Method Article

Barcoding genetica con proteine ​​fluorescenti per applicazioni multiplexati

DOI:

10.3791/52452

⸱

April 14th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, San Diego State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dalla scoperta del gene della proteina fluorescente verde, le proteine fluorescenti hanno avuto un impatto sulla biologia cellulare molecolare. Questo protocollo descrive come l'espressione di proteine fluorescenti distinte attraverso l'ingegneria genetica viene utilizzata per il barcoding di singole cellule. La procedura consente di tracciare popolazioni distinte in una miscela di cellule, ideale per applicazioni multiplexate.

Abstract

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Le proteine fluorescenti, i coloranti fluorescenti e i fluorofori in generale hanno rivoluzionato il campo della biologia cellulare molecolare. In particolare, la scoperta delle proteine fluorescenti e dei loro geni ha permesso l'ingegnerizzazione di fusioni proteiche per la localizzazione, l'analisi dell'attivazione trascrizionale e della traduzione di proteine di interesse, o il tracciamento generale di singole cellule e popolazioni cellulari. L'uso di geni proteici fluorescenti in combinazione con la tecnologia retrovirale ha ulteriormente permesso l'espressione di queste proteine nelle cellule di mammifero in modo stabile e affidabile. Qui viene mostrato come si possono utilizzare questi geni per dare alle cellule all'interno di una popolazione di cellule la propria biofirma. Poiché la biofirma viene ottenuta con la tecnologia retrovirale, le cellule vengono codificate con un codice a barre "a tempo indeterminato". In quanto tali, possono essere tracciati individualmente all'interno di una miscela di cellule con codice a barre e utilizzati in applicazioni biologiche più complesse. Il tracciamento di popolazioni distinte in una miscela di cellule è ideale per applicazioni multiplex come la scoperta di farmaci contro una moltitudine di bersagli o il profilo di attivazione di diversi promotori. Il protocollo descrive come sviluppare e amplificare elegantemente le cellule di mammifero con codice a barre con marcatori genetici fluorescenti distinti e come utilizzare più marcatori contemporaneamente o un marcatore a diverse intensità. Infine, il protocollo descrive come le cellule possono essere ulteriormente utilizzate in combinazione con saggi basati su cellule per aumentare la potenza di analisi attraverso il multiplexing.

Introduction

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Tecnologie come spettroscopia di fluorescenza, microscopia a fluorescenza e citometria a flusso, tutti si basano su di fluorescenza, una proprietà ampiamente sfruttato in applicazioni biochimiche, biomediche, e chimici. Fluorescenza, sia intrinseca o tramite l'etichettatura, è stata sfruttata per l'analisi dei pattern di espressione di proteine ​​e profili, destino cellulare, interazioni proteina e le funzioni biologiche 1-9, e attraverso di fluorescenza / Förster trasferimento di energia di risonanza per la rivelazione di interazioni biomolecolari e cambiamenti conformazionali 10-13. Dal momento che l'isolamento del victoria proteina fluorescente verde Aequorea (GFP) 14, la scoperta di proteine ​​fluorescenti aggiuntivi presenti in natura provenienti da altri cnidari, in particolare i coralli, ha ampiamente aumentato il numero di proteine ​​fluorescenti esistenti con spettri di eccitazione / emissione distinguibili. Questi, insieme con l'introduzione di mutazioni nei loro geni 15-19, HAVe ulteriormente ampliato le possibilità, ottenendo una vera tavolozza di proteine ​​fluorescenti a disposizione degli scienziati che sfruttano la microscopia, citometria a flusso e altre tecnologie basate sulla fluorescenza per le loro ricerche.

In parallelo, anche se in maniera indipendente, lo sviluppo della tecnologia ha drasticamente retrovirale facilitato l'espressione stabile di informazioni genetiche ectopica in cellule di mammifero 20-23. Non è quindi sorprendente che questa tecnologia è stata utilizzata per trasferire geni di proteine ​​fluorescenti in un ampio numero di tipi di cellule e tessuti 24-28 o per la produzione di animali transgenici 29-31. Seguendo la natura dei retrovirus, l'informazione genetica della proteina fluorescente ectopica viene introdotto all'interno del genoma della cella 32 e la cella diventa fluorescente `per ever'. La struttura, ha permesso il monitoraggio del destino delle cellule, o di una singola cella all'interno di una popolazione di cellule. La cella ora fluorescente così acquicolore rosso proprio BioSignature e può essere definito come codice a barre. La sua unica BioSignature identifica da altre cellule, e, soprattutto, la distingue dalle cellule geneticamente manipolate per esprimere proteine ​​fluorescenti diversi con spettri di assorbimento / emissione distinguibili. Applicazioni biologiche quali il monitoraggio dei fattori di riprogrammazione verso pluripotency 33, l'analisi dei fattori subnucleari per la delucidazione della localizzazione nucleolare 34, la costruzione dei plasmidi reporter fluorescenti per studi trascrizionali 35 o l'etichettatura genetica dei neuroni per lo studio di architettura di rete neuronale 36 , sono solo quattro esempi dei molti che hanno sfruttato diversi geni di proteine ​​fluorescenti per lo stesso apparato sperimentale.

La citometria a flusso è stato ampiamente utilizzato per l'analisi dei processi biologici a livello di singola cellula, come l'espressione genica, ciclo cellulare, apoptosi, e segnalazione attraverso fosforilzione 37-43 .Il espressione stabile di geni di proteine ​​fluorescenti in cellule di mammifero ha ulteriormente migliorato l'utilità di citometria a flusso per l'analisi delle cellule 38,44 e ligando-recettore interazioni 45. Capacità avanzate hanno permesso di citometria a flusso per diventare una metodologia ampiamente utilizzata per high-throughput e alto contenuto di screening 46. Nonostante il numero ampliato di fluorometers e robotica tecnologie che possano sistemi per la lettura paio piastre, imaging e citometria a flusso, sembra che ci sia una mancanza di disegno sperimentale che può sfruttare e montare queste capacità tecnologiche avanzate.

Metodologie basate sulle cellule veloci, affidabili, semplici e robuste sono drasticamente necessari per le applicazioni canalizzate che migliorano ulteriormente la capacità high-throughput. Questo è particolarmente vero nel campo della scoperta di farmaci in cui saggi cellulari di ingegneria in un formato multiplex può migliorare la potenza di high-throughput di screening 39,47-50 . Multiplexing, in quanto permette analisi simultanee in un campione, migliora ulteriormente le funzionalità high-throughput 51-54. Barcoding genetica fluorescente permette non solo elegante multiplexing, ma anche, una volta costruito, elude la necessità di protocolli in termini di tempo, riduce i costi accompagnate da anticorpi, perline e macchie 39,52,55, e può ridurre il numero di schermi necessari per alto applicazioni di throughput. Abbiamo recentemente descritto come la tecnologia può migliorare retrovirale multiplexing attraverso barcoding genetica fluorescente per applicazioni biologiche, esprimendo un test precedentemente sviluppato per monitorare HIV-1 proteasi 56,57 con diverse varianti clinicamente prevalenti 58. La metodologia è illustrata in modo più descrittivo concentrandosi su come selezionare e amplificare le celle a barre geneticamente fluorescenti e come produrre pannelli di popolazioni clonali che esprimono proteine ​​fluorescenti distinte e / o diversa intensit fluorescenzaIES. Pannelli di popolazioni di cellule distinguibili in base alle loro caratteristiche fluorescenti aumentano funzionalità multiplexing, che possono essere ulteriormente sfruttati in combinazione con saggi cellulari che affrontano diverse questioni biologiche. Il protocollo inoltre descritto come ingegnere di un gruppo di cellule con codice a barre che recano uno dei saggi cellulari precedentemente sviluppate in laboratorio, come ad esempio 59. Questo protocollo non è quindi lo scopo di mostrare la consolidata tecnologia retrovirale / lentivirali per il trasferimento genetico, il valore delle proteine ​​fluorescenti o le applicazioni di citometria a flusso 60,48 ma piuttosto per mostrare la potenza migliorando di combinare tre per le applicazioni canalizzate.

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Protocol

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1. Preparazione di cellule di mammifero, produzione virale e trasduzione per codici a barre genetico

  1. Tavola 2.5 x 10 6 cellule aderenti in un piatto di 10 cm (o intorno 50-60% confluenza) un giorno prima di trasfezione in Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) con siero di vitello fetale del 10% (FCS). Per retrovirale uso di produzione imballaggi linea cellulare di scelta, come Phoenix-GP (un gentile dono da Gary Nolan, Stanford University).
    NOTA: La linea cellulare di packaging esprime stabilmente Gag e Pol proteine ​​per la formazione di particelle retrovirali in trans. Assicurarsi cellule sono sani e aderito alla piastra in un monostrato, prima trasfezione.
  2. 24 ore più tardi, preparare la miscela di trasfezione DNA.
    1. Per 125 ml di DMEM senza siero aggiungere 3 g Busta Virus stomatite vescicolare vettore glicoproteina (PCI-VSVG) e 3 mg di trasferimento vettore che trasporta il gene della proteina fluorescente di interesse. Mescolare e aggiungere 15 ml di polyethylimine (2 mg / ml).
    2. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 15 min e aggiungere alle cellule goccia a goccia.
      NOTA: Polyethylimine viene aggiunto alla miscela omogenea DNA come reagente di trasfezione per la formazione di polyplexes. Al fine di ottenere particelle virali che trasportano diversi marcatori proteici fluorescenti, eseguire ogni trasfezione indipendentemente con il marcatore di scelta. Ricordate che il trasferimento vettore retrovirale è di circa 7 Kb di lunghezza e non può essere confezionato se superiori a 10 kb.
  3. Incubare le piastre a 37 ° C. Per aumentare virali Consiglio produzione piastre a 30 ° C invece o 32 ° C.
    NOTA: 24 mezzi trasfezione hr postali possono essere sostituiti con 7 ml di mezzi freschi, e anche se questo può migliorare la salute delle cellule che possono diminuire la carica virale nel surnatante.
  4. 48 ore dopo la trasfezione raccogliere le particelle virali-surnatante contenente e filtrare con un filtro da 0,45 micron politetrafluoroetilene. Utilizzare surnatante virale raccolto di recente per la trasduzione. Othaltri- mantenere surnatante in aliquote a -80 ° C ed evitare di gelo-disgelo. Ricorda che titolo virale diminuirà probabilmente fino al 50% con ogni ciclo di congelamento-scongelamento.
  5. Linea cellulare Piatto di scelta 24 ore prima della trasduzione se aderenti, o immediatamente prima trasduzione se non aderente. Seed 2.0 x 10 5-3,0 x 10 5 cellule aderenti (qui Huh 7.5.1 e HEK 293T) o 5,0 x 10 5 a 1 x 10 6 cellule non aderenti (qui SupT1) per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti.
    NOTA: Assicurarsi di calibrare il numero di cellule per essere seminati prima trasduzione, specialmente per cellule aderenti, cellule così raggiungere una confluenza di circa il 60% al momento della trasduzione.
  6. Aggiungere 5 mg / ml Polybrene (hexadimethrene bromuro) a cellule seminate e poi aggiungere surnatante virale precedentemente raccolti per ottenere intorno al 20-40% di infezione (qui 2 ml).
    NOTA: Il MOI o la percentuale di infezione è in gran parte arbitraria, in quanto l'ordinamento consente di amplificare qualsiasi subpopulatione delle cellule. Ovviamente, un più alto tasso di infezione facilita e velocizza il processo di amplificazione.
  7. Trasdurre cellule mediante centrifugazione in un rotore secchio appeso a 1.500 xg per 120 min a 32 ° C. Risospendere le cellule non aderenti con mezzi freschi prima dell'incubazione. Per le cellule aderenti, sostituirlo con fresco supporti 24 ore post-trasduzione.
    NOTA: Si raccomanda di sigillare le piastre prima della centrifugazione con parafilm per evitare fuoriuscite sopra. Per aumentare la diversità delle cellule geneticamente con codice a barre, trasdurre cellule con particelle virali che trasportano le proteine ​​fluorescenti diversi (ottenuti dal punto 1.4). Quando si sceglie marcatori fluorescenti, assicurarsi che siano compatibili con la strumentazione e hanno parametri fluorescenti distinguibili.

2. Selezione e Amplificazione delle Cellule geneticamente con codice a barre

  1. Analizzare le cellule di mammifero trasdotte mediante citometria di flusso di almeno 72 ore dopo la trasduzione per quantificare la percentuale di trasduzione. Utilizzare una linea paragonabile cellule non trasdotte come controllo negativo.
    NOTA: Come ordinamento verrà utilizzata per purificare singole popolazioni cellulari a barre, una percentuale elevata di trasduzione iniziale, mentre non necessario, dovrebbe accelerare il processo di amplificazione.
  2. Utilizzare la cellula-sorter di scelta per ottenere le cellule che esprimono la proteina di interesse.
    1. A tal fine, verificare le porte siano impostati correttamente nei canali giusti.
      1. Per fare ciò utilizzare la stessa linea cellulare naive come controllo negativo e impostare la tensione parametro / canale in modo che la popolazione negativo è inferiore al valore di 10 3 su ciascun asse fluorescente. Determinare gating per fluorescenza positiva come eventi che appaiono sopra quella del controllo negativo per ciascun canale fluorescente.
    2. Essere consapevoli del fatto che ogni strumento può variare e la tensione corretta per determinare gating deve essere adeguato di conseguenza, rendendo i controlli positivi e negativi in ​​ogni imperativi expinstallazione erimental.
      1. Per il rilevamento della fluorescenza in questo setup sperimentale utilizzare il canale FITC (530/30 filtro passa banda proceduto da una lunga filtro passa 502) per eGFP, il canale di PE (585/42 filtro passa banda proceduto da un filtro 556 passaggio lungo) per td Tomato , e il canale di APC (660/20 filtro passa banda) per E2 Crimson.
        NOTA: Il laser 488 nm eccita eGFP e td pomodoro mentre E2 Crimson è eccitato dal laser 633 nm.
  3. Ordina in 15 ml provette coniche con 1 ml di 100% FCS.
    NOTA: Il processo di smistamento popolazioni di cellule fluorescenti non è obbligatoria, come si può procedere direttamente con il tipo di singoli cloni (vedi sotto). Ordinamento popolazioni strette basate sulla fluorescenza scelta garantisce una popolazione di backup per la futura selezione dei singoli cloni. Tenere presente che le cellule individuali sono talvolta difficili a crescere, mentre una grande popolazione di cellule può essere facilmente congelato, e poi scongelato e amplificato in una fase successiva.
  4. Spin giù per le popolazioni ordinati in un rotore di centrifuga appeso secchio a 524 g a 32 ° C per 5 minuti per far sedimentare le cellule. Risospendere in 1 ml di mezzi freschi, e ri-piastra cellule in modo che confluenza cella è inferiore al 60% per consentire la crescita e la divisione per almeno due giorni.
    1. Ad esempio, piastra cellule aderenti a circa 3 x 10 5 cellule in 2 ml di media per bene in un 6-pozzetti e 2 x 10 6 cellule in 2 ml di media in un 6 centimetri. Utilizzare DMEM per cellule aderenti e RPMI per le cellule non aderenti (o qualsiasi supporto specificato, se necessario). Inserire cellule piastrate in un incubatore a 37 ° C per diversi giorni per consentire l'amplificazione.

3. Ottenere clonali popolazioni di cellule geneticamente con codice a barre a diverse intensità

  1. Ottenere popolazioni clonali di cellule originariamente trasdotte (punto 1.7) o dalla popolazione ordinata (punto 2.3).
    NOTA: Ciò garantirà livello uguale o simile di espressione proteina fluorescente fra tutti la cellas all'interno della popolazione (una popolazione stretto con una piccola CV in media intensità di fluorescenza di fino al 40%).
    1. A tal fine, le cellule singole specie in piastre da 96 pozzetti con una unità di deposizione delle cellule automatizzato (ACDU). Set porte per l'ordinamento in base alle popolazioni di interesse. Assicurarsi che cancelli sono fissati almeno un log scala a parte per ottenere popolazioni distinguibili quando si sceglie cellule a diverse intensità di fluorescenza. Per la procedura qui illustrato, utilizzare la stessa citofluorimetria sperimentale impostato come quello descritto nel passaggio 2.2.
  2. Amplifica singoli cloni in un incubatore a 37 ° C per almeno 2 settimane. Attraverso il processo di amplificazione analizzare le cellule sotto il microscopio per garantire che le popolazioni crescenti derivano da singole cellule e non da più di uno.
    NOTA: Ricordare che la selezionatrice inserirà una cella per pozzetto in media, e mentre alcuni pozzetti non possono avere qualsiasi cella affatto, altri possono avere più di una.
    1. Per garantire che un popopo- deriva da una cellula sola, essere estremamente gentile con la piastra e non disturbare i pozzetti pipettando. Osservare la piastra, così da bene, al microscopio.
      NOTA: Mentre le cellule individuali possono a volte essere difficili da identificare, una volta che iniziano dividendo che sarà facilmente riconoscibile.
    2. Essere consapevoli del fatto che spesso cellule 'gruppo' lungo i bordi. Eliminare quei pozzi, dove si possono osservare diverse popolazioni clonali e mantenere quelle che hanno una popolazione stretto.
      NOTA: Si consiglia di trasferire in piastre quelli più grandi per l'amplificazione.
  3. Schermo popolazioni clonali putativi analizzando loro mediante citometria a flusso. Confronta loro di un controllo negativo utilizzando la stessa citometria a flusso setup sperimentale.
    1. Analizzare solo una percentuale del campione e mantenere il resto come backup. Scegli le popolazioni più nettamente separati in base intensità media e la tenuta della popolazione. Amplificarli come necessario o congelare le scorte incongelamento supporti con 20% glicerolo a -80 ° C per brevi periodi di tempo o azoto liquido per più.
      NOTA: Ricordate che un 'vero' popolazione clonale dovrebbe avere un modello di fluorescenza molto stretto.

4. Garantire capacità multiplexing per High Throughput Screening (HTS)

  1. Combinare come molte popolazioni clonali distinte come necessario che può essere ulteriormente utilizzato in un formato multiplexati. Scegli cloni con distinguibile assorbimento / spettri di emissione e / o intensità diverse. Se viene utilizzato un formato di piastra a 96 pozzetti, che è adatto per HTS, seme 50.000 cellule in 200 microlitri per pozzetto.
    NOTA: tenere presente che il numero di cellule è solo una stima e può variare in base a tipo cellulare e se è aderente o meno.
  2. Analizzare il campione usando citometria a flusso per garantire che ciascuna delle linee cellulari fluorescenti indipendenti stabiliti possono essere distinte tra loro. Prima dell'analisi preparare negativee controlli singoli colori per impostare i parametri ei valori di compensazione.
    NOTA: L'impostazione dei parametri per distinguere chiaramente le popolazioni miste li permetterà di essere ulteriormente utilizzato in un formato multiplex.

5. Adattare linee cellulari geneticamente con codice a barre per l'applicazione biologica della scelta

  1. Trasdurre stabilite linee cellulari geneticamente di codici a barre con particelle virali che contengono gli elementi di analisi di scelta, come descritto qui in Stolp et al., 2013 59. Ricordare che il saggio di scelta dovrebbe occupare un canale fluorescente aggiuntivo e distinguibili e quindi deve essere trasferito alla linea cellulare appropriata codice a barre.
    NOTA: Ogni linea cellulare codice a barre può sopportare un test diverso.
  2. Celle a barre Ordina geneticamente fluorescenti per quelli che contengono elementi di analisi.
    NOTA: Elementi test può essere progettati accoppiato ad un tag o proteina fluorescente (come una fusione o tramite un sito di entrata ribosoma interna) fo il rilevamento diretto attraverso western blotting, citofluorimetria e microscopia. Il sistema utilizzato in questo protocollo si basa su HA espressione di superficie epitopi da solo, o con l'aggiunta di espressione FLAG epitopi.
    1. Colorare le popolazioni clonali contenenti i test con gli anticorpi accoppiati HA e APC-modo fluorescente. Poi analizzare le popolazioni clonali con anti-FLAG e FITC-coniugato colorazione anticorpi.
    2. Per rintracciare il test, analizzare o 'decodificare' le popolazioni del canale appropriato caso è possibile distinguere le linee cellulari geneticamente distinte di codici a barre. Qui, decodificare la natura del substrato analizzando nel canale PE per td rilevamento pomodoro.

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Results

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Multiplexing fluorescenti geneticamente codice a barre cellule a fini di applicazioni biologiche possono essere realizzati solo dopo che siano stati generati singole popolazioni clonali. Multiplexing è più efficace quando le popolazioni di codici a barre hanno caratteristiche distinte fluorescenti nitide con il minimo sovrapposizione spettrale. L'esempio illustrato nella figura 1 con popolazioni clonali di cellule di mammifero SupT1 illustra che le cellule a barre con mCherry e proteina fluorescente cia...

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Discussion

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Qui sono stati combinati due procedure consolidate; l'ingegneria genetica attraverso la tecnologia retrovirali e l'individuazione di proteine ​​fluorescenti che utilizzano citometria a flusso. Codici a barre a base di proteine ​​fluorescenti genetica per la produzione di linee cellulari uniche fornisce un modo semplice e affidabile per applicazioni multiplex. Generazione di codici a barre cellule geneticamente modificate attraverso la tecnologia retrovirale, è inizialmente un processo lungo, ma permette di otten...

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorremmo ringraziare il Dott Garry Nolan dalla Stanford University per la fornitura della linea cellulare di packaging Phoenix GP per la produzione di particelle retrovirali. Ringraziamo il Dr. Roger Tsien presso l'Università della California a San Diego per la fornitura di td Tomato. Vorremmo anche ringraziare il Fondo San Diego State University Citometria a flusso di base per il loro servizio e aiuto.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Siringhe da 10 mlBD309604utilizzate per filtrare il virus
0,45 µ m ploytetrafluoroetilene filtroPall Corporation4219utilizzato per filtrare il virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Corning45000-304mezzi di crescita cellulare per cellule HEK 293T
PEI (polietilenimmina)poli scienze23966-22 mg/ml concentrazione utilizzata
Centrifuga a secchio sospeso (refrigerata)Eppendorf5805 000.017utilizzata per infezione da spin
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)Corning21-040-CVutilizzato per il lavaggio delle cellule
Polybrene (bromuro di esadimetre)Sigma-Aldrich107689Utilizzato per aumentare l'efficienza dell'infezione virale. Utilizzato a 5 & micro; g/ml.
FACSAriaBD Biosciencesstrumento utilizzato per lo smistamento delle popolazioni cellulari
FACSCantoBD Biosciencesstrumento utilizzato per l'analisi cellulare
Phoenix-GPGift di Gary Nolanlinea cellulare utilizzata per produrre particelle retrovirali
Siero fetale di vitelloMediatechMT35015CVutilizzato per la crescita e lo smistamento cellulare
cellule SupT1ATCCCRL-1942Linfoblasti T umani
Cellule HEK 293TATCCCRL-11268Cellule renali embrionali umane che contengono anche il grande antigene T SV40
RPMI 1640Corning10-040-CVmezzi di crescita cellulare per cellule SupT1
delle

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Misteli, T., Caceres, J. F., Spector, D. L. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature. 387 (6632), 523-527 (1997).
  3. Godwin, A. R., Stadler, H. S., Nakamura, K., Capecchi, M. R. Detection of targeted GFP-Hox gene fusions during mouse embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13042-13047 (1998).
  4. Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
  5. Natarajan, L., Jackson, B. M., Szyleyko, E., Eisenmann, D. M. Identification of evolutionarily conserved promoter elements and amino acids required for function of the C. elegans beta-catenin homolog BAR-1. Dev Biol. 272 (2), 536-557 (2004).
  6. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin.Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  7. Valencia-Burton, M., et al. Spatiotemporal patterns and transcription kinetics of induced RNA in single bacterial cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16399-16404 (2009).
  8. Mahmoud, L., et al. Green fluorescent protein reporter system with transcriptional sequence heterogeneity for monitoring the interferon response.J Virol. 85 (18), 9268-9275 (2011).
  9. Saunders, M. J., et al. Fluorogen activating proteins in flow cytometry for the study of surface molecules and receptors.Methods. 57 (3), 308-317 (2012).
  10. Wang, Y. L., Taylor, D. L. Probing the dynamic equilibrium of actin polymerization by fluorescence energy transfer. Cell. 27 (3 Pt 2), 429-436 (1981).
  11. He, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence (Forster) resonance energy transfer from cyan fluorescent protein to yellow fluorescent protein using single-laser excitation at 458 nm. Cytometry A. 53 (1), 39-54 (2003).
  12. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
  13. Clayton, A. H., et al. Ligand-induced dimer-tetramer transition during the activation of the cell surface epidermal growth factor receptor-A multidimensional microscopy analysis. J Biol Chem. 280 (34), 30392-30399 (2005).
  14. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  15. Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
  16. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  17. Ai, H. W., Shaner, N. C., Cheng, Z., Tsien, R. Y., Campbell, R. E. Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins.Biochemistry. 46 (20), 5904-5910 (2007).
  18. Mishin, A. S., et al. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. Biochemistry. 47 (16), 4666-4673 (2008).
  19. Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 48 (31), 5612-5626 (2009).
  20. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  21. Klages, N., Zufferey, R., Trono, D. A stable system for the high-titer production of multiply attenuated lentiviral vectors. Mol Ther. 2 (2), 170-176 (2000).
  22. Lai, Z., Brady, R. O. Gene transfer into the central nervous system in vivo using a recombinanat lentivirus vector. J Neurosci Res. 67 (3), 363-371 (2002).
  23. Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol Biol. 246, 391-411 (2004).
  24. Grignani, F., et al. High-efficiency gene transfer and selection of human hematopoietic progenitor cells with a hybrid EBV/retroviral vector expressing the green fluorescence protein. Cancer Res. 58 (1), 14-19 (1998).
  25. Ramezani, A., Hawley, T. S., Hawley, R. G. Lentiviral vectors for enhanced gene expression in human hematopoietic cells. Mol Ther. 2 (5), 458-469 (2000).
  26. Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6 (3), 127-134 (2000).
  27. Zhang, X. Y., et al. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells. Mol Ther. 5 (5 Pt 1), 555-565 (2002).
  28. Rossi, G. R., Mautino, M. R., Morgan, R. A. High-efficiency lentiviral vector-mediated gene transfer into murine macrophages and activated splenic B lymphocytes. Hum Gene Ther. 14 (4), 385-391 (2003).
  29. Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
  30. Chan, A. W., Chong, K. Y., Martinovich, C., Simerly, C., Schatten, G. Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes. Science. 291 (5502), 309-3012 (2001).
  31. Linney, E., Hardison, N. L., Lonze, B. E., Lyons, S., DiNapoli, L. Transgene expression in zebrafish: A comparison of retroviral-vector and DNA-injection approaches. Dev Biol. 213 (1), 207-2016 (1999).
  32. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
  33. Tiemann, U., et al. Optimal reprogramming factor stoichiometry increases colony numbers and affects molecular characteristics of murine induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 79 (6), 426-435 (2011).
  34. Leung, A. K., Lamond, A. I. In vivo analysis of NHPX reveals a novel nucleolar localization pathway involving a transient accumulation in splicing speckles. J Cell Biol. 157 (4), 615-629 (2002).
  35. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. J Microbiol Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  36. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  37. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single cell signaling events. Cytometry A. 55 (2), 61-70 (2003).
  38. Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C.J Cell Biol. 161 (5), 899-909 (2003).
  39. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
  40. Edwards, B. S., Ivnitski-Steele, I., Young, S. M., Salas, V. M., Sklar, L. A. High-throughput cytotoxicity screening by propidium iodide staining. Curr Protoc Cytomt. 9 (Unit 9 24), (2007).
  41. Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 8 (Unit 8 17), (2007).
  42. Lu, R., Neff, N. F., Quake, S. R., Weissman, I. L. Tracking single hematopoietic stem cells in vivo using high-throughput sequencing in conjunction with viral genetic barcoding. Nat Biotechnol. 29 (10), 928-933 (2011).
  43. Grant, G. D., et al. Live-cell monitoring of periodic gene expression in synchronous human cells identifies Forkhead genes involved in cell cycle control. Mol Biol Cell. 23 (16), 3079-3093 (2012).
  44. Fiering, S. N., et al. Improved FACS-Gal: flow cytometric analysis and sorting of viable eukaryotic cells expressing reporter gene constructs. Cytometry. 12 (4), 291-301 (1991).
  45. Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (1991).
  46. Edwards, B. S., Oprea, T., Prossnitz, E. R., Sklar, L. A. Flow cytometry for high-throughput, high-content screening. Curr Opin Chem Biol. 8 (4), 392-398 (2004).
  47. Durick, K., Negulescu, P. Cellular biosensors for drug discovery. Biosens Bioelectron. 16 (7-8), 587-592 (2001).
  48. Edwards, B. S., et al. High-throughput flow cytometry for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 2 (5), 685-696 (2007).
  49. Sklar, L. A., Carter, M. B., Edwards, B. S. Flow cytometry for drug discovery, receptor pharmacology and high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 7 (5), 527-534 (2007).
  50. Curpan, R. F., et al. High-throughput screen for the chemical inhibitors of antiapoptotic bcl-2 family proteins by multiplex flow cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 465-474 (2011).
  51. Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry A. 61 (2), 142-152 (2004).
  52. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Trejo, A., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding for multiplex flow cytometry. Curr Protoc Cytom. 6 (Unit 6 31), (2011).
  53. Surviladze, Z., Young, S. M., Sklar, L. A. High-throughput flow cytometry bead-based multiplex assay for identification of Rho GTPase inhibitors. Methods Mol Biol. 827, 253-270 (2012).
  54. Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PLoS One. 8 (1), e53015(2013).
  55. Vignali, D. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J Immunol Methods. 342 (1-2), 243-255 (2000).
  56. Hilton, B. J., Wolkowicz, R. An assay to monitor HIV-1 protease activity for the identification of novel inhibitors in T-cells. PLoS One. 5 (6), e10940(2010).
  57. Rajakuberan, C., Hilton, B. J., Wolkowicz, R. Protocol for a mammalian cell-based assay for monitoring the HIV-1 protease activity. Methods Mol Biol. 903, 393-405 (2012).
  58. Smurthwaite, C. A., et al. Fluorescent genetic barcoding in mammalian cells for enhanced multiplexing capabilities in flow cytometry. Cytometry A. 85 (1), 105-113 (2014).
  59. Stolp, Z. D., et al. A Novel Two-Tag System for Monitoring Transport and Cleavage through the Classical Secretory Pathway - Adaptation to HIV Envelope Processing. PLoS One. 8 (6), e68835(2013).
  60. Schwartz, A., et al. Standardizing flow cytometry: a classification system of fluorescence standards used for flow cytometry. Cytometry. 33 (2), 106-114 (1998).

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