Method Article

Correlare DNA Modifiche metilazione gene-specifica con espressione e trascrizionale attività di astrociti KCNJ10 (Kir4.1)

DOI:

10.3791/52406

⸱

September 26th, 2015

 , 
1Department of Cell Developmental and Integrative Biology, University of Alabama at Birmingham

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La metilazione del DNA è in grado di mantenere stabili i livelli di espressione genica e di consentire cambiamenti dinamici nell'espressione genica in risposta a una varietà di stimoli. Descriviamo in dettaglio le tecniche che consentono lo studio dei cambiamenti gene-specifici nella metilazione del DNA e l'effetto di questi cambiamenti sull'espressione genica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La metilazione del DNA serve a regolare l'espressione genica attraverso l'attaccamento covalente di un gruppo metilico sulla posizione C5 di una citosina in un dinucleotide citosina-guanina. Mentre la metilazione del DNA fornisce cambiamenti duraturi e stabili nell'espressione genica, anche i modelli e i livelli di metilazione del DNA sono soggetti a cambiamenti in base a una varietà di segnali e stimoli. In quanto tale, la metilazione del DNA funziona come un regolatore potente e dinamico dell'espressione genica. Lo studio della neuroepigenetica ha rivelato una varietà di stati fisiologici e patologici che sono associati a cambiamenti sia globali che gene-specifici nella metilazione del DNA. In particolare, esistono sorprendenti correlazioni tra i cambiamenti nell'espressione genica e la metilazione del DNA nei disturbi neuropsichiatrici e neurodegenerativi, durante la plasticità sinaptica e dopo lesioni al SNC. Tuttavia, poiché il campo della neuroepigenetica continua ad espandere la sua comprensione del ruolo della metilazione del DNA nella fisiologia del SNC, è essenziale delineare le relazioni causali per quanto riguarda i cambiamenti nell'espressione genica e nella metilazione del DNA. Inoltre, per quanto riguarda il campo più ampio delle neuroscienze, la presenza di vaste differenze regionali e cellulo-specifiche richiede tecniche che affrontino queste variazioni quando si studiano il trascrittoma, il proteoma e l'epigenoma. Qui descriviamo lo smistamento FACS degli astrociti corticali che consente il successivo esame sia della trascrizione dell'RNA che della metilazione del DNA. Inoltre, descriviamo in dettaglio una tecnica per esaminare la metilazione del DNA, l'analisi del fuso ad alta risoluzione sensibile alla metilazione (MS-HRMA) e un saggio del promotore della luciferasi. Attraverso l'uso di queste tecniche combinate si è in grado non solo di esplorare i cambiamenti correlati tra la metilazione del DNA e l'espressione genica, ma anche di valutare direttamente se i cambiamenti nello stato di metilazione del DNA di una data regione genica sono sufficienti per influenzare l'attività trascrizionale.

Introduction

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L'epigenetica è lo studio delle modificazioni chimiche che possono influenzare l'attività trascrizionale del genoma. Essenzialmente, senza un cambiamento nella sequenza del DNA, le modifiche epigenetiche come la metilazione del DNA, l'acetilazione degli istoni e la metilazione degli istoni sono sufficienti per alterare in modo reversibile i modelli di espressione genica 1. La metilazione del DNA, un potente regolatore dell'espressione genica, è la modificazione epigenetica più caratterizzata. La metilazione del DNA è l'attacco covalente di gruppi metilici sulla posizione C5 di una citosina, tipicamente la citosina di un dinucleotide citosina-guanina, noto anche come sito CpG. Le aree che contengono un'alta densità di siti CpG sono note come isole CpG (CGI). I CGI sono frequentemente associati ai siti di inizio trascrizionale (TSS) e ai promotori genici 1-3. Pertanto, mentre i cambiamenti nella metilazione del DNA nelle CGI non sono sempre concomitanti con i cambiamenti nell'espressione o nella funzione cellulare, i cambiamenti nella metilazione del DNA nelle CGI possono esercitare una potente regolazione sull'attività trascrizionale 2.

Storicamente, si è osservato che la metilazione del DNA è essenziale nell'embriogenesi, nell'imprinting e nello sviluppo, con piccoli cambiamenti nei livelli di metilazione del DNA che si verificano nelle cellule post-mitotiche (con l'eccezione delle alterazioni nei geni correlati al cancro) 4,5. Tuttavia, il campo della neuroepigenetica ha evidenziato un importante ruolo non evolutivo per la metilazione del DNA. In particolare, l'epigenetica cognitiva ha ridefinito la metilazione del DNA come un meccanismo altamente plastico integrale nel mediare sia l'attivazione trascrizionale che la repressione di geni essenziali per il processo di apprendimento e memoria 6. Oltre all'epigenetica cognitiva, gli studi che modellano il danno ischemico e il dolore neuropatico caratterizzano la metilazione del DNA come un meccanismo labile che risponde rapidamente a una varietà di insulti del SNC 7-9. Per quanto riguarda gli astrociti, diverse linee di evidenza suggeriscono che la metilazione del DNA svolge un ruolo importante nell'astrogliogenesi. Fan et al., hanno scoperto che il KO condizionale di DNMT1 nelle cellule progenitrici neurali (NPC) ha portato allo sviluppo precoce di astrociti concordanti con uno stato globale di ipometilazione 10. Inoltre, Perisic et al., hanno concluso che i livelli differenziali di metilazione del DNA del promotore GLT-1 mediano i livelli differenziali di espressione del trasportatore del glutammato nella corteccia e nel cervelletto, sottolineando un ruolo nella metilazione del DNA nello stabilire modelli specifici della regione cerebrale dell'espressione genica astrocitaria 11. Nel complesso, numerosi studi sottolineano la natura dinamica e labile della metilazione del DNA nel SNC poiché è stato dimostrato che l'ambiente, i farmaci e le lesioni modificano la metilazione del DNA e, spesso, l'espressione genica 4,9. Insieme, questi studi neuroepigenetici indicano la metilazione del DNA come un bersaglio terapeutico fattibile con il potenziale di mitigare una varietà di patologie del SNC.

Man mano che il campo dell'epigenetica espande la sua comprensione del ruolo della metilazione del DNA nel neurosviluppo e nella malattia, la sfida di spostare la metilazione del DNA verso un bersaglio terapeutico consiste nell'eseguire non solo studi correlativi, ma anche causali che definiscono specifici bersagli e siti genici. Inoltre, l'indagine sui cambiamenti nella metilazione del DNA specifici per la regione del cervello e il tipo di cellula rimane una sfida continua e degna di tempo, unica nel campo della neuroepigenetica. Questo protocollo utilizza una varietà di tecniche, tra cui la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) degli astrociti, l'analisi del fuso ad alta risoluzione sensibile alla metilazione (MS-HRM) e un saggio di metilazione luciferasi per studiare lo stato di metilazione del DNA di KCNJ10, un gene che codifica per Kir4.1. Kir4.1 è un canale del potassio gliale specifico che dimostra sia la regione cerebrale che i modelli di espressione specifici delle cellule nel SNC 12-16. L'espressione di Kir4.1 aumenta passando dalle regioni rostrali a quelle caudali del SNC, con l'espressione più alta che si verifica nel midollo spinale 15. Sebbene il canale sia espresso nelle cellule ependimali, negli oligodendrociti e nelle loro cellule precursori, Kir4.1 è espresso prevalentemente negli astrociti e si ritiene che sia essenziale per mantenere i livelli omeostatici di potassio e per supportare l'assorbimento del glutammato impostando il potenziale di membrana a riposo degli astrociti a una temperatura iperpolarizzata di -80mV 12,16-19. È importante sottolineare che l'espressione di Kir4.1 non è statica sia durante lo sviluppo che in seguito a molteplici forme di lesione del SNC 20-25. Abbiamo voluto esaminare la regolazione epigenetica di questo canale, in particolare negli astrociti durante lo sviluppo. Le tecniche utilizzate offrono analisi del sito CpG specifiche e mirate per il gene che forniscono prove causali di un ruolo della metilazione del DNA nella regolazione dell'espressione genica di KCNJ10. Queste tecniche possono essere applicate ad altri geni.

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Protocol

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Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute. La cura e l'uso Comitato degli animali presso l'Università di Alabama a Birmingham ha approvato l'uso degli animali.

1. Ottenere RNA e DNA da un Arricchita astrocitica Popolazione utilizzando fluorescenti Cellulari Attivato Ordinamento (FACS) di astrociti da tutto il tessuto del cervello

  1. Animale sedate con CO 2 per 1 minuto e poi rapidamente decapitarlo. Sezionare cortecce come descritto in Albuquerque et al, 26.; non è necessario rimuovere meningi.
    Nota: i ratti transgenici che esprimono eGFP sotto il S100β (un marcatore astrociti) promotore sono stati generati da Itakura et al 27 e utilizzati per FACS ordinamento degli astrociti..
  2. Preparare tutto omogenato cerebrale utilizzando un kit di dissociazione papaina in condizioni non sterili, secondo il protocollo del produttore. Calore disattivare papaina a 37 ° C a bagnomaria per 10 min. Nota:Soluzione papaina è fornito dal costruttore e contiene L-cisteina e EDTA (vedi Tabella dei Materiali).
    1. Tagliare o dremel un foro nella parte superiore di un tubo da 50 ml per permettere tubazione che trasporta il 95% O 2: 5% CO 2 da alimentare in una provetta conica chiusa (Figura 1A). Mettere cortecce sezionato in 10 millimetri piatto di coltura contenenti supporti dissociazione (MEM supplementato con 20 mM glucosio e la penicillina / streptomicina (500 U / ml) ed equilibrato al 95% O 2: 5% di CO 2) e utilizzare una lama di rasoio pulito per tritare il tessuto in 1 x 1 mm 2 pezzi.
  3. Tessuto Trasferimento con 10 ml Pipetman manuale a tubo da 50 ml contenente soluzione papaina. Lasciare tessuto di depositarsi fondo pipetta prima dello scarico per minimizzare la quantità di materiale di dissociazione riportati. Mantenere soluzione papaina equilibrati a 95% O 2: 5% CO 2 attraverso lo scambio di gas di superficie per la durata dell'incubazione. Non bolla papaina solution. Incubare il tessuto per 20 minuti a 37 ° C bagnomaria.
  4. Dopo l'incubazione in soluzione papaina, tessuto triturare 10 volte con una pipetta 10 ml di trasferimento a bassa velocità. Centrifugare sospensione cellulare nuvoloso a 1.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
    1. Equilibrare soluzione inibitore DNasi / albumina (fornito dal costruttore) attraverso lo scambio di gas superficiale e risospendere le cellule in pellet in 3 ml di soluzione inibitore / DNasi di albumina. Preparare commerciale gradiente di densità discontinuo seguendo le istruzioni del produttore.
  5. Spin gradiente di densità discontinuo a 1.000 xg per 6 min. Isolare le cellule dissociate dal fondo della provetta da succhiare pellet fondo con una pipetta.
  6. Risospendere le cellule dissociate in 2-3 ml di DPBS con 0,02% di albumina di siero bovino e 1 mg / ml DNasi o HEPES buffered preferiti coltura. Passare attraverso 40 micron filtro prima FACS (Figura 2A). Mantenere le cellule in ghiaccio fino a quando l'ordinamento.
    1. Eseguire FACS 28.
    2. Cellule pellet in 1,5 ml provette a 2000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
      Nota: astrociti Il pellet possono essere utilizzati immediatamente o conservati in -80 ° C fino al momento dell'estrazione del DNA.
  7. Estratto RNA e DNA utilizzando il metodo preferito di isolamento 29 30. Valutare RNA e concentrazione del DNA e la qualità con spettrofotometro e bioanalizzatore 31.
    Nota: Utilizzare solo RNA alta qualità e il DNA in fasi successive, 260/280 = 2,0-2,2 e 1,8-1,9, rispettivamente. Analisi Bioanalyzer è essenziale per valutare la degradazione dell'RNA o frammentazione del DNA. RNA o DNA possono essere utilizzati immediatamente o conservate in -80 ° C o -20 ° C, rispettivamente per gli studi successivi.

2. Valutare metilazione del DNA Stato di un gene mediante metilazione-sensibile ad alta risoluzione Melt Analysis (MS-HRMA)

  1. Inserisci sequenza del gene di interesse in preferito software di mappatura metilazione online per individuare eventuali isole CpG del genedi interessi 32.
    1. Primer design contro bisolfito convertiti sequenza di DNA 33 e amplificano con DNA polimerasi preferita secondo il protocollo del produttore. Verificare le dimensioni del prodotto amplificato mediante l'esecuzione di un gel di DNA agarosio 1% a 100 V per 45 minuti. Conservare primer a concentrazione magazzino di 20 micron di -20 ° C.
  2. Bisolfito convertire 500-1000 ng di DNA di ciascun campione e DNA metilato standard che vanno da 0-100% delle stesse specie animali 34. Campioni eluire per fornire una concentrazione di 20 ng / ml. Verificare la concentrazione di bisolfito di DNA convertito con spettrofotometro 31.
  3. Setup 20 reazioni microlitri per l'amplificazione di MS-HRM utilizzando DNA polimerasi preferito e primer a 5 micron di concentrazione in base alla tabella 1 e 2. Eseguire tutti i campioni, tra cui DNA e metilato standard FACS, in triplice copia.
  4. A seconda del software di analisi, impostare pre- e post-avviare e arrestare i parametriintorno alle transizioni della curva di fusione. Set inizio pre-fusione e parametri di stop pre-melt così la differenza tra i due è 0,2-0,5 ° C. Imposta l'inizio post-fusione e post-fusione fermare in modo simile. Estrarre i dati differenza di temperatura di picco per ogni campione.
  5. Utilizzando gli standard per cento metilati (y-valore) e le loro corrispondenti differenze di temperatura di picco medi (x valore) genera una equazione di regressione lineare (Figura 3A-B, Tabella 3-4). Utilizzare questa equazione di regressione lineare per stimare lo stato di metilazione di 35 campioni sconosciuti.

3. Valutare Hyper-metilato Promotore Attività via Uso di luciferasi Assay

  1. Identificare isole CpG del gene bersaglio (punto 2.1). PCR amplifica regioni di interesse 36 e clone monte della luc2 Firefly gene della luciferasi giornalista per la produzione di plasmidi CpG-isola-luc2 37.
  2. Linearizzare 30 microgrammi di plasmide CpG-isola-luc2 via restrizionedigestione enzimatica 38. Verificare i siti di restrizione digest e di evitare doppi tagli utilizzando il software di taglio preferito 38. Calore-inattivare enzimi a temperatura e durata adeguata seguenti digestione secondo il protocollo del produttore. Perdita minima di DNA si verifica durante la fase di linearizzazione.
  3. Metilato plasmidi linearizzati con CpG metilasi (M.Sssl) O / N a 30 ° C o lasciare non trattati protocollo seguente produttore tranne che per le seguenti regolazioni.
  4. Eseguire 50 reazioni microlitri.
  5. Utilizzare 5 unità di CpG metilasi per metilare 700 ng di plasmide linearizzato.
  6. Eseguire reazioni O / N per 13-19 ore.
  7. A seguito di CpG reazione metilasi, eseguire la pulitura del DNA utilizzando lo standard, disponibile in commercio membrana di gel di silice pulizia Kit secondo il protocollo del produttore. Perdite significative di DNA si verificano a seguito CpG reazione metilasi, perdita 30-60%.
  8. Verificare metilazione di plasmidi tramite una restrizione Hpa II digest.
  9. Prendere 1 mg di DNA metilato o non metilato e restrizione digerire con Hpa II per 1 ora a 37 ° C. Utilizzare 5-10 unità di Hpa II per ogni mg di DNA. A seguito di Hpa II digestione, eseguire la pulitura DNA usando preferita, membrana disponibile in commercio gel di silice ripulire kit. Eseguire entrambi plasmidi metilati e non metilati CpG su un gel di agarosio 1% DNA in tampone TAE o TBE a 100 V per 45 minuti per la visualizzazione (Figura 4B).
  10. Oggetto sia denaturato e non metilato plasmidi a doppia digestione con opportuni enzimi di restrizione per rilasciare full-length luc 2 (vettoriale) e l'isola CpG (inserto) frammenti 38. Eseguire doppio digestione O / N a temperatura adeguata e gli enzimi calore inattivare seguente digestione secondo il protocollo del produttore. Minima perdita di concentrazione di DNA avviene durante doppia restrizione digest.
  11. Eseguire plasmidi doppio digeriti su 1% gel di agarosio DNA a 100 V per 1 ora per permettere la separazione of vettore e inserire (Figura 4C). Attenzione. Indossando UV scudo protettivo faccia, mettere il gel del DNA su un tavolo nero luce di visualizzare bande. In base alle dimensioni, accise inserto metilato e non metilato e non metilato vettore con una lama chirurgica pulito.
  12. Gel estratto di DNA con fenolo saturo, pH 6,6. In breve, pesare gel DNA contenente vettoriale o inserto. Utilizzare 100 ml di fenolo per 0,1 grammi di gel DNA. Omogeneizzare gel DNA fenolo utilizzando Dounce vetro omogeneizzatore.
  13. Aggiungere cloroformio (con 1/5 del volume di fenolo) ed agitare i campioni per 20 sec. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 2-3 minuti. Centrifugare per 15 minuti a velocità massima (16,1 x 1.000 xg) a 4 ° C.
  14. Rimuovere la soluzione acquosa e 0,1 X. aggiungere volume di 3 M acetato di sodio e 2,5 volte il volume di etanolo. Incubare i campioni per 1 ora a -80 ° C. Dopo l'incubazione, rimuovere l'etanolo e risospendere il DNA in 30 microlitri di tampone preferito. Significativa perdita di DNA avviene seguenti isolamento di inserti e vettori, 30-50% loss.
  15. Re-legare inserti metilato e non metilato al vettore non metilato utilizzando T4 DNA ligasi 38. Utilizzare un rapporto 1: 4 di vettore da inserire per le reazioni legatura. Reazione di installazione in base alle istruzioni del produttore. Utilizzare un volume totale di 50 microlitri per le reazioni e incubare O / N a -20 ° C o su ghiaccio con coperchio sopra secchiello del ghiaccio.
  16. A seguito di legatura, eseguire la pulitura DNA usando preferita, membrana disponibile in commercio gel di silice ripulire kit. Significativa perdita di DNA si verificano a seguito di reazione legatura, un approssimativo perdita 30-50% del DNA. Verificare ri-legatura eseguendo il 1% gel di DNA agarosio a 100 V per 45 minuti e valutare la concentrazione di plasmidi ri-legatura (Figura 4D).
  17. Trasfettare plasmidi denaturato o non denaturato nelle cellule D54 con un reagente di trasfezione commerciale secondo il protocollo del produttore. Cellule D54 Seed sulla piastra 12 pozzetti alla 0,14 x 10 6 cellule / pozzetto.
  18. A seguito di 24 ore, le cellule trasfettare with concentrazioni uguali di entrambi (1) plasmide non methyated CpG luc2 + Renilla o un altro controllo luciferasi vettoriale o (2) metilata plasmide CpG luc2 + Renilla o un altro controllo luciferasi vettoriale.
  19. Consentono alle cellule per trasfettare per 24 ore prima di eseguire doppio test luciferasi. Eseguire test secondo le istruzioni del produttore. Eseguire le letture usando un luminometro. Leggere ogni bene in triplice copia.
  20. Calcolare il rapporto di attività luciferasi Firefly a Renilla o altre attività di controllo della luciferasi. Normalizzare metilato Firefly: attività luciferasi di controllo per non metilato Firefly: attività luciferasi controllo dividendo l'attività luciferasi metilato per attività luciferasi non denaturato

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Results

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Una popolazione arricchita di astrociti è stato acquisito tramite FACS ordinamento di eGFP-S100β animali transgenici 27. A causa della diminuzione della qualità delle cellule e molecole molecolari isolati da animali di età superiore a postnatale giorno 50 (p50), animali di età p0-P40 sono ottimali per tali esperimenti. Tessuto corticale è stato utilizzato per questi esperimenti. Cortecce da due a sei animali sono stati riuniti insieme. FACS è stata eseguita presso lo stabilimento UAB Comprehensive Citometria ...

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Discussion

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Questo protocollo descrive l'isolamento di una popolazione arricchita di astrociti tramite FACS e una varietà di tecniche che consentono studi sia correlati che causativi tra la metilazione del DNA e l'espressione genica. Queste tecniche, utilizzate in isolamento o in combinazione, sono particolarmente utili per i laboratori che lavorano con tessuti ad alta eterogeneità cellulare o sono interessati allo stato di metilazione del DNA di un particolare gene o regione genica rispetto ai cambiamenti globali della metilazione ...

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Disclosures

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Gli autori non hanno divulgazioni.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato supportato da R01NS075062-01A1. Smistamento FACS eseguito presso la struttura UAB Comprehensive Flow Cytometry Core (P30 AR048311, P30 A1027767). Il Dr. Scott Philips della struttura UAB Neurobiology Core e la Dr. Susan Nozell dell'UAB CDIB hanno assistito con gli aspetti tecnici del test della luciferasi.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sistema di dissociazione della papainaWorthington Biochemical CorporationLK003150
Mini kit AllPrep DNA/RNAQiagen80204
Methyl PrimerSoftware online Applied Biosystemsper localizzare le isole CpG
Kit di metilazione del DNA EZZymo ResearchD5001
Standard di calibrazione premiscelata per rattoEpiGenDx80-8060R-Premix
CpG Metilasi (M.Sssl)Zymo ResearchE2010
QIAestrazione rapida del gel QIagen28704Utilizzato per l'estrazione di gel e la pulizia del DNA
Enzimi di restrizioneNew England BioLabs
NEB cutterNew England BioLabsverifica onlinesiti di digestione di restrizione
Doppio sistema di saggio Luciferase ReporterPromegaE1910
Luc2 vettore, pGL4.10PromegaE6651
vettore renilla, pGL4.74PromegaE2241
TD-20/20 LuminometroTurner progetta
Lipofectamina LTX e Plus ReagenteLife TechnologiesA12621
Fenolo, saturo pH 6,6/6,9Fisher ScientificBP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c SpettroptometroThermoScientific
MeltDoctor Master MixLife Technologies4415440
Software HRM (High Resolution Melt) v2.0Life Technologies4397808
AB Software SDS v2.3Life Technologiesonline
AB High Resolution Melting Guida introduttiva Life Technologiesonline
AB 7900HT Sistema veloce in tempo realeLife Technologies
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References

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