Method Article

Correlare DNA Modifiche metilazione gene-specifica con espressione e trascrizionale attività di astrociti KCNJ10 (Kir4.1)

DOI:

10.3791/52406

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September 26th, 2015

 , 
1Department of Cell Developmental and Integrative Biology, University of Alabama at Birmingham

In This Article

Summary

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La metilazione del DNA è in grado di mantenere stabili i livelli di espressione genica e di consentire cambiamenti dinamici nell'espressione genica in risposta a una varietà di stimoli. Descriviamo in dettaglio le tecniche che consentono lo studio dei cambiamenti gene-specifici nella metilazione del DNA e l'effetto di questi cambiamenti sull'espressione genica.

Abstract

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La metilazione del DNA serve a regolare l'espressione genica attraverso l'attaccamento covalente di un gruppo metilico sulla posizione C5 di una citosina in un dinucleotide citosina-guanina. Mentre la metilazione del DNA fornisce cambiamenti duraturi e stabili nell'espressione genica, anche i modelli e i livelli di metilazione del DNA sono soggetti a cambiamenti in base a una varietà di segnali e stimoli. In quanto tale, la metilazione del DNA funziona come un regolatore potente e dinamico dell'espressione genica. Lo studio della neuroepigenetica ha rivelato una varietà di stati fisiologici e patologici che sono associati a cambiamenti sia globali che gene-specifici nella metilazione del DNA. In particolare, esistono sorprendenti correlazioni tra i cambiamenti nell'espressione genica e la metilazione del DNA nei disturbi neuropsichiatrici e neurodegenerativi, durante la plasticità sinaptica e dopo lesioni al SNC. Tuttavia, poiché il campo della neuroepigenetica continua ad espandere la sua comprensione del ruolo della metilazione del DNA nella fisiologia del SNC, è essenziale delineare le relazioni causali per quanto riguarda i cambiamenti nell'espressione genica e nella metilazione del DNA. Inoltre, per quanto riguarda il campo più ampio delle neuroscienze, la presenza di vaste differenze regionali e cellulo-specifiche richiede tecniche che affrontino queste variazioni quando si studiano il trascrittoma, il proteoma e l'epigenoma. Qui descriviamo lo smistamento FACS degli astrociti corticali che consente il successivo esame sia della trascrizione dell'RNA che della metilazione del DNA. Inoltre, descriviamo in dettaglio una tecnica per esaminare la metilazione del DNA, l'analisi del fuso ad alta risoluzione sensibile alla metilazione (MS-HRMA) e un saggio del promotore della luciferasi. Attraverso l'uso di queste tecniche combinate si è in grado non solo di esplorare i cambiamenti correlati tra la metilazione del DNA e l'espressione genica, ma anche di valutare direttamente se i cambiamenti nello stato di metilazione del DNA di una data regione genica sono sufficienti per influenzare l'attività trascrizionale.

Introduction

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L'epigenetica è lo studio delle modificazioni chimiche che possono influenzare l'attività trascrizionale del genoma. Essenzialmente, senza un cambiamento nella sequenza del DNA, le modifiche epigenetiche come la metilazione del DNA, l'acetilazione degli istoni e la metilazione degli istoni sono sufficienti per alterare in modo reversibile i modelli di espressione genica 1. La metilazione del DNA, un potente regolatore dell'espressione genica, è la modificazione epigenetica più caratterizzata. La metilazione del DNA è l'attacco covalente di gruppi metilici sulla posizione C5 di una citosina, tipicamente la citosina di un dinucleotide citosina-guanina, noto a....

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Protocol

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Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute. La cura e l'uso Comitato degli animali presso l'Università di Alabama a Birmingham ha approvato l'uso degli animali.

1. Ottenere RNA e DNA da un Arricchita astrocitica Popolazione utilizzando fluorescenti Cellulari Attivato Ordinamento (FACS) di astrociti da tutto il tessuto del cervello

  1. Animale sedate con CO 2 per 1 minuto e poi rapidamente decapitarlo. Sezionare cortecce come descritto in Albuquerque et al, 26.; non è necessario rimuovere meningi.
    Nota: i ratti transgenici....

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Results

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Una popolazione arricchita di astrociti è stato acquisito tramite FACS ordinamento di eGFP-S100β animali transgenici 27. A causa della diminuzione della qualità delle cellule e molecole molecolari isolati da animali di età superiore a postnatale giorno 50 (p50), animali di età p0-P40 sono ottimali per tali esperimenti. Tessuto corticale è stato utilizzato per questi esperimenti. Cortecce da due a sei animali sono stati riuniti insieme. FACS è stata eseguita presso lo stabilimento UAB Comprehensive Citometria .......

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Discussion

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Questo protocollo descrive l'isolamento di una popolazione arricchita di astrociti tramite FACS e una varietà di tecniche che consentono studi sia correlati che causativi tra la metilazione del DNA e l'espressione genica. Queste tecniche, utilizzate in isolamento o in combinazione, sono particolarmente utili per i laboratori che lavorano con tessuti ad alta eterogeneità cellulare o sono interessati allo stato di metilazione del DNA di un particolare gene o regione genica rispetto ai cambiamenti globali della metilazione .......

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Disclosures

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Gli autori non hanno divulgazioni.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato supportato da R01NS075062-01A1. Smistamento FACS eseguito presso la struttura UAB Comprehensive Flow Cytometry Core (P30 AR048311, P30 A1027767). Il Dr. Scott Philips della struttura UAB Neurobiology Core e la Dr. Susan Nozell dell'UAB CDIB hanno assistito con gli aspetti tecnici del test della luciferasi.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sistema di dissociazione della papainaWorthington Biochemical CorporationLK003150
Mini kit AllPrep DNA/RNAQiagen80204
Methyl PrimerSoftware online Applied Biosystemsper localizzare le isole CpG
Kit di metilazione del DNA EZZymo ResearchD5001
Standard di calibrazione premiscelata per rattoEpiGenDx80-8060R-Premix
CpG Metilasi (M.Sssl)Zymo ResearchE2010
QIAestrazione rapida del gel QIagen28704Utilizzato per l'estrazione di gel e la pulizia del DNA
Enzimi di restrizioneNew England BioLabs
NEB cutterNew England BioLabsverifica onlinesiti di digestione di restrizione
Doppio sistema di saggio Luciferase ReporterPromegaE1910
Luc2 vettore, pGL4.10PromegaE6651
vettore renilla, pGL4.74PromegaE2241
TD-20/20 LuminometroTurner progetta
Lipofectamina LTX e Plus ReagenteLife TechnologiesA12621
Fenolo, saturo pH 6,6/6,9Fisher ScientificBP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c SpettroptometroThermoScientific
MeltDoctor Master MixLife Technologies4415440
Software HRM (High Resolution Melt) v2.0Life Technologies4397808
AB Software SDS v2.3Life Technologiesonline
AB High Resolution Melting Guida introduttiva Life Technologiesonline
AB 7900HT Sistema veloce in tempo realeLife Technologies
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References

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  1. Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16 (1), 6-21 (2002).
  2. Deaton, A. M., Bird, A. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 25, 1010-1022 (2011).
  3. Lorincz, M. C., Dickerson, D. R., Schmitt, M.

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DNA MethylationGene ExpressionAstrocyte IsolationFACS SortingMS HRMALuciferase AssayKCNJ10 PromoterTranscriptional ActivityMethylation Sensitive High Resolution Melt AnalysisCortical Astrocytes

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