Barcoding genetica con proteine ​​fluorescenti per applicazioni multiplexati

Summary

Dalla scoperta del gene della proteina fluorescente verde, le proteine fluorescenti hanno avuto un impatto sulla biologia cellulare molecolare. Questo protocollo descrive come l'espressione di proteine fluorescenti distinte attraverso l'ingegneria genetica viene utilizzata per il barcoding di singole cellule. La procedura consente di tracciare popolazioni distinte in una miscela di cellule, ideale per applicazioni multiplexate.

Abstract

Le proteine fluorescenti, i coloranti fluorescenti e i fluorofori in generale hanno rivoluzionato il campo della biologia cellulare molecolare. In particolare, la scoperta delle proteine fluorescenti e dei loro geni ha permesso l'ingegnerizzazione di fusioni proteiche per la localizzazione, l'analisi dell'attivazione trascrizionale e della traduzione di proteine di interesse, o il tracciamento generale di singole cellule e popolazioni cellulari. L'uso di geni proteici fluorescenti in combinazione con la tecnologia retrovirale ha ulteriormente permesso l'espressione di queste proteine nelle cellule di mammifero in modo stabile e affidabile. Qui viene mostrato come si possono utilizzare questi geni per dare alle cellule all'interno di una popolazione di cellule la propria biofirma. Poiché la biofirma viene ottenuta con la tecnologia retrovirale, le cellule vengono codificate con un codice a barre "a tempo indeterminato". In quanto tali, possono essere tracciati individualmente all'interno di una miscela di cellule con codice a barre e utilizzati in applicazioni biologiche più complesse. Il tracciamento di popolazioni distinte in una miscela di cellule è ideale per applicazioni multiplex come la scoperta di farmaci contro una moltitudine di bersagli o il profilo di attivazione di diversi promotori. Il protocollo descrive come sviluppare e amplificare elegantemente le cellule di mammifero con codice a barre con marcatori genetici fluorescenti distinti e come utilizzare più marcatori contemporaneamente o un marcatore a diverse intensità. Infine, il protocollo descrive come le cellule possono essere ulteriormente utilizzate in combinazione con saggi basati su cellule per aumentare la potenza di analisi attraverso il multiplexing.

Introduction

Tecnologie come spettroscopia di fluorescenza, microscopia a fluorescenza e citometria a flusso, tutti si basano su di fluorescenza, una proprietà ampiamente sfruttato in applicazioni biochimiche, biomediche, e chimici. Fluorescenza, sia intrinseca o tramite l'etichettatura, è stata sfruttata per l'analisi dei pattern di espressione di proteine ​​e profili, destino cellulare, interazioni proteina e le funzioni biologiche ^1-9, e attraverso di fluorescenza / Förster trasferimento di energia di risonanza per la rivelazione di interazioni biomolecolari e cambiamenti conformazionali ^10-13. Dal momento che l'isolamento del victoria

Protocol

1. Preparazione di cellule di mammifero, produzione virale e trasduzione per codici a barre genetico

1. Tavola 2.5 x 10 ⁶ cellule aderenti in un piatto di 10 cm (o intorno 50-60% confluenza) un giorno prima di trasfezione in Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) con siero di vitello fetale del 10% (FCS). Per retrovirale uso di produzione imballaggi linea cellulare di scelta, come Phoenix-GP (un gentile dono da Gary Nolan, Stanford University).
   NOTA: La linea cellulare di packaging esprime stabilmente Gag e Pol proteine ​​per la formazione di particelle retrovirali in trans. Assicurarsi cellule sono sani e aderito alla piastra in ....

Results

Multiplexing fluorescenti geneticamente codice a barre cellule a fini di applicazioni biologiche possono essere realizzati solo dopo che siano stati generati singole popolazioni clonali. Multiplexing è più efficace quando le popolazioni di codici a barre hanno caratteristiche distinte fluorescenti nitide con il minimo sovrapposizione spettrale. L'esempio illustrato nella figura 1 con popolazioni clonali di cellule di mammifero SupT1 illustra che le cellule a barre con mCherry e proteina fluorescente cia.......

Discussion

Qui sono stati combinati due procedure consolidate; l'ingegneria genetica attraverso la tecnologia retrovirali e l'individuazione di proteine ​​fluorescenti che utilizzano citometria a flusso. Codici a barre a base di proteine ​​fluorescenti genetica per la produzione di linee cellulari uniche fornisce un modo semplice e affidabile per applicazioni multiplex. Generazione di codici a barre cellule geneticamente modificate attraverso la tecnologia retrovirale, è inizialmente un processo lungo, ma permette di otten.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Siringhe da 10 ml	BD	309604	utilizzate per filtrare il virus
0,45 µ m ploytetrafluoroetilene filtro	Pall Corporation	4219	utilizzato per filtrare il virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	45000-304	mezzi di crescita cellulare per cellule HEK 293T
PEI (polietilenimmina)	poli scienze	23966-2	2 mg/ml concentrazione utilizzata
Centrifuga a secchio sospeso (refrigerata)	Eppendorf	5805 000.017	utilizzata per infezione da spin
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)	Corning	21-040-CV	utilizzato per il lavaggio delle cellule
Polybrene (bromuro di esadimetre)	Sigma-Aldrich	107689	Utilizzato per aumentare l'efficienza dell'infezione virale. Utilizzato a 5 & micro; g/ml.
FACSAria	BD Biosciences		strumento utilizzato per lo smistamento delle popolazioni cellulari
FACSCanto	BD Biosciences		strumento utilizzato per l'analisi cellulare
Phoenix-GP	Gift di Gary Nolan		linea cellulare utilizzata per produrre particelle retrovirali
Siero fetale di vitello	Mediatech	MT35015CV	utilizzato per la crescita e lo smistamento cellulare
cellule SupT1	ATCC	CRL-1942	Linfoblasti T umani
Cellule HEK 293T	ATCC	CRL-11268	Cellule renali embrionali umane che contengono anche il grande antigene T SV40
RPMI 1640	Corning	10-040-CV	mezzi di crescita cellulare per cellule SupT1