Lo scopo di questo protocollo è dimostrare i principi e le tecniche per misurare e calcolare la velocità di filtrazione glomerulare, la velocità di flusso urinario e l'escrezione di sodio e potassio in un ratto. Questa dimostrazione può essere utilizzata per fornire agli studenti una comprensione concettuale generale di come misurare la funzione renale.
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Articolo metodologico
Fisiologia Lab Dimostrazione: filtrazione glomerulare in un ratto
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le misurazioni della velocità di filtrazione glomerulare (GFR) e dell'escrezione frazionata di sodio (Na) e potassio (K) sono fondamentali per valutare la funzione renale in salute e malattia. La GFR è misurata come la clearance renale allo stato stazionario dell'inulina che viene filtrata al glomerulo, ma non secreta o riassorbita lungo il nefrone. L'escrezione frazionata di Na e K può essere determinata dalla concentrazione di Na e K nel plasma e nelle urine. La clearance renale dell'inulina può essere dimostrata in un animale anestetizzato che ha cateteri nell'arteria femorale, nella vena femorale e nella vescica. Le attrezzature e le forniture utilizzate per questa procedura sono quelle comunemente disponibili in una struttura di ricerca, e quindi rendono questa procedura un mezzo pratico per misurare la funzionalità renale. Lo scopo di questo video è quello di dimostrare le procedure necessarie per eseguire una dimostrazione di laboratorio in cui la funzionalità renale viene valutata prima e dopo un farmaco diuretico. La tecnica presentata può essere utilizzata per valutare la funzione renale in modelli di ratto di malattia renale.
Introduzione
La funzione più importante del rene è la regolazione omeostatica dell'acqua extracellulare e del contenuto di elettroliti. I reni regolano strettamente l'acqua extracellulare, il sodio (Na) e il potassio (K) per mantenere i normali livelli fisiologici. I disturbi della funzione renale possono provocare gravi disturbi metabolici che possono essere fatali. Il processo renale di base avviene nel nefrone e inizia con la filtrazione del plasma al glomerulo e termina con l'escrezione di urina. Altri processi che determinano la concentrazione finale di acqua, Na e K nelle urine sono la secrezione e il riassorbimento all'interno del nefrone. Le misurazioni della velocità di filtrazione glomerulare (GFR) e dell'escrezione frazionata di Na e K sono fondamentali per valutare la funzionalità renale in salute e in malattia. Si rimanda il lettore ad articoli di revisione e libri di testo precedentemente pubblicati per una discussione più approfondita della funzione renale1-4.
GFR può essere misurato come la clearance renale allo stato stazionario dell'inulina che viene filtrata al glomerulo, ma non secreta o riassorbita lungo il nefrone5. Sebbene questa tecnica richieda l'anestesia, la preparazione chirurgica e un esperimento terminale, è considerata il gold standard della misurazione della GFR. Utilizzando l'inulina marcata con fluoresceina-isotiocianato (FITC), la concentrazione plasmatica e urinaria di FITC-inulina può essere facilmente misurata in piccoli volumi e utilizzata per calcolare il GFR durante più punti temporali di un esperimento. L'escrezione frazionata di Na e K può essere determinata dalla concentrazione di Na e K nel plasma e nelle urine.
La comprensione concettuale di come misurare la funzione renale può essere facilmente dimostrata in un breve laboratorio progettato per consentire agli studenti di partecipare attivamente ad alcuni aspetti dell'esperimento. Questo video illustra la preparazione pre-laboratorio, la dimostrazione della funzionalità renale e la valutazione post-laboratorio dei risultati. Le tecniche chirurgiche necessarie per effettuare le misurazioni della GFR sono dimostrate in un ratto anestetizzato. Inoltre, i calcoli di esempio per la GFR e l'escrezione frazionata di Na e K sono mostrati prima e dopo la somministrazione di un farmaco diuretico.
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Protocollo
Prima di qualsiasi procedura animale, la cura degli animali e l'uso comitato istituzionale (IACUC) deve approvare il protocollo. Questo protocollo è stato approvato dalla Michigan State University IACUC.
1. Preparazione Pre-lab di FITC-inulina Solution
- Warm 20 ml di soluzione salina a 70 ° C e agitare lentamente in 100 mg di FITC-inulina (5 mg / ml FITC-inulina) finché tutto inulina è disciolto.
- Soluzione Raffreddare a RT e aggiungere 800 mg di albumina sierica bovina (40 mg / ml BSA, polvere liofilizzata, essenzialmente globulina, basso endotossina, ≥98% di purezza mediante elettroforesi su gel di agarosio).
- Filtrare la soluzione di inulina-BSA con carta da filtro (grado 1). Mettere la soluzione filtrata in una siringa da 20 ml con un filtro a siringa punta (0,2 micron) e coprire con un foglio al riparo dalla luce.
2. Anestesia e Chirurgia
- Posizionare il ratto in una camera di induzione riempita con 5% isoflurano per indurre anestesia. Record bodpeso y (250-350 g) e posizionare il ratto su una piattaforma chirurgica riscaldato progettato per mantenere la temperatura corporea di 37 ° C tutto l'esperimento. Garantire delicatamente il topo alla piattaforma con del nastro di laboratorio sulle zampe. Mantenere anestesia con 1-2% isoflurano con grado medico di 100% O 2 al flusso d'aria di 0,8-1,0 L / min.
- Inserire un catetere conica (OD punta intravascolare, 2.7F) nell'arteria femorale per la pressione sanguigna e il monitoraggio della frequenza cardiaca, e il prelievo di sangue.
- Inserire un catetere (PE-50) nella vena femorale per inulina infusione. Fissare il catetere al tessuto con 5-O seta intrecciata sutura chirurgica 6 circostante.
- Fissare il catetere arterioso ad un trasduttore di pressione estensimetri. Registrare la pressione sanguigna e la frequenza cardiaca utilizzando software di acquisizione dei dati e la visualizzazione sullo schermo di un computer in tempo reale. Questa tecnica è illustrata in dettaglio in video 6.
- Esporre la vescica attraverso un'incisione sovrapubica. Tagliare un piccoloforo nella punta della vescica e inserire una cannula (PE-190) con un calore svasate punta all'interno della vescica per la raccolta delle urine. Fissare la cannula alla vescica con una sutura a borsa di.
3. urine e il prelievo di sangue
- Posizionare la siringa di FITC-inulina in una pompa a siringa con portata regolata di 1 ml / h per 100 g di peso corporeo (3 ml / h per un topo peso 300 g). Attaccare la siringa al catetere vena femorale. Avviare l'infusione di inulina e consentire un periodo di equilibrio 1-2 ore. Tenere la siringa ricoperto di un foglio al riparo dalla luce.
- Determinare se il flusso urinario è stabile e adeguata per l'analisi del campione (20 microlitri / min) per raccogliere un campione di urina in una fiala di raccolta pre-pesato per un periodo di 10 min. Determinazione del volume di urina metodo gravimetrico con una bilancia digitale. Un volume di urina adeguata per un periodo di raccolta 10 minuti è di 0,2 ml. Continuare a raccogliere campioni di urina fino a due collezioni consecutivi indicano un flusso di urina di 20 l / min o più.
- Campioni Pre-droga
- Raccogliere un campione di urina nel corso di un periodo di 20 min. Raccogliere un campione di sangue (0,5 ml) dal catetere arterioso a metà del periodo di raccolta delle urine. Fare attenzione a cancellare completamente il catetere arterioso di soluzione fisiologica prima di raccogliere un campione di sangue in una fiala di raccolta contenente 1 U eparina. Utilizzare fiale raccolta con marcature volume per facilitare la raccolta di 0,5 ml di sangue arterioso.
- Lavare il catetere arterioso con eparina-salina (20 U / ml) per cancellare il catetere di sangue (circa 0,1 ml.). La lunghezza del catetere arterioso deve essere il più breve possibile per limitare il volume di eparina-salina necessaria per irrigare.
Nota: i campioni di sangue diluito producono calcoli imprecisi di GFR e l'escrezione frazionale di Na e K. - Attendere 10 minuti, e ripetere la raccolta di una seconda urina pre-droga e campione di sangue.
- Dopo la raccolta di due campioni pre-droga, amministrare un dru diureticog, furosemide (10 mg / kg), tramite il catetere arterioso. Lavare il catetere arterioso con soluzione salina eparinizzata per cancellare il catetere di droga. Fare attenzione per evitare l'immissione di aria attraverso il catetere arterioso. Registrare il tempo di iniezione furosemide.
- Campioni post-farmaco: Ad ognuno dei 3 punti di tempo indicati, raccogliere un campione di urina durante un periodo di raccolta 10 min, e un campione di sangue (0,5 ml) a metà del periodo di raccolta delle urine.
- Per il campione post-Drug 1 - raccogliere cinque minuti dopo furosemide.
- Per il campione post-Drug 2 - raccogliere dieci minuti dopo furosemide.
- Per il campione post-Drug 3 - raccogliere quindici minuti dopo la furosemide.
- Dopo che tutti i campioni sono stati raccolti, eutanasia il ratto secondo procedure istituzionali da toracotomia e la rimozione del cuore. Rimuovere entrambi i reni. Decapsulate (rimuovere la membrana che circonda) e asciugare i reni per rimuovere il sangue in eccesso. Pesare i reni.
4. Analisi dei campioni
- Misurare tutti i volumi di campione di urina con metodo gravimetrico con una bilancia digitale, e pesi record.
- Campioni di centrifuga di sangue intero con una centrifuga da tavolo (1.800 xg) per separare il plasma. Trasferire campioni di plasma di piccole fiale etichettate.
- Analizzare le concentrazioni di Na e K in campioni di urina e di plasma con un analizzatore di sodio / potassio.
- Misura di FITC-inulina nel plasma e nelle urine
- Diluire urina pre-droga (da 1: 200 a 1: 400), e nelle urine post-droga (1,10) con tampone HEPES (500 mM, pH 7,4).
- Aggiungere 40 ml di microlitri standard o campione e 60 di tampone HEPES in una piastra da 96 pozzetti (un campione per pozzetto) e lasciare mescolare per 10 minuti mentre coperto con un foglio di alluminio.
- Generare una curva standard per FITC-inulina per le concentrazioni di 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug / ml (Figura 1). Determinare FITC-inulina fluorescenza in campioni e standard utilizzando un lettore di micropiastre con l'excitazioni e di emissione lunghezze d'onda di 485 e 538 nm, rispettivamente.
- Montare i valori fluorescenti per gli standard di un 4 Parametro analisi di regressione funzione logistica. I parametri della funzione di regressione sono utilizzati per calcolare la concentrazione FITC-inulina in campioni di plasma ed urina (Tabella 1).
5. Post-laboratorio Analisi dei risultati: Calcoli
- Calcola urina Portata (UV; ml / min): [volume di urina raccolto (ml)] ÷ [momento della raccolta (min)]
- Calcola velocità di filtrazione glomerulare (GFR; ml / min): [concentrazione inulina Urina (mg / ml) x UV (ml / min)] ÷ [plasma inulina conc. (Mg / ml)]
- Calcola filtrata carico di sodio (mmol / min): concentrazione di sodio al plasma (mmol / ml) x GFR (ml / min)
- Calcola sodio escrezione Rate (U Na V; mmol / min): concentrazione di sodio Urina (mmol / ml) x UV (ml / min)
- Calcola frazionale escrezione di sodio (Na FE;%): [U Na V (mmol / min)] ÷ [filtrato sodio Load (mmol / min)] x 100
- Calcola carico filtrato di potassio (mmol / min): la concentrazione di potassio del plasma (mmol / ml) x GFR (ml / min)
- Calcola potassio escrezione Rate (U K V; mmol / min): concentrazione di potassio Urina (mmol / ml) x UV (ml / min)
- Calcola frazionale escrezione di potassio (FE K;%): [U K V (mmol / min)] ÷ [filtrato carico di potassio (mmol / min)] x 100
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Risultati
Il diuretico usato nella dimostrazione laboratorio era furosemide che inibisce molto rapidamente il riassorbimento di Na e K filtrati dal rene con conseguente aumento Na, K, e l'escrezione dell'acqua entro minuti dalla somministrazione del farmaco. Con il suo meccanismo primario, furosemide dovrebbe avere effetti minimi sul GFR e il carico filtrato di Na e K, ma aumenterà il flusso di urina, e l'escrezione frazionale di Na e K.
I risultati rappresentativi in Tabella 3
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Discussione
Un indicatore adeguato per la misura GFR devono soddisfare quattro criteri: essere liberamente filtrato a livello glomerulare, essere non legato alle proteine plasmatiche, e né essere assorbiti né secreto nel nefrone. L'inulina è un polimero di fruttosio che soddisfa questi criteri. Come risultato, la clearance renale dell'inulina è considerato lo standard per misurare GFR 7. La tecnica dimostrata rappresenta l'approccio tradizionale di determinare la clearance renale di inulina utilizzando racc...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione. I pareri o le affermazioni contenute nel presente documento sono le opinioni personali dell'autore e non sono da intendersi come ufficiale o come riflesso le opinioni del Dipartimento dell'Esercito o il Dipartimento della Difesa.
Ringraziamenti
La fonte di finanziamento per la dimostrazione laboratorio era NIGMS concessione: GM077119. Ringraziamo il Dr. Joseph R. Haywood e il Dr. Peter Cobbett per il loro supporto Short Couse in Integrativa e organo Sistemi Farmacologia. Ringraziamo anche la signora Hannah Garver per il suo supporto tecnico della manifestazione laboratorio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5-0 sutura chirurgica in seta intrecciata | Surgical Specialties Corp | SP1033 | |
| piastra di analisi, 96 pozzetti | Costar | 3922 | |
| Siero bovino Albumina Sigma | Chemical Co | A2934-25G | |
| Centrifuga | Beckman Coulter | MicroFuge 18, 357160 | |
| Provette per campioni coniche | Dot Scientific Inc. | #711-FTG | |
| Applicatori con punta in cotone | Solon Manufacturing Co | 56200 | |
| Software di acquisizione dati | ADInstruments | LabChart Pro 7.0 | |
| Bilancia digitale | Denver Instrument | APX-4001 | |
| FITC-Inulina | Sigma Chemical Co | F3272-1G | |
| Spugne di garza | Covidien | 2146 | |
| Lettino chirurgico riscaldato | EZ-Anesthesia | EZ-212 | |
| Eparina | Sagnet | NDC 25021-402-10 | |
| HEPES | Sigma Chemical Co | H3375 | |
| Isoflurano | Abbott Animal Health | IsoFlo, 5260-04-05 | |
| Vaporizzatore di isoflurano | EZ-Anesthesia | EZ-190F | |
| Micro pinza da dissezione Strumenti di | ricerca biomedica Inc. | 70-1020 | |
| Lettore di micropiastre - Fluoroskan | ThermoScientific | Ascent FL, 5210460 | |
| NOVA 5+ Analizzatore di sodio/potassio | NOVA BioMedical | 14156 | |
| Portaaghi Olsen-Hegar con forbici | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| PE-190 (per catetere vescicale) | Trasduttore | di | |
| nbsp; | ADInstruments | MLT1199 | |
| Pyrex Provette di coltura | Corning Inc. | 99445-12 | |
| Catetere arterioso conico femorale di ratto | Applicazioni strategiche Inc. | RFA-01 | |
| Salix Furosemide 5% | Intervet | #34-478 | |
| Forbici per strabismo | Strumenti per le scienze | 14075-11 | |
| Forbici chirurgiche per studenti | Strumenti per le scienze fini | 91402-12 | |
| Guanti chirurgici | Kimberly-Clark | Sterling Guanti | |
| Pompa a siringa | Razel Scientific | R99-E | |
| Pinze per tessuti | Strumenti di scienza fine | 91121-12 | |
| Forbici per tessuti | George Tiemann Co | 105-420 | |
5-0 Sutura chirurgica in seta intrecciata Surgical Specialties Corp SP1033 Assay Plate, 96-Well Costar 3922 Albumina sierica bovina Sigma Chemical Co A2934-25G Centrifuga Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Provette per campioni coniche Dot Scientific Inc. #711-FTG Applicatori con punta in cotone Solon Manufacturing Co 56200 Software di acquisizione dati ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Scala Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulina Sigma Chemical Co F3272-1G Spugne di garza Covidien 2146 Letto chirurgico riscaldato EZ-Anesthesia EZ-212 Eparina Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurano Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Vaporizzatore di isoflurano EZ-Anesthesia EZ-190F Micro Dissecting Pincips Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Lettore di micropiastre - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Analizzatore di sodio/potassio NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Portaaghi con forbici Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (per catetere vescicale) Trasduttore di pressione 427435 BD Medical ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Catetere arterioso conico femorale di ratto Applicazioni strategiche Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Forbici per strabismo Strumenti per le scienze 14075-11 Forbici chirurgiche per studenti Strumenti per le scienze fini 91402-12 Guanti chirurgici Kimberly-Clark Sterling Guanti in nitrile Pompa a siringa Razel Scientific R99-E Pinze per tessuti Strumenti per le scienze fini 91121-12 Forbici per tessuti George Tiemann Co 105-420 |
Riferimenti
- Silverthorn, D. U. Human Physiology: An integrated approach. , Pearson. (2012).
- Hall, J. E. Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. , 303-344 (2011).
- Levey, A. S. Measurement of renal function in chronic renal disease. Kidney International. 38 (1), 167-184 (1990).
- Thurau, K., Valtin, H., Schnermann, J. Kidney. Annual Review of Physiology. 30, 441-524 (1968).
- Shannon, J. A., Smith, H. W. The excretion of inulin, xylose, and urea by normal and phoriziniaed man. Journal of Clinical Investigation. 14, 393-401 (1935).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Sterner, G., et al. Determining 'true' glomerular filtration rate in healthy adults using infusion of inulin and comparing it with values obtained using other clearance techniques or predictive equations. Scandinavian Journal of Urology and Nephrology. 42, 278-285 (2008).
- Toto, R. D. Conventional measurement of renal function utilizing serum creatinine, creatinine clearance, inulin and para-aminohippuric acid clearance. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 4 (6), 505-509 (1995).
- Matavelli, L. C., Kadowitz, P. J., Navar, L. G., Majid, D. S. Renal hemodynamic and excretory responses to intra-arterial infusion of peroxynitrite in anesthetized rats. Americam Journal of Physiology. 296, F170-F176 (2009).
- Davidson, W. D., Sackner, M. A. Simplification of the anthrone method for the determination of inulin in clearance studies. Journal of Laboratory, & Clinical Medicine. 62, 351-356 (1963).
- Symes, A. L., Gault, M. H. Assay of inulin in tissues using anthrone. Clinical Biochemistry. 8 (1), 67-70 (1975).
- Shalmi, M., Lunau, H. E., Petersen, J. S., Bak, M., Christensen, S. Suitability of tritiated inulin for determination of glomerular filtration rate. Americam Journal of Physiology. 260 (2 Pt 2), F283-F289 (1991).
- Denton, K. M., Anderson, W. P. Glomerular untrafiltration in rabbits with superficial glomeruli. EUropean Journal of Physiology. 419 (3-4), 235-242 (1991).
- Jobin, J., Bonjour, J. -P. Measurement of glomerular filtration rate in conscious unrestrained rats with inulin infused by implanted osmotic pumps. Americam Journal of Physiology. 248 (5 Pt 2), F734-F738 (1985).
- Lorenz, J. N., Gruenstein, E. A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin. Americam Journal of Physiology. 276 (1 Pt 2), F172-F177 (1999).
- Qi, Z., et al. Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. Americam Journal of Physiology. 286 (3), F590-F596 (2004).
- Bivona, B. J., Park, S., Harrison-Bernard, L. M. Glomerular filtration rate determinations in conscious type II diabetic mice. Americam Journal of Physiology. 300 (3), F618-F625 (2011).
- Rosen, S. M. Effects of anaesthesia and surgery on renal hemodynamics. British Journal of Anesthesiology. 44, 252-258 (1972).
- Cousins, M. J. Anesthesia and the kidney. Anaesthesia and intensive care. 11 (4), 292-320 (1983).
- Walter, S. J., Zewde, T., Shirley, D. G. The effect of anaesthesia and standard clearance procedures on renal function in the rat. Quarterly Journal of Experimental Physiology. 74, 805-812 (1989).
- Rieg, T. A. A high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice. Journal of Visualized Experiments. (75), (2013).
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Ristampe e permessi
