Viene fornito un protocollo per utilizzare un labirinto in campo aperto per accedere all'attività locomotoria generale, all'ansia e all'emotività in un modello murino di laboratorio.
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Articolo metodologico
L'uso del campo aperto Maze misurare Locomotore e ansia-come comportamento nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
I modelli animali si sono dimostrati preziosi per i ricercatori che cercano di rispondere a domande riguardanti i meccanismi del comportamento. Il labirinto a campo aperto è una delle piattaforme più comunemente utilizzate per misurare i comportamenti nei modelli animali. È un test veloce e relativamente facile che fornisce una varietà di informazioni comportamentali che vanno dalla capacità deambulatoria generale ai dati riguardanti l'emotività dell'animale in questione. Per quanto riguarda i modelli di roditori, la procedura consente lo studio di diversi ceppi di topi o ratti, sia allevati in laboratorio che catturati in natura. La tecnica si presta anche facilmente allo studio di diversi composti farmacologici per effetti ansiolitici o ansiogeni. Qui, viene dettagliato un protocollo per l'uso del labirinto in campo aperto per descrivere i comportamenti dei topi e viene eseguita una semplice analisi delle capacità locomotorie generali e dei comportamenti emotivi legati all'ansia tra due ceppi di topi C57BL/6. In breve, utilizzando il protocollo descritto, mostriamo che i topi Wild Type hanno mostrato comportamenti significativamente meno correlati all'ansia rispetto ai topi Knock Out di pari età, mentre entrambi i ceppi hanno mostrato capacità ambulatoriali simili.
Introduzione
Il labirinto a campo aperto (OFM) è stato inizialmente sviluppato nel 1934 come test per misurare l'emotività nei roditori1. Ha raggiunto lo status di essere una delle misure di comportamento più utilizzate nella psicologia animale2. Fornisce una valutazione facile e abbastanza rapida di comportamenti ben definiti che non richiedono alcuna formazione per il soggetto del test e poca o nessuna formazione specializzata per l'essere umano che somministra il test. Questi attributi hanno portato a un uso diffuso del labirinto in campo aperto nella ricerca estesa ad altre specie animali come vitelli, maiali, conigli, primati, api mellifere e aragoste3. Parte della sua popolarità deriva dal fatto che i concetti psicologici e fisiologici alla base dei test sono generalmente semplici e ben compresi. Ad esempio, è stato postulato che le forze evolutive hanno selezionato una risposta comune negli animali in modo tale che la maggior parte delle specie mostri una paura mediata dall'ansia o risposte di fuga a stimoli specifici. I roditori, ad esempio, mostrano una netta avversione per gli ambienti grandi, illuminati, aperti e sconosciuti4. Possiamo presumere che siano stati filogeneticamente condizionati a vedere questi tipi di ambienti come pericolosi. Tutte queste caratteristiche sono incorporate nel labirinto in campo aperto e costituiscono la base del suo utilizzo nei test di paradigmi comportamentali.
Un labirinto in campo aperto consiste in un'area chiusa da un muro di altezza sufficiente per impedire al soggetto di fuggire. Le forme tipiche del labirinto sono circolari o quadrate con un'area sufficientemente grande, in base alle dimensioni del soggetto testato, da suscitare una sensazione di apertura al centro del labirinto. Un certo numero di variabili può essere valutato nel labirinto in campo aperto con la maggior parte dei parametri che coinvolgono diversi tipi di attività motoria2. La deambulazione è il comportamento più comune studiato, ma ne possono essere misurati anche altri, come la latenza o l'allevamento. Molto spesso, il comportamento dei roditori viene analizzato in un labirinto spoglio. Tuttavia, l'aggiunta di oggetti, uno o più al pavimento del labirinto, aggiunge la capacità di vedere come il soggetto interagisce con nuovistimoli aggiuntivi. I parametri rilevanti quando gli oggetti vengono presentati sono in genere il numero di approcci a un oggetto o, in alcuni casi, la preferenza o l'avversione per un oggetto rispetto a un altro.
Molti test comportamentali dell'ansia si basano sull'attività corporea e sulla locomozione dell'animalein questione 5. L'interpretazione dei test comportamentali per l'emotività separando i fattori confondenti non emotivi, come l'attività motoria, è stata oggetto di un intenso dibattito6,7. Come l'OFM è stato originariamente descritto, si possono dedurre due misure dell'emotività, l'attività locomotoria e i depositi di boli fecali o defecazione1. Tuttavia, in alcuni studi è stato dimostrato che queste due misure non sono correlate, supportando la conclusione che l'emotività nei roditori è multidimensionale5. Indipendentemente da ciò, le discrepanze nella letteratura riguardo a queste misure e all'emotività o all'ansia nei modelli murini possono essere attribuite a differenze nei criteri di analisi o nelle procedure di test. Gli studi hanno collegato in modo conclusivo i risultati dell'analisi OFM con altre misure dell'ansia durante il confronto di modelli murini8.
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Protocollo
NOTA: Tutte le procedure eseguite qui sono stati presentati ed approvati dalla IACUC (Office of Research Compliance) e sono state condotte seguendo le linee guida NIH. I topi utilizzati nel paradigma comportamentale di prova erano ingenui e non utilizzati per altri test. Il C57BL / 6 wild type e Knock Out topi utilizzati in questo protocollo sono stati descritti in precedenza 9 e i dati qui presentati sono da quel manoscritto.
1. Preparazione della Sala Prove e campo aperto Apparatus
- Utilizzare un'unità multipla campo aperto labirinto (OFM), composto da quattro camere di attività è stato utilizzato per questa analisi (Figura 1). Ogni camera misura 50 cm (lunghezza) x 50 cm (larghezza) x 38 cm (altezza) e si è fatto da alta densità bianco e plastica non porosa.
- Texture i pavimenti del labirinto per la trazione durante la deambulazione, mentre le pareti del labirinto erano lisce. Quadranti Maze erano completamente vuoto ai fini di questa prova. In considerazione del resto di questo protocol, un solo quadrante del labirinto sopra descritto sarà utilizzato per dimostrare la OFM.
- Pulire la camera con etanolo 95% prima dell'uso e prima prove successive per rimuovere eventuali tracce di profumo lasciate dal mouse precedente soggetto.
- Lasciare che l'etanolo di evaporare completamente prima di testare i topi. Questa operazione potrebbe richiedere 5-10 minuti tra ogni sessione di test.
- Per questa analisi, utilizzare il software SMART Video inseguimento da PANLAB / Harvard Apparatus per registrare e valutare il movimento del mouse.
NOTA: Qualsiasi commerciale telecamera di monitoraggio video e software possono essere utilizzati per seguire il soggetto di prova e valutare i risultati del labirinto campo aperto. E 'molto importante per l'utente finale di capire come calibrare ed eseguire il software utilizzato per ogni singola analisi. Indipendentemente dalla telecamera e software di monitoraggio utilizzato, i risultati migliori si ottengono quando la telecamera ed il software sono calibrati correttamente secondo le istruzioni del produttore. - Eseguire l'i testlivello na illuminata sala capace di contenere l'apparato labirinto e il computer richieste per eseguire il software. Sospendere la videocamera sopra il labirinto sia collegandolo al soffitto o utilizzando qualsiasi sistema di supporto elevata che consente l'obiettivo della fotocamera per vedere l'intera area labirinto (figura 2).
- L'amministratore umano del test, assicurarsi di avere abbastanza spazio in camera per essere completamente inosservabile dai soggetti di prova nel labirinto in modo da non influenzare il comportamento dei topi.
2. Preparare il software per misurare l'attività
- Aprire il software Video monitoraggio.
- Una volta che il software è aperto, spostare il cursore sull'opzione "tracciamento singolo soggetto" che si trova nella scheda "Data Acquisition" e solo clic per aprire questa opzione.
- Scegliere l'opzione "sfondo statico" che si trova nella parte inferiore dello schermo.
- Dopo aver scelto "sfondo statico" è scelton, è necessario utilizzare il software per prendere un'immagine del labirinto prima dell'aggiunta dei soggetti di prova. Per fare questo, spostare il cursore sul pulsante "Foto" situato nella parte inferiore dello schermo e click.
NOTA: Il software scattare una foto dello scenario senza che il soggetto di prova che verrà sottratto l'immagine scattata durante il processo di monitoraggio. Ciò comporta solo il movimento del soggetto analizzata dal software. - Verificare che l'immagine di sfondo presa sopra viene completamente rimosso dal software di monitoraggio spostando il cursore sul pulsante "Test" situato nella parte inferiore dello schermo e facendo clic una volta. Un campo bianco solido viene visualizzato se l'immagine di sfondo è completamente rimosso dall'immagine inseguimento. Se le condizioni di luce cambiano o il labirinto sono accidentalmente mossi, vedrete nere "ombre" in questo campo indicando le due immagini non perfettamente coincidenti. Per rimediare a questa situazione, è sufficiente ripetere step 2.4.
- Dopo la conferma delle impostazioni di fondo, utilizzare l'opzione Timing per configurare il modo in cui il tempo è controllato durante l'acquisizione. Per fare questo, spostare il cursore nella scheda "Configurazione" e fare clic una volta sulla voce "Tempi". Utilizzare la finestra appena aperta per immettere i parametri sperimentali.
- Per questo protocollo, ha scelto l'opzione "tempo programmato" da 10 minuti periodo di monitoraggio. Impostare "periodo di latenza" per 5 secondi per consentire all'utente il tempo di posizionare il mouse al centro del labirinto e allontanarsi prima dell'inizio del monitoraggio. Inserire il "tempo di acquisizione" di 10 min per la durata della prova. Impostare il "Stop di controllo" impostato su "Quando il tempo programmato (10 min) è finita", che spegne automaticamente la fotocamera e la funzione di monitoraggio del software.
- Spostare il cursore sul pulsante "Chiudi" dopo che tutti i tempi sono stati impostati per chiudere la finestra. Ora siete pronti per iniziare il testing procedura.
3. Gestione della Open Field Test
NOTA: Il pacchetto software utilizzato in questo protocollo permette l'inseguimento di fino a 16 topi individuali in una sola volta. Per facilitare la compilazione e come menzionato sopra, il protocollo qui discusso è per un singolo mouse utilizzando un singolo quadrante del OFM. Per le attrezzature in uso per questo protocollo, un massimo di 4 topi individuali potrebbe essere rintracciato con ogni quadrante del labirinto. Se utilizzando un labirinto multi-recinto, dopo aver piazzato il primo mouse soggetto nel suo quadrante definito, posizionare i restanti topi nel loro rispettivo quadrante labirinto per il monitoraggio di analisi. Ai fini del presente protocollo, ulteriori istruzioni sarà specifico di un singolo quadrante del labirinto.
- Portare i topi nelle loro gabbie a casa dalla loro camera alloggio nella stanza di prova. Lasciare i topi si adatti alla camera procedimento per almeno 30 minuti prima di iniziare il test.
- Rimuovere un singolo mOuse dalla gabbia di casa afferrando delicatamente la coda e posizionare il mouse in mezzo al labirinto campo aperto, mentre contemporaneamente l'attivazione del software SMART facendo un solo clic sul pulsante Start per iniziare a tracciare i movimenti del mouse. È normale che il mouse per spostare immediatamente alle pareti periferia del labirinto e la tempistica di rilascio e monitoraggio cattura del mouse dovrebbe coincidere per registrare questo movimento.
- Lasciare libera e ininterrotta del mouse soggetto durante l'rispettivo quadrante del labirinto per un singolo periodo di 10 minuti durante il quale, il software di monitoraggio registrerà movimento (Figura 3).
- Al termine del periodo di prova, prendere il topo soggetto delicatamente, rimuovendolo dal labirinto e tornare alla sua gabbia casa.
- Prima di pulire il labirinto, conta visivamente il pellet Boli fecali presenti nel labirinto e manualmente registrare i numeri per ulteriori analisi.
- Rimuovere tutti i pellets fecali e pulire tutte le macchie di minzione. Spruzzare il pavimento e le pareti del quadrante labirinto con il 95% di etanolo e pulire con un tovagliolo di carta pulito. Lasciare la soluzione di etanolo si asciughi completamente prima di testare altri topi.
- Ripetere la procedura con il prossimo mouse.
4. Misura e Analisi di comportamento durante Procedura di test
NOTA: Per la misura, tre aspetti del comportamento in campo aperto sono prontamente caratterizzate con questo protocollo (vedi la discussione). Una breve istruzioni su come accedere a queste misure nel software di monitoraggio video segue.
- Dalla schermata principale del software SMART, spostare il cursore sulla scheda "Zone" e click "Definition" per aprire il Zone Editor.
- Seguire le istruzioni dettagliate nel manuale d'uso del software SMART di non definire zone o griglie di sovrapporre sui sentieri di monitoraggio. Qui, il software è stato utilizzato per definire una griglia 5 x 5 di 10 cm quadrati che coprono il pavimento del labirinto ( Figura 4). Assicurarsi di salvare il file di zona creati prima di chiudere il Zone Editor.
- Dalla schermata principale del software SMART, spostare il cursore sulla scheda "Analysis" e solo clic per aprire la finestra di analisi dei dati.
- Spostare il cursore sulla scheda "File" e aprire il file di zona creato in precedenza.
- Spostare il cursore sulla scheda "Configurazione" e aprire l'opzione "Analisi Track". Si aprirà la finestra "Configurazione analisi singolo soggetto".
- Spostare il cursore sulla scheda "Standard" e passare il parametro "distanza percorsa" dalla casella Parametri disponibili (lato sinistro) alla casella Parametri Incluso (lato destro).
- Spostare il cursore sulla scheda "Zone Transitions" e spostare tutti i parametri appropriati per il dialogo Parametri Incluso come sopra.
- Assicurarsi che la casella "Full Track" è selezionata nella parte inferiore della finestra.
- Momentove il cursore sul pulsante OK e chiudere la finestra di configurazione di analisi singolo soggetto.
NOTA: In base all'analisi che si desidera eseguire, molte altre opzioni possono essere scelti in questa finestra di dati miniera dall'analisi. Leggere il Manuale utente dettagliata del vostro programma specifico per determinare quali parametri sono più importanti per l'analisi dei dati.
- Nella scheda File in alto a sinistra della finestra del programma, aprire la finestra singola pista soggetto e mettere un segno di spunta accanto a tutte le tracce in corso di analisi. Spostare il cursore sul pulsante segno di spunta nella parte superiore della finestra e fare clic per chiudere la finestra Traccia Explorer.
- Spostare il cursore sul pulsante "Go" nella finestra di analisi dei dati e solo clic per avviare l'analisi dei dati della traccia.
- I dati di analisi possono essere emessi sia come file di testo ASCII o può essere esportato direttamente in un foglio Excel. Utilizzare gli strumenti di uscita del programma software che si sta utilizzando per l'uscita data per uso personale.
NOTA: la distanza totale percorsa e il tempo trascorso in zone indicate verrà emesso seguendo la procedura di analisi dei dati di cui sopra. Anche in questo caso, si sottolinea che le misure per raggiungere queste misure rappresentate qui sarà diverso a seconda del software utente utilizzato. Ma i dati stessi e l'interpretazione dei risultati dovrebbero essere simili indipendente dal programma software utilizzato. E 'anche interessante notare che pregiudizi amministratore di prova viene rimosso da questo protocollo, come tutti i dati raccolti è quantificato dati misurati dal software e non l'amministratore. Quindi non vi è alcun elemento qualificabile per i dati raccolti come descritto.
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Risultati
Il numero medio di individui per ceppo di topi testati nella maggior parte dei casi, è di circa il 20 per generare rilevanza statistica sufficiente. Tuttavia, questo numero può essere compreso nell'intervallo di 8-30 a seconda della disponibilità mouse. A seconda della misura o comparazioni richiesto, è anche favorevole utilizzare soggetti di pari età.
Il primo e forse più importante parametro specifico per misurare in campo aperto Maze è la distanza totale ambulatoriale. Mentre l'un...
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Discussione
Il Campo Aperto Maze è una delle piattaforme più utilizzate in studi comportamentali su animali. Un certo numero di importanti parametri convenzionali e comportamentali 2,4 possono essere raccolti e analizzati durante l'esecuzione del OFM. Questi dati permettono al ricercatore di misurare i comportamenti che vanno dall'attività locomotoria generale di ansia legati comportamenti emotivi 8. Tuttavia, l'uso di OFM non è priva di difetti. Un problema di confusione è la vasta gamma di variab...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Health (NIH-2RO1NS033661) e dall'Alabama Agricultural Experiment Station (HATCH ALA021-1-09017).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Test in campo aperto multi-unità | San Diego Instruments, Inc. | Bianco 7001-0354 | È possibile utilizzare qualsiasi labirinto in campo aperto a unità singola o multipla |
| Software di tracciamento SMART DT Apparecchio | PanLab/Harvard | 76-0695 | Qualsiasi software di tracciamento può essere utilizzato con questo protocollo |
| Registratore per videocamera Sony 990x | Sony | CCD-TRV328 | Qualsiasi videocamera adatta può essere collegata al computer per la registrazione dei profili di tracciamento. |
Riferimenti
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