Articolo metodologico

Caratterizzazione funzionale di Na + / H + Scambiatori di intracellulare compartimenti, utilizzando Proton-uccidere selezione di esprimerle livello della membrana plasmatica

DOI:

10.3791/52453

⸱

30 marzo 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Université Nice-Sophia Antipolis, Laboratoire de Physiomédecine Moléculaire, CNRS UMR7370, and Laboratories of Excellence Ion Channel Science and Therapeutics

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La prima parte di questo articolo mostra come selezionare linee cellulari mutanti che esprimono scambiatori vescicolari Na+/H+ sulla loro membrana plasmatica. La seconda parte fornisce protocolli basati su misure di pH intracellulare e rapido assorbimento di ioni, che vengono utilizzati per determinare la selettività ionica e i parametri cinetici di questi scambiatori.

Abstract

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Acidificazione endosomali è critica per una vasta gamma di processi, quali il riciclaggio proteica e la degradazione, desensibilizzazione del recettore, e neurotrasmettitore caricamento in vescicole sinaptiche. Questo acidificazione è descritto per essere mediato da ATPasi protonica, insieme ai trasportatori di cloruro CLC. Altamente conservata protoni elettricamente trasportatori, la Na + / H + scambiatori (NHE) 6, 7 e 9 sono espresse anche in questi comparti. Le mutazioni nei loro geni sono stati collegati con le malattie cognitive e neurodegenerative umane. Paradossalmente, i loro ruoli rimangono elusivi, come la loro localizzazione intracellulare ha impedito dettagliata caratterizzazione funzionale. Questo manoscritto mostra un metodo per risolvere questo problema. Questo consiste nella selezione di linee cellulari mutanti, capaci di sopravvivere acidificazione citosolica acuta mantenendo NHEs intracellulari alla membrana plasmatica. Quindi raffigura due protocolli complementari per misurare la selettività e attività ionicadi questi scambiatori: (i) una basata su misurazioni di pH intracellulare mediante videomicroscopia a fluorescenza, e (ii) uno basato sulla cinetica veloci di litio assorbimento. Tali protocolli possono essere estrapolati per misurare altri trasportatori non elettrogeniche. Inoltre, la procedura di selezione qui presentata genera cellule con fenotipo ritenzione intracellulare difettoso. Pertanto queste cellule esprimono anche altre proteine ​​di membrana vescicolare a livello della membrana plasmatica. La strategia sperimentale descritta qui può quindi costituire uno strumento potenzialmente efficace per studiare altre proteine ​​intracellulari che saranno poi espressi a livello della membrana plasmatica insieme con la vescicolare Na + / H + scambiatori usati per la selezione.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La maggior parte dei compartimenti intracellulari mostrano un pH luminale acido, che è un parametro fondamentale per la maturazione, il traffico, il riciclaggio di proteine ​​o ormoni e neurotrasmettitori loading. E 'stato dimostrato che il gradiente di pH tra contenuto citosol e vescicolare è generato da vacuolar H + ATPasi 1, accoppiato ad vescicolari trasportatori cloruro ClC 2. Sia in knock-out (KO) topi e pazienti umani, l'importanza di questi trasportatori è stata evidenziata dai fenotipi pesanti causate da mutazioni nei loro geni 3-6.

I membri della famiglia SLC9A scambiatori sodio-idrogeno, anche chiamati NHEs per Na + / H + scambiatori, hanno dimostrato di essere effettori chiave pH intracellulare e regolazione del volume cellulare, così come nel trasporto vettoriale di equivalenti acido-base di tutti gli epiteli . Oltre alle NHEs membrana plasmatica, tre altamente conservati Na + / H + scambiatori, NHE 6, 7e 9 sono espressi in rete trans-Golgi e in endosomi precoci 7. Le mutazioni nei loro geni sono stati associati con l'autismo basato sulla famiglia 10 e Attention Deficit Hyperactivity Disorder Angelman-like o Christianson Sindromi 8-9 11-12. Questi scambiatori sono stati coinvolti in problemi neurodegenerative quali la malattia di Alzheimer suscettibilità 13 e collegata a X ritardo mentale geni contigui SINDROMI 14. Presi insieme, questi studi sottolineano l'importanza di questi NHEs intracellulari di sviluppo e / o la funzione del cervello.

La localizzazione intracellulare di questi scambiatori impedisce misurazioni accurate delle loro selettività ionica, direzione di trasporto, i parametri cinetici e regolazione. Come è il caso per tutti i trasportatori espressi in compartimenti intracellulari, è estremamente difficile valutare le loro attività biochimiche e quindi di comprendere appieno i loro ruoli fisiologici e meccanismi sottostanti le loro implicazioni patologiche. Sulla base della concentrazione citosolica K +, l'ipotesi più comunemente accettata era che stavano lavorando come K + accoppiati protoni trasportatori di efflusso. L'esistenza di tale perdita protonica era stato ipotizzato, come può controbilanciare protonica pompaggio dalle V-ATPasi al fine di mantenere uno stato stazionario vescicolare pH. Lo scopo di questo articolo visiva è (i) un metodo per dimostrare che permette la selezione genetica di linee cellulari che esprimono tali trasportatori vescicolari al loro membrana plasmatica, e (ii) mostrano due approcci indipendenti per misurare le funzioni di questi trasportatori.

Tre decenni fa, Pouysségur e Franchi hanno sperimentato un approccio genetico che ha permesso la clonazione molecolare e la caratterizzazione dei membri della famiglia NHE 15. Questa era basata sulla tossicità di protoni intracellulari come metodo di screening. Il primo passo è stato quello di ottenere linee di cellule deficientiin qualsiasi / H scambio Na + + espresso a livello della membrana plasmatica, utilizzando la reversibilità di questo trasportatore. I fibroblasti (linea cellulare CCL39) sono stati precaricati con Na + o Li + e poi poste in un mezzo extracellulare acido (pH 6,5) per 2 ore. Ciò ha portato alla morte di cellule esprimenti un funzionale Na + / H + scambio e la selezione di celle antiporter-deficienti (linea cellulare PS120) 16. Quando coltivate in terreno privo di bicarbonato, queste cellule sono molto sensibili all'acidificazione intracellulare acuta. Di conseguenza, l'espressione di un meccanismo di protoni efflusso funzionale a livello della membrana plasmatica sarà selezionato positivamente (vedi 17) se tali cellule sono sottoposte a acidificazioni intracellulari acute. Tali tecniche acidificazione possono essere utilizzati per isolare linee cellulari con traffico difetti che consentono l'espressione forzata di NHEs intracellulari WT a livello della membrana plasmatica.

Come eucarioti Na + / H+ Scambiatori sono elettricamente neutro, non sono misurabili dagli approcci elettrofisiologici che sono stati utilizzati con successo per misurare canali. Questo manoscritto dimostra quindi come misurare l'attività di questo scambiatore per misure di pH intracellulari e rapidi cinetica di assorbimento di litio. Poiché i concetti di base sono gli stessi, è interessante notare che molti dei processi sviluppati per la sezione di selezione vengono anche utilizzate direttamente per misurazioni funzionali.

È interessante notare, abbiamo osservato che il difetto traffico presente nelle linee cellulari selezionate utilizzando l'approccio descritto in questo manoscritto porta ad una maggiore espressione di altre proteine ​​vescicolari alla membrana plasmatica, come il canale del potassio vescicolare TWIK1 18. Questo indica verso la selezione di un meccanismo di ritenzione difetto generale per proteine ​​transmembrana vescicolari. Quindi questa procedura di selezione e le cellule che genera maggiocostituiscono uno strumento promettente per la comunità scientifica lavorare sulle proteine ​​di membrana di compartimenti intracellulari. Come pure le tecniche di misurazione qui presentate potrebbero essere applicabili per studiare altri trasportatori non elettrogeniche.

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Protocollo

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1. H + Uccidere Selezione

  1. Linee cellulari
    1. Stabilmente trasfettare cellule NHE-deficienti (ad esempio, il PS120 linea cellulare CCL39-derivato 16) utilizzando qualsiasi combinazione di mammiferi vettore di espressione e di metodo di trasfezione che produrrà rendimenti trasfezione efficienti e selezione in una linea cellulare di fibroblasti.
      NOTA: Per molti anni fosfato di calcio precipitazioni 19 è stato utilizzato con buoni rendimenti trasfezione. Questo è stato sostituito più recentemente da reagenti commerciali come Lipofectamine2000, le trasfezioni essere eseguiti seguendo le istruzioni del produttore.
  2. Soluzioni
    1. Preparare tre soluzioni sterili descritti di seguito. Sterilizzare queste soluzioni per filtrazione (0,22 micron).
      1. Preparare una soluzione di NH 4 + Loading (pH 7,4) comprendente 50 mM NH 4 Cl, 70 mM di cloruro di colina, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, GL 5 mMucose e 15 MOPS mm a pH 7.4.
      2. Preparare una soluzione di risciacquo (pH 7,0) composto da 120 mM di cloruro di colina, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, glucosio 5 mM e 15 mM HEPES a pH 7,0.
      3. Preparare una soluzione di ripristino (pH 7,4) compreso di 120 mM NaCl, KCl 5 mM, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM di glucosio e 15 mM HEPES a pH 7,4.
  3. Prima di iniziare la selezione, ottenere un incubatore di coltura cellulare che può essere utilizzato a 37 ° C senza ulteriore CO 2 dal serbatoio esterno (chiamato CO 2 - incubatore "libero"), il 5% di CO 2 si tradurrà in buffer che possono compromettere la acidificazione. Amplifica la linea cellulare che esprime la NHE di interesse fino a circa 2 x 10 8 cellule (in genere circa 20 confluenti 100 piastre mm).
  4. H + uccidendo procedura:
    1. Incubare le cellule che esprimono la intracellulare NHE di interesse per 1 ora in soluzione di caricamento, a 37 ° C in CO 2 incubatore -free.
    2. Aspirare la soluzione di carico e quindi risciacquare due volte nella soluzione descritta sopra risciacquo. Eseguire questo passaggio efficiente per eliminare il residuo extracellulare NH 4 Cl che compromettano la creazione di una ripida NH 4 + gradiente che genererà l'acidificazione.
    3. Eliminare il mezzo risciacquo mediante aspirazione e incubare le cellule per un'ora in soluzione di recupero di nuovo a 37 ° C in incubatore CO 2 libera.
    4. Sostituire il mezzo di recupero con terreno di coltura regolare (tipicamente DMEM con 7,5% FCS) e far crescere le cellule in condizioni di coltura standard (37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 e il 95% di aria).
  5. Ripetere questo ciclo di selezione due volte a settimana fino cloni stabili emergono.
    NOTA: Prestare particolare attenzione per quanto riguarda la coltura cellulare e condizioni di selezione. Mesi di lavoro può essere rovinato da qualsiasi contaminazione che è più incline a oCCur dopo un lungo periodo di cultura e di manipolazioni cellulari ripetuti.
    1. Qui, scegliere se amplificare i cloni e caratterizzare singolarmente come descritto nelle sezioni 2-3, o in piscina insieme per generare una popolazione cellulare prima di caratterizzazione.
  6. Applicare selezione occasionali (circa una volta ogni due settimane) per trattenere le cellule acidificazione resistente by-counter selezionando quelle che possono riversati fenotipo di acido sensibile parentale (Figura 1B).

2. intracellulare pH Misurazioni

2.1) fluorescenza pH Imaging

  1. Utilizzare il raziometrico pH sensibile colorante fluorescente BCECF / AM, che è sensibile al pH quando eccitato a 490 nm e 445 nm possiede un punto isosbestic, seguendo i protocolli del produttore.
    1. In alternativa, utilizzare altre sonde pH-sensibili, seguendo i protocolli del produttore.
  2. Utilizzare un set con immaginiCONSISTONO di un microscopio invertito accoppiato ad una videocamera ad alta sensibilità. Dotare questo set con 450 nm e 490 nm filtri interferenza a banda stretta in coppia con quarzo opportuni filtri densità neutra per l'eccitazione.
    1. Se possibile, utilizzare l'insieme appropriato di filtri e delle condizioni di illuminazione a fluorescenza di impostazione valori confrontabili per λ1 e λ2 in modo che il rapporto si avvicina a 1. Evitare anche valori di fluorescenza basali impostati o saturare o troppo bassa, sia per λ1 e / o λ2. Questo può cedere manufatti importanti come allora il rapporto non può essere rilevabile anche se il pH intracellulare sta cambiando.
      NOTA: Il sistema deve consentire di perfusione rapida, time-lapse eccitazione a due lunghezze d'onda di cui sopra e di acquisizione alla lunghezza d'onda di emissione corretta (535 nm per BCECF). Dotare il sistema con software che consente l'acquisizione automatica dei dati e di stoccaggio.

2.2) Misura della NHE Forward Activity (Estrusione diI protoni dal citoplasma)

  1. Acidificare cellule da una incubazione di 1 ora in soluzione di NH 4 + Loading (vedere il punto 1.4) in assenza di CO 2.
  2. Aggiungere BCECF-AM (concentrazione finale 5 mM) alla soluzione per gli ultimi cinque minuti e quindi risciacquare con NH 4 + soluzione tampone per eliminare la sonda extracellulare.
  3. Montare le celle del microscopio e prendere più immagini per registrare una linea di base stabile. Profumato soluzione di risciacquo (vedi sopra). Ciò si traduce in una diminuzione della fluorescenza corrispondente al acidificazione.
  4. Dopo la stabilizzazione del pH, profumato una delle soluzioni indicate qui di seguito per misurare i tassi di recupero pH mediati da Li + / H +, Na + / H + o K + / H + scambio. Ogni soluzione contiene un potenziale cationico accoppiamento da testare per H + scambio. Se uno di questi è trasportata, questo si tradurrà in un aumento della fluorescenza a 495 nm che correspond ad un aumento del pH intracellulare:
    , Glucosio LiCl 120 mM, KCl 5 mM, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2 5 mM e 15 mM HEPES a pH 7.4
    , Glucosio 120 mM NaCl, KCl 5 mM, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2 5 mM e 15 mM HEPES a pH 7.4
    , Glucosio 125 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2 5 mM e 15 mM HEPES a pH 7.4

2.3) Misura della NHE Activity Reverse

NOTA: Il principio è quello di invertire i gradienti ionici transmembrana.

  1. Prima della misura, caricare le cellule con il catione intracellulare di interesse (vedi sotto).
  2. Incubare per 5 minuti con BCECF / AM (vedi punto 2.2.2); sciacquarle, montarli sul microscopio video.
  3. Profumato la soluzione di carico e prendere più immagini per registrare una linea di base stabile.
  4. Dopo la stabilizzazione della linea di base, immagine le variazioni di pH quando le cellule vengono perfusi con soluzione acida extracellulare contenente 120 mM cloruro di colina, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, il glucosio 5 mm e 15 mm a MES pH 6.5.
  5. Per LiCl carico, incubare le cellule per 2 ore in una soluzione composta di 120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM di glucosio e 15 mM HEPES a pH 7,4. Litio intracellulare misurata mediante spettroscopia ad assorbimento atomico produce un valore di circa 60 mM.
  6. Per Na + carico, incubare le cellule, per due ore in una soluzione composta di 120 mM NaCl, KCl 5 mM, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM di glucosio e 15 mM HEPES a pH 7,4 in presenza di 1 mM ouabain per bloccare la Na / K ATPasi. In queste condizioni, la concentrazione intracellulare Na + è nella gamma di 40 mM.
    NOTA: K + caricamento non è necessaria in quanto K + citosolico concentrazione nell'intervallo 140 mM e un gradiente K + verso l'esterno diretto è quindi facile da realizzare.

2.4) Il trattamento dei dati e calibrazione:

NOTA: Questo passaggio si applica sia alle misure avanti e retromarcia.

  1. Al termine di ogni esperimento, profumato cellule con una soluzione di 140 mM KCl, 20 mM HEPES e 5 mM nigericin regolata a valori di pH tra 6,5 ​​e 7,4.
  2. Raccogliere dati come misure di fluorescenza dalle immagini (livelli di grigio che rappresentano i livelli di intensità) e l'esportazione in formato testo e trattare come spiegato di seguito con un programma di foglio di calcolo.
  3. Calcolare i valori di pH intracellulare per ogni singola cella o regione di interesse utilizzando la seguente equazione:
    pH = pKa + (Log (R-Rmin) / (R max -R)) x F min (λ2) / F max (λ2)
  4. Utilizzare l'min F (λ2) / F ma x (λ2) rapporto se c'è sonda sbianca o perdite, con conseguente diminuzione della fluorescenza a 450 nm durante gli esperimenti. Questo è comunque molto raramente osservata nelle condizioni utilizzate nel desEsperimenti Cribed.
  5. Poiché sono presenti alla fine di ogni misurazione pH i dati di calibrazione, verificare se i corrispondenti valori calcolati differiscono dai valori di pH utilizzati per la calibrazione. Se è il caso, quindi regolare tutti i valori di pH sperimentalmente determinato alla calibrazione utilizzando la seguente procedura:
    1. Calcolare il seguente quoziente (Q, la differenza tra il valore misurato / differenza tra i valori di calibrazione). Moltiplicare l'intero set di dati da Q. Effettuare la regolazione finale per addizione o sottrazione in modo che i valori calcolati saranno pari ai valori di taratura corrispondenti.

3. Misurazioni di iniziali Tassi di NHE7 di veloce Li + assorbimento

  1. Cellule seme su lastre multiple e (da 6 a 24 pozzetti) e acidificare loro utilizzando la tecnica di NH 4 + carico descritto sopra o alternativamente la Nigericina / albumina di siero bovino (BSA) acidificazione descritto in 20.
  2. piastre Sciacquare due volte rapidamente utilizzando la soluzione di risciacquo sopra descritta e poi incubare le cellule in soluzioni di assorbimento contenenti 1-10 litio mm (leggermente al di sotto dei valori Km) e le concentrazioni desiderate di cationi e / o inibitori di interesse per l'importo desiderato di tempo.
  3. Mantenere brevi e coerenti durata di assorbimento (in genere un minuto o anche oltre) per garantire che il trasporto opera in tassi di condizioni iniziali. Assicurarsi inoltre che tutte le soluzioni utilizzate per l'assorbimento è isotonico.
  4. Alla fine del tempo di assorbimento, eliminare accuratamente il mezzo assorbimento e lavare le cellule quattro volte con soluzione salina fosfato ghiacciato tamponata (PBS). Eseguire questi lavaggi più velocemente possibile (meno di 10 sec per quattro di essi è ideale) per impedire litio efflusso.
  5. Lyse le cellule del 25% di acido nitrico. Applicare 250 microlitri per pozzetto di 25% di acido nitrico e lasciate riposare per almeno 1 ora, poi rottami ogni pozzetto con l'estremità della punta della pipetta e trasferire l'intera sospensione bene in una nuova mitubo crocentrifuge.
  6. Trasferire il lisato in provette da 1,5 ml microcentrifuga, li centrifugare per 5 minuti a 15.000 xg (temperatura ambiente) per rimuovere i detriti cellulari.
  7. Misurare il contenuto di litio dei sopranatanti mediante spettroscopia ad assorbimento atomico 21.
    NOTA: Diverse aziende forniscono spettrometri di assorbimento atomico, che devono essere dotati di una batteria agli lampada a catodo cavo. Seguire le istruzioni del produttore in quanto queste macchine sono molto precise, ma anche molto delicato.

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Risultati

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Selezione:

La selezione + uccidendo H si basa sulla diffusione della ammonio base debole, come illustrato nella Figura 1A. L'effetto di basi deboli e acidi diffusione sul pH intracellulare è stata introdotta da Walter Boron e collaboratori 22. L'elegante idea di utilizzare questo fenomeno per la produzione di una acidificazione letale per la selezione genetica positiva è stata poi sviluppata da Jacques Pouysségur 17. Sotto tale protocollo, il...

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Discussione

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Questo protocollo descrive come selezionare le cellule che esprimono intracellulare Na + / H + scambiatori a livello della membrana plasmatica, senza alterarne la sequenza primaria per mutagenesi sito-specifica. Questi scambiatori possono essere caratterizzati.

Questo metodo si basa sulla tossicità cellulare di protoni intracellulari per selezionare linee cellulari che esprimono vescicolare Na + / H + scambiatori a livello della membrana plasmatica...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori sono profondamente in debito con tutti i membri della comunità scientifica che lavorano sul pH e sul trasporto ionico, che hanno originato e migliorato le misure qui descritte. Ringraziano in particolare il Dr. Jacques Pouysségur che ha dato origine alla tecnica di selezione H+-killing qui utilizzata. Ringraziano l'Università di Nizza-Sophia Antipolis, il CNRS, l'ANR (JCJC SVSE1 NHEint) e l'ICST Labex per il loro sostegno.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AttrezzaturaUtilizzato per la selezione dell'uccisione dell'H+ composta da molti dispositivi con diversi numeri di catalogo
Incubatore con CO2SanyoMCO15A
Incubatore senza CO2Heraeus StrumentoBB6220
Cappa a flusso laminare PSM1200NFFisher 
DMEM mediosigmaD5796
FBS oroGE HealthcareA15-151
Penicilina/streptomicinaPAAP11-010
Tripsina 10xPAAL11-003
Spettrometro ad assorbimento atomico con sistema di forni ZeemanThermo ScientificICE 3500 GFZ
LiClsigmaL4408
Acido nitricosigma438073
Set di videomicroscopia a fluorescenzaLeicaComposto da molti dispositivi con diversi numeri di catalogo
Microscopio automatizzato invertitoLeicaDMI6000B
supporto per microscopioleica11888906
11888911
11888377
fluorescenza incidenteLeica11888901
11504166
staffa motoreLeica11888379
11505234
11521505
11522106
Luce di trasmissione a LED Piastra motorizzata Leica8097321
8102034
11521580
Leica11522068
11531172
11521734
11521719
11888423
uscita telecameraLeica11888373
11507807
11888393
11888259
11888258
11541510
software di acquisizione/analisi immaginiLeica11888375
otticaleica11506507
11506243
fluorescenza lampada allo xenoleicatelecamera DMI6000
hamamatsu8100601
software11640905
sonda sensibile al pH, BCECF-AMlife technologiesB1170
NigericinSigmaN7143
standard per colture cellulari 52010120 11505180 11888424 11506203 metafluor/Mmfluor

Riferimenti

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