regioni non codificanti, un gene reporter, e tre geni del virus Ebola coinvolti nella morfogenesi, erba, e l'entrata (VP40, GP _1,2, e VP24), possono essere utilizzati per produrre la replicazione e la trascrizione -competent particelle virus-simili (trVLPs) contengono queste minigenomes. Questi trVLPs possono continuamente infettare le cellule che esprimono l'Ebolaproteine ​​responsabili per la replicazione del genoma e la trascrizione, che ci permette di modellare in modo sicuro più cicli infettivi sotto livello di biosicurezza 2 Condizioni di virus. È importante sottolineare che i componenti virali di questo sistema sono esclusivamente derivati ​​da virus Ebola e non da altri virus (come, per esempio, il caso in sistemi che utilizzano virus pseudotyped) e VP40, GP _1,2 e VP24 non sono iperespresso in questo sistema , il che rende l'ideale per studiare la morfogenesi, in erba e l'ingresso, anche se altri aspetti del ciclo di vita del virus, come la replicazione e la trascrizione del genoma possono essere modellati con questo sistema. Pertanto, il dosaggio trVLP tetracistronic rappresenta il sistema di modellazione del ciclo di vita più completo disponibile per i virus Ebola, e ha un enorme potenziale per l'uso nelle indagini sulla biologia dei virus Ebola in futuro. Qui, fornendo informazioni dettagliate sull'uso di questo sistema, nonché sui risultati attesi.

Introduzione

Virus Ebola sono l'agente eziologico di una grave febbre emorragica nell'uomo e nei primati non umani con tassi caso di mortalità fino al 90% in epidemie umane ^1. Mentre ci sono stati progressi significativi negli ultimi anni nello sviluppo di vaccini e trattamenti specifici (recensiti ^2,3), questi non sono approvati per uso umano. Particelle del virus Ebola hanno un caratteristico aspetto filiforme con una lunghezza di circa 1 micron e un diametro di 96-98 nm ^4. Si forma un nucleocapside il nucleo delle particelle virali e composto da 1) il non-segmentato genoma RNA a singolo filamento negativo-senso, che codifica i geni 7 Ebolavirus (Figura 1), 2) la nucleoproteina NP, che encapsidates il genoma, 3 ) il complesso polimerasi virale costituito dalla polimerasi L e VP35 suo cofattore, e 4) l'attivatore trascrizionale VP30. Inoltre, è stato recentemente dimostrato che la proteina VP24 è anche associato con nucleocapsides ^4. Il nucleocapside è circondato dallo spazio matrice in cui la proteina di matrice VP40, che è responsabile per la morfogenesi e la gemmazione dei virioni, si trova. Particelle virali sono ulteriormente avvolti, e inclusi in quella busta è l'unica proteina di superficie GP _1,2, che è responsabile per il fissaggio virione e voce.

Lavora con virus Ebola infettivi deve essere eseguita in un laboratorio di massimo contenimento sotto livello di biosicurezza (BSL) 4 condizioni, che limita questo lavoro per un paio di strutture in tutto il mondo. Al fine di studiare la biologia di questi virus o per sviluppare nuove terapie in condizioni BSL2, i ricercatori si basano sia su iperespressione delle proteine ​​ricombinanti del virus Ebola, o sui sistemi di modellazione del ciclo di vita, entrambi i quali possono essere lavorato con in assenza di virus Ebola infettivo. Espressione ricombinante di proteine ​​del virus Ebola si sia raggiunta da plasmidi di espressione o vettori virali. Un caso particolare di questa strategia è ilgenerazione di virioni o particelle virus-simili sulla base di virus diversi dal virus Ebola (più comunemente retrovirus o stomatite vescicolare virus) in presenza di ricombinante espresso GP _1,2, che porta alla generazione di particelle pseudotyped, che può essere utilizzato per studiare il processo di inserimento di filovirus e schermo per gli inibitori di ingresso ^5. In alternativa, i virus ricombinanti (ad esempio, virus della stomatite vescicolare) che codificano il virus Ebola GP _1,2 invece del loro glicoproteina possono essere generati e utilizzati per lo studio entry virus sotto livello di biosicurezza 2 Condizioni di ^6.

Sistemi di modellazione del ciclo di vita sono forme di sistemi di genetica inversa che caratterizzano l'uso di analoghi troncati genoma del virus Ebola (minigenomes), che vengono inizialmente prodotti a partire da cDNA e poi replicati e trascritti da proteine ​​del virus Ebola fornite in trans. Il primo sistema minigenome per il virus Ebola è stato sviluppato più di 15 anni fa ⁷, E da allora è stato utilizzato per lo studio del genoma replicazione e la trascrizione (rivisto in ^8,9), il virus Ebola. In questo sistema un minigenome monocistronic costituito da un singolo gene reporter affiancato dal terminale regioni non codificanti del genoma del virus Ebola (chiamato il capo e rimorchio) (Figura 1) è espresso in cellule di mammifero (solitamente mediante trascrizione utilizzando T7 RNA polimerasi) insieme con le proteine ​​virali L, VP35, VP30 e NP. Il minigenome è encapsidated da NP, e poi replicato e trascritto dalle altre proteine ​​del nucleocapside che utilizzano segnali cis-acting localizzate nel leader e rimorchio, che conduce all'attività giornalista che riflette questi due aspetti del ciclo di vita del virus (Figura 2).

Al fine di modellare ulteriori passaggi del ciclo di vita virale, la trascrizione e la replicazione-competenti particelle virus-simili sistemi (trVLP) sono stati sviluppati, che si basano su sistemi minigenome classici, ma presentano l'unaespressione ltre delle altre proteine ​​virali VP24, VP40 e GP _1,2 da plasmidi di espressione ^10,11. La presenza di VP40 porta alla formazione di trVLPs, recanti GP _1,2 sulla loro superficie, e portare un nucleocapside-minigenome contenente al suo interno. Questi trVLPs possono essere utilizzati per infettare cellule bersaglio, che sono stati o pretransfected con plasmidi di espressione per L, VP35, VP30 e NP, per facilitare la replicazione e la trascrizione del minigenomes portati nelle cellule bersaglio all'interno trVLPs ^11, o sono cellule bersaglio naive (cioè senza espressione plasmide-driven delle proteine ​​del virus Ebola) ^10. Ciò si traduce in attività di giornalista nelle cellule bersaglio, che riflette la replica dei minigenomes nelle cellule produttori, morfogenesi e la gemmazione di trVLPs, loro entrata in cellule bersaglio, e 1) nel caso di cellule bersaglio pretransfected anche del genoma replicazione e la trascrizione secondario ( cioè trascrizione di proteine ​​virali produced nelle cellule bersaglio) nelle cellule bersaglio, o 2) nel caso di cellule bersaglio naive anche la trascrizione primaria (cioè trascrizione di proteine ​​virali portati all'interno delle cellule bersaglio entro trVLPs) (Figura 3). È importante sottolineare che questi sistemi sono solo stati utilizzati per modellare un singolo ciclo infettivo, e si basano su sovraespressione di tutte le proteine ​​virali, che nel caso di VP24 e VP40 è particolarmente problematico, dal momento che queste proteine ​​hanno dimostrato di essere forti regolatori negativi della replicazione del genoma e la trascrizione quando sovraespresso da plasmidi ^12,13. Inoltre, le preparazioni trVLP prodotte in questi sistemi contengono un'alta percentuale di particelle non infettive, ponendo sfide per l'analisi biochimica di trVLPs infettive ^14.

Per superare questi problemi, abbiamo recentemente sviluppato un sistema minigenome tetracistronic che, oltre ad un gene reporter, contiene anche i geni che codificano per VP40, GP _1,2 eVP24 (Figura 1). Simile al sistema minigenome monocistronic classico, questo sistema porta alla produzione di trVLPs che possono infettare cellule bersaglio (Figura 4) ^15. Tuttavia, a differenza del sistema minigenome classica, VP40, GP _1,2, e VP24 sono prodotte dopo genoma virale trascrizione piuttosto che essere sovraespresso da plasmidi. Come risultato, la cinetica ei livelli di espressione di queste proteine ​​molto più strettamente imitano quelli trovati durante il ciclo di vita virale, e di conseguenza il rapporto di infettivi per trVLPs non infettive è aumentata di circa 500 volte in questo sistema ^15. Inoltre, con questo sistema è stato possibile continuo passaggio tetracistronic trVLPs-minigenome contenenti, modellando molteplici cicli infettivi. Come tale, trVLPs tetracistronic sono attualmente il sistema di modellazione del ciclo di vita più completo a disposizione per studiare la biologia del virus Ebola in condizioni BSL2. Qui, fornendo informazioni dettagliate sull'utilizzo of tale sistema, nonché sui risultati attesi.

Protocollo

1 Divisione di celle di produttori per la produzione iniziale di trVLPs

1. Rimuovere media 80-90% confluenti 293 cellule coltivate in 75 centimetri ² palloni in alta-glucosio modificato mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM L-glutammina, e 1x pen / strep (DMEM10 ). Lavare le cellule due volte con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), facendo attenzione a non staccare le cellule, e aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA alle cellule.
2. Incubare le cellule a temperatura ambiente fino a quando le cellule mostrano una significativa arrotondamento quando osservate al microscopio (circa 30 sec). Staccare le cellule toccando fiasco, e aggiungere 8 ml DMEM10. Risospendere accuratamente le cellule pipettando gentilmente su e giù fino a una sospensione singola cellula si osserva se visto al microscopio.
3. Contare le cellule utilizzando un contatore automatico di cellule. Diluire le cellule a 2 x 10 ⁵ cellule per ml in DMEM10. Pipettare 2 ml di sospensione cellulare per pozzetto in piastre da 6 pozzetti (4 x 105 cellule per pozzetto).
4. Incubare le piastre in un incubatore umidificato coltura tissutale a 37 ° C con 5% di CO _2.

2 Trasfezione delle cellule di produttori per la produzione iniziale di trVLPs

1. 24 ore dopo la divisione delle cellule (vedi Figura 5 per una panoramica della tempistica dell'esperimento), pipetta DNA plasmidico ¹⁵ (per importi vedi Tabella 1) in una sterile 2 ml esageratamente con punte filtrati. Aggiungere 100 microlitri OptiMEM per bene al DNA. Agitare la miscela brevemente e delicatamente centrifugare i tubi con una microcentrifuga. Se più pozzi devono essere trasfettate con plasmidi identiche, una mastermix per diversi pozzi può essere fatta.
2. Agitare brevemente su vortex la fiala con Transit LT1 prima dell'uso. Aggiungere 7,5 ml di transito LT1 per bene al DNA diluito. Vortice delicatamente la miscela, facendo attenzione a non raccogliere il liquido nel coperchio del esageratamente, e incubare per 15 min a temperatura ambiente.
3. Mescolare delicatamente la trasfezionecomplesso pipettando su e giù. Aggiungere 100 ml di complessi trasfezione goccia a goccia ad ogni pozzetto. Rock the piastra in avanti / indietro e da un lato all'altro per distribuire i complessi trasfezione. Non agitare la piastra come questo causerà irregolare diffusione dei complessi trasfezione.
4. Riportare le cellule per l'incubatrice.
5. Dopo 24 ore, rimuovere il surnatante dalle cellule. Aggiungere 4 ml di DMEM con il 5% FBS, 2 mM L-glutammina, 1x pen / strep (DMEM5) alle cellule. Questo passaggio può essere fatto per 3 pozzetti alla volta senza asciugatura dei pozzetti, assumendo i pozzetti contengono campioni identici (altrimenti, a causa della natura auto-amplificazione dei trVLPs in questo sistema, la contaminazione incrociata può diventare un problema e questo passo dovrebbe essere fatto un pozzetto alla volta).
6. Riportare le cellule per l'incubatrice.

3 Preparazione delle cellule bersaglio

1. Split 293 celle come descritto nella sezione 1, semina 4 x 10 ⁵ cellule in 2 ml DMEM10 per pozzetto di una6 pozzetti.
2. 24 ore dopo la divisione delle cellule bersaglio e 24 ore prima dell'infezione, cellule bersaglio transfect come descritto nella sezione 2 utilizzando il DNA importi nella tabella 1, e 4,5 ml di transito LT1 per pozzetto.

4 L'infezione delle cellule bersaglio e di raccolta di celle Produttore

1. Trasferire il surnatante dalle cellule di produttori di provette da 15 ml. Rimuovere e scartare qualsiasi surnatante residuo utilizzando un tubo di aspirazione. Aggiungere 250 microlitri Glo tampone di lisi per le cellule.
2. Surnatante Centrifugare per 5 minuti a 800 xg e temperatura ambiente per cancellare i campioni di detriti cellulari.
3. Rimuovere il surnatante da un pozzetto delle cellule bersaglio. Aggiungere con cautela 3 ml di surnatante eliminato cella produttore di celle usando la velocità più lenta pipetta bersaglio. Evitare di pipettare direttamente sulle cellule, al fine di non perturbare il monostrato cellulare. Questo passaggio deve essere fatto un pozzetto alla volta.
4. Quando tutti i campioni sono stati transFerred, restituire le cellule bersaglio per l'incubatore per consentire la sedimentazione di trVLPs e l'infezione delle cellule bersaglio.
5. Dopo 15 min di incubazione a temperatura ambiente nel tampone di lisi Glo, risospendere le cellule di produttori nel tampone di lisi con una micropipetta impostata su 150 microlitri, e trasferire il campione in un 2 ml esageratamente. A questo punto, lisati possono essere congelati a -80 ° C, o direttamente misurati come descritto nella sezione 6.
6. 24 ore dopo l'infezione, rimuovere il surnatante dalle cellule bersaglio. Aggiungere 4 ml per pozzetto DMEM5 alle cellule. Questo passaggio può essere fatto per un massimo di tre pozzi alla volta, se i pozzetti contengono campioni identici (altrimenti, a causa della natura auto-amplificazione dei trVLPs in questo sistema, la contaminazione incrociata può diventare un problema, e questo passo dovrebbe essere svolto un pozzetto alla volta).

5 Raccolta di cellule bersaglio per una infezione Ciclo Unico

1. Se solo dovrebbe essere valutato un solo ciclo infettivo, a 72 ore dopo l'infezione rimuovi tegli surnatante dalle cellule bersaglio utilizzando un tubo di aspirazione.
2. Raccogliere le cellule in 250 microlitri Glo tampone di lisi, come descritto nella sezione 4 per le cellule dei produttori.

6. Harvest di colpire le cellule e Passaging continuo di trVLPs

1. Se trVLPs devono essere fatte passare continuamente, preparare una nuova serie di cellule bersaglio come descritto nel capitolo 3, in modo che siano pronti per l'infezione da 72 ore dopo l'infezione della prima serie di cellule bersaglio (vedi Figura 5).
2. Infect la nuova serie di cellule bersaglio come descritto nella sezione 4 (utilizzando la prima serie di cellule bersaglio in luogo delle cellule di produttori).
3. Ripetere questi passaggi ogni 72 ore.

7 Analisi di Reporter attività

1. Se sono stati congelati lisati cellulari, li scongelare a temperatura ambiente. Assicurarsi che i campioni hanno raggiunto la temperatura ambiente prima della misura.
2. Scongelare la quantità richiesta (40 microlitri per campione) di tampone Renilla Glo (i idealmente congelatin aliquote) a temperatura ambiente. Assicurarsi che il buffer ha raggiunto la temperatura ambiente prima della misura.
3. Aggiungi ^1/100 volume di substrato Renilla Glo al tampone Renilla Glo per ottenere Renilla Glo reagente, e mescolare nel vortex. Pipettare 40 ml di reagente Renilla Glo in una piastra a 96 pozzetti bianco.
4. Aggiungere 40 ml di campione al reattivo Renilla-Glo. Attendere 10 minuti, quindi misurare i campioni in un luminometro con un tempo di integrazione di 1 sec.

Risultati

Trasfezione di cellule 293 produttori con plasmidi di espressione che codifica le proteine ​​del virus Ebola nucleocapside NP, VP35, VP30, e L, un minigenome tetracistronic e gli accessori T7 polimerasi risultati in minigenome la replicazione e la trascrizione e l'attività giornalista che è facilmente rilevabile a 72 ore (Figura 6 ). È importante sottolineare che l'attività di giornalista ha osservato (10 ^5,6 unità di luminescenza relativa (RLU)) supera quello di un controllo negativo in cui l'espressione plasmide codifica L è stato omesso dalla trasfezione (10 ³ RLU) da più di 2 registri. Il basso livello di attività osservata anche in assenza di L è molto probabilmente dovuto ad un promotore criptico nel plasmide minigenome. Le cellule bersaglio infettate con trVLPs dal supernatante di cellule di produttori effettivamente mostrano alquanto aumentati livelli di attività giornalista rispetto alle cellule di produttori, e raggiungono valori tra 10 ⁶ e 10 ⁷ RLU, a seconda del passaggio. Al contrario, wuando il surnatante delle cellule di produttori di controllo -L è diversi passaggi su cellule bersaglio (che esprimono tutte le proteine ​​del nucleocapside, tra cui L), attività di giornalista non supera il rumore del luminometro (circa 10 ² RLU) di sfondo.

Il test trVLP tetracistronic può essere utilizzato per studiare il ciclo di vita del virus Ebola. Per esempio, infezione di cellule 293 con trVLPs dipende dalla presenza di fattori di attaccamento come Tim-1 ^16, che deve essere fornita in trans in queste cellule. Di conseguenza, in un saggio trVLP tetracistronic un calo dell'attività giornalista nelle cellule bersaglio di circa 100 volte è osservata in assenza di Tim-1 (Figura 7A). Il ruolo delle proteine ​​specifiche (virali o cellulari) nel ciclo di vita del virus può anche essere valutata utilizzando la tecnologia RNAi insieme con questo approccio. A titolo di esempio, RNAi-mediata down-regulation dei risultati L in un calo dell'attività giornalista di circa 100 volte, riflettendo il ruolo centrale di L inla replicazione e la trascrizione (Figura 7B) ^7. Inoltre, è possibile modificare direttamente la minigenome per valutare l'effetto delle mutazioni sul ciclo di vita del virus. Ad esempio, quando VP24-espressione del minigenome è abolita con l'introduzione di 3 codoni di stop immediatamente a valle del codone di inizio, l'attività giornalista in cellule di produttori non è radicalmente cambiata; Tuttavia, l'attività reporter cellule bersaglio si riduce di circa 20 volte dopo un passaggio, e 400 volte dopo due passaggi, indicando un ruolo di VP24 nella produzione di trVLPs infettive (Figura 7C) ^15.

Figura 1 Struttura del genoma del virus Ebola, nonché minigenomes monocistronic e tetracistronic. Regioni codificanti per la proteina del virus Ebola sono mostrati in rosso (NP,VP35, VP30, e L), giallo (VP40 e VP24) o blu _(1,2 cassette GP). Regioni non codificanti (NCR) sono mostrati in verde, con le regioni e leader del rimorchio indicati. Il pedice indica che NCR virale è stato usato per unire le regioni codificanti. La regione codificante per il reporter (rep) è mostrato in viola.

Figura 2 Monocistronic test minigenome. Cellule vengono trasfettate con plasmidi di espressione per le proteine ​​del nucleocapside del virus Ebola (NP, VP35, VP30, L), un minigenome monocistronic (mg) e la polimerasi T7. Il minigenome è inizialmente trascritto dalla polimerasi T7 (a) in un RNA minigenome unencapsidated nello stesso orientamento del genoma virale (vRNA), che viene poi encapsidated da NP (b). Questo encapsidated vRNA viene replicato tramite un RNA minigenome complementare (cRNA) intermediata (c), e poi trascritto in mRNA Reporter (d) che vengono tradotti in proteine ​​giornalista (e).

Figura 3 trVLP test con un minigenome monocistronic. Cellule vengono trasfettate con plasmidi di espressione per i componenti del dosaggio minigenome (i virus di Ebola nucleocapside proteine ​​NP, VP35, VP30, L, una minigenome monocistronic e la polimerasi T7) e VP40, GP _{1 , 2} e VP24. Ciò porta alla formazione di trVLPs che incorporano nucleocapsidi-minigenome contenente (f). Questi trVLPs possono poi infettare le cellule bersaglio (g), che sono o pretransfected con plasmidi di espressione per NP, VP35, VP30, e L (in alto), con conseguente replicazione e trascrizione secondario (d) conduce all'espressione giornalista (e), o ingenuo cellule bersaglio (in basso), con conseguente trascrizione primaria del minigenomes (h), che può consentire di espressione giornalista (e).

Figura 4 trVLP test con un minigenome tetracistronic. Cellule vengono trasfettate con plasmidi di espressione per le proteine ​​del nucleocapside del virus Ebola (NP, VP35, VP30, L), un minigenome tetracistronic (mg) e la polimerasi T7. Trascrizione iniziale (a), incapsidazione (b), la replicazione del genoma (c) e la trascrizione (d) e traduzione (e) verificarsi in un test minigenome monocistronic. Tuttavia, oltre al giornalista mRNA, mRNA per VP40, GP _1,2 e VP24 sono anche trascritto dal minigenome tetracistronic, causando la formazione di trVLPs (f). Queste trVLPs infettare le cellule bersaglio che sono state pretransfected con plasmidi di espressione per le proteine ​​del nucleocapside NP, VP35, VP30 e L, così come il virus Ebola cellulareFattore attaccamento Tim-1, con conseguente replicazione del genoma e trascrizione, e la produzione di trVLPs che possono essere utilizzati per infettare cellule bersaglio freschi.

Figura 5 Timing di un test trVLP tetracistronic per 3 passaggi consecutivi. I giorni di semina cellule (s), trasfezione le cellule (t), infettare le cellule (i), cambiamento medio (c) e la raccolta delle cellule e trVLPs (h) sono indicato per tre passaggi consecutivi (indicato dalle frecce).

Figura 6 tipici livelli di attività giornalista osservata in un test di trVLP tetracistronic. Un test trVLP tetracistronic è stata effettuata più di 5 passaggi a seguito del protocolo delineato in questo manoscritto. Come controllo negativo l'espressione plasmide codifica L è stato omesso (-L) dalla trasfezione delle cellule di produttori p0. Cellule bersaglio in passaggi da P1 a P5 sono state trasfettate con plasmidi di espressione per tutte le proteine ​​del nucleocapside, tra cui L. Il rumore del luminometro fondo è indicato come una linea tratteggiata. Medie e deviazioni standard dei 4 repliche biologiche da 3 esperimenti indipendenti sono mostrati.

Figura 7 Valutare l'impatto di vari fattori virali e cellulari sulla ciclo di vita virale utilizzando trVLPs tetracistronic. (A) Tim-1 come fattore allegato. Cellule bersaglio che sono stati pretransfected con plasmidi di espressione che codificano per le proteine ​​del nucleocapside e con o senza un plasmide codificante per Tim-1 (descritto in ¹⁵⁾ sono stati infettati con tettrVLPs racistronic. 72 ore dopo l'infezione attività di giornalista nelle cellule bersaglio P1 è stato determinato. Medie e deviazioni standard delle 4 repliche biologiche da 4 esperimenti indipendenti sono mostrati. (B) Effetto di RNAi atterramento di L sulla replicazione e la trascrizione del genoma. Cellule bersaglio che sono stati pretransfected con plasmidi di espressione per i componenti nucleocapside, Tim-1 e miRNA diretti contro L (anti-L) o una proteina estranea (anti-GFP) (descritto in ¹⁵⁾ sono stati infettati con trVLPs tetracistronic. 72 ore dopo l'infezione attività di giornalista nelle cellule bersaglio P1 è stato determinato. Medie e deviazioni standard delle 5 repliche biologiche da 2 esperimenti indipendenti sono mostrati. (C) Effetto di mutazioni nel minigenome su trVLP infettività. Un test trVLP tetracistronic è stata eseguita utilizzando una wild-type minigenome (4cis-WT) o un minigenome in cui 3 codoni di stop erano state introdotte subito dopo il codone di inizio di VP24, abolire o esprimendof questa proteina ma introduce solo modifiche minime al minigenome in quanto riguarda la lunghezza, composizione in acidi nucleici, strutture secondarie ecc attività Reporter in p0, p1 e p2 è stata misurata 72 ore dopo la trasfezione / infezione. Mezzi e deviazioni standard di 3 repliche biologiche da 3 esperimenti indipendenti sono mostrati.

	Celle di produttori (P0)	Le cellule bersaglio (p1 e superiori)
pCAGGS-NP	125	125
pCAGGS-VP35	125	125
pCAGGS-VP30	75	75
pCAGGS-L	1.000	1.000
p4cis-vRNA-RLuc	250	-
pCAGGS-T7	250	-
pCAGGS-TIM1	-	250

Tabella 1 DNA ammonta per la trasfezione. La quantità di ciascun plasmide richiesto per la trasfezione di cellule di produttori e bersaglio è mostrata in ng per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Tutti i plasmidi sono descritti in Watt et al ^15.

Discussione

Il test trVLP tetracistronic descritto in questo manoscritto permette la modellazione del ciclo di vita del virus Ebola su più cicli infettivi. È importante sottolineare che le trVLPs prodotte in questo sistema non contengono le informazioni genetiche per le proteine ​​del nucleocapside NP, VP35, VP30, e L, che insieme costituiscono quasi il 60% del genoma del virus Ebola e sono essenziali per la replicazione virale. Piuttosto, queste proteine ​​devono essere fornite in cellule bersaglio in trans da plasmidi di espressione, e qualsiasi infezione delle cellule non esprimono tutti e 4 di queste proteine ​​è abortivo. È importante sottolineare che non vi è alcuna evidenza di ricombinazione genetica per filovirus, e non ci sono regioni omologhe condivise tra gli minigenome tetracistronic ed i plasmidi di espressione per le proteine ​​del nucleocapside. Pertanto, non vi è alcuna prova né pratico né alcuna base teorica che potrebbe prevedere la possibilità di generare pieno lunghezza genomi di virus Ebola che potrebbero quindi potenzialmente causarela produzione di virus Ebola infettivi, rendendo questo sistema sicuro per l'uso in condizioni BSL2.

Ci sono due passaggi critici nel test trVLP tetracistronic che sono influenzati dalle condizioni sperimentali, vale a dire la produzione di trVLPs, e l'infezione di cellule bersaglio con questi trVLPs. Produzione di trVLPs dipende da elevati livelli di replicazione minigenome e trascrizione, che a sua volta dipende da una elevata efficacia di trasfezione. Efficacia trasfezione può essere facilmente valutata includendo un controllo -L, in cui è scambiato il plasmide di espressione di L per un'espressione plasmide codificante eGFP. Tassi di trasfezione in queste condizioni dovrebbero superare il 50% mediante ispezione con un microscopio a fluorescenza 24 ore dopo la trasfezione. Inoltre, le cellule devono essere liberi di micoplasmi, poiché nella nostra esperienza di contaminazione da micoplasma altera drasticamente la replicazione e la trascrizione minigenome (dati non pubblicati). Grazie alla loro elevata transfectability 293 cells sono la linea cellulare di scelta per i saggi trVLP; tuttavia, queste cellule sono relativamente poco sensibili (anche se non completamente rifrazione) per infezione da virus Ebola ^16. Espressione di un fattore di attaccamento come Tim-1 aumenta l'infezione di 293 cellule con trVLPs circa 100 volte, ed è cruciale per il successo di questo sistema su più passaggi.

Mentre trVLPs tetracistronic non sono auto-replicante per conto proprio, sono auto-replicante in cellule che esprimono le proteine ​​del nucleocapside. Come tale, le precauzioni devono essere prese per evitare la contaminazione incrociata tra i pozzetti contenenti diverse trVLPs (ad esempio, con differenti mutazioni nel minigenome). Da un punto di vista più tecnico, a causa della grande differenza tra segnali positivi e negativi in ​​questo test (circa 4 log), cross-talk tra i campioni quando si misura l'attività luciferasi può essere un problema; Tuttavia, questo può essere facilmente evitato lasciando un pozzetto vuoto tra ogni campione nellaPiastra a 96 pozzetti utilizzata per misurare l'attività della luciferasi.

Ci sono una moltitudine di possibili applicazioni per trVLPs tetracistronic. Ovviamente, essi sono adatti per studiare l'ingresso di particelle Filovirus, dal momento che trVLPs infettive hanno la tipica struttura filiforme di filovirus infettive ^14, e contengono gli stessi componenti virali come particelle Filovirus. È importante sottolineare che non contengono componenti di altri virus, come è il caso quando si utilizzano virioni pseudotyped o particelle virus-simili, come ad esempio particelle retrovirali recanti GP _1,2, o virus ricombinanti, come il virus della stomatite vescicolare ricombinante che esprime GP _1,2 . Il requisito per fattori di fissaggio utilizzando 293 cellule come cellule bersaglio in questo sistema può essere sfruttata per schermo e per indagare il ruolo di tali fattori di attaccamento, mentre i ruoli di altri fattori cellulari, come quelli coinvolti nella replicazione del genoma e trascrizione nonché morfogenesi e budding, può essere indagato utilizzando la tecnologia RNAi. L'effetto di mutazioni in proteine ​​virali sul ciclo di vita del virus può anche essere studiato, anche se si deve tenere a mente che, mentre VP40, GP _1,2, e VP24 sono espressi dopo la trascrizione virale, espressione delle altre proteine ​​virali si ottiene dall'espressione plasmidi, in modo che gli effetti dovuti alla sovraespressione di queste proteine ​​devono essere presi in considerazione. Inoltre, occorre prestare attenzione che le mutazioni nel minigenome non alterano significativamente la lunghezza della minigenome, in quanto attività di giornalista è direttamente influenzata dalla minigenome lunghezza ^15. Infine, dal momento che minigenomes tetracistronic sono analoghi genoma virale che portano geni virali, e vengono replicati dal complesso polimerasi virale, dovrebbe anche essere possibile studiare l'evoluzione di questi geni in risposta alle mutazioni in condizioni BSL2. Così, mentre ulteriori studi sono ancora necessari in questa direzione, dovrebbe essere possibile, ad esempio, per introdurre subottimalemutazioni nei geni all'interno delle minigenome e poi trVLPs passaggio fino mutazioni gratuiti emergono.

Una limitazione del dosaggio trVLP tetracistronic che deve essere tenuto a mente è il fatto che, mentre i modelli la maggior parte del ciclo di vita del virus, la trascrizione primaria nelle cellule bersaglio non è modellato da questo sistema, dal momento che le cellule bersaglio devono esprimere le proteine ​​del nucleocapside a trans in modo che i trVLPs a replicare. Se la trascrizione primaria deve essere valutato, è possibile utilizzare ingenui cellule bersaglio ^10; tuttavia, in questo caso nessun replicazione del genoma avviene nelle cellule bersaglio, e nessun ulteriore trVLPs infettive vengono prodotti, interrompere l'infezione. Questo è un problema principale che non può essere superato senza rendere le trVLPs completamente auto-replicante, includendo i geni per le proteine ​​del nucleocapside nel minigenome, che di fatto li trasformano in infettive virus Ebola ricombinanti. Infatti, ebolun virus che esprimono luciferasi o altri giornalisti sono stati generati e possono essere utilizzati per valutare e studiare la replicazione del genoma e trascrizione ^17,18; tuttavia, il loro uso è limitato ai laboratori BSL4. Inoltre, deve essere tenuto a mente che, mentre VP40, GP _1,2, e VP24 sono espressi da un analogo genoma virale, la loro posizione nella minigenome (2 ^°, 3 ^° e 4 ^° unità trascrizionale) non è identico a la loro posizione nel genoma virale (3 ^°, 4 ^° e 6 ^° unità trascrizionale), che potrebbe influenzare i loro livelli di espressione assoluti, e anche i loro livelli di espressione relativa l'uno rispetto all'altro.

Nel complesso, il saggio trVLP tetracistronic rappresenta il sistema di modellazione del ciclo di vita più completa per il virus Ebola ad oggi disponibili, e permette la modellazione di replicazione del genoma e la trascrizione, la morfogenesi delle particelle e in erba, così come attaccamento e encercare all'interno delle cellule bersaglio su più cicli infettivi. Come tale, ha un enorme potenziale per l'uso nelle indagini sulla biologia del virus Ebola in condizioni BSL2.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
75 cm2 Pallone per colture cellulari	Corning
DMEM	Sigma	D6546	preriscaldare a 37 gradi C prima dell'uso
FBS	Life Technologies	26140-079	inattivazione del calore 30 min @ 56 ° C
L-Glutammina	Life Technologies	25030-081	100x
Pen/strep	Life Technologies	15070-063	100x
0,25% Tripsina-EDTA	Life Technologies	25200-056
PBS			8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, H2O aggiungere 1 L; autoclavare e conservare a temperatura ambiente
Piastre a 6 pozzetti	Costar	3516
Opti-MEM I	Life Technologies	31985-070
Transit LT1	Mirus	MIR 2300
Tampone di lisi Glo	Promega	E2661
Renilla Glo sistema di saggio della luciferasi	Promega	E2720
Piastra per saggio a 96 pozzetti (bianco)	Costar	3912
Luminometro per micropiastre a modulo	Turner Microsystems	998-9300