Caratterizzazione funzionale di Na + / H + Scambiatori di intracellulare compartimenti, utilizzando Proton-uccidere selezione di esprimerle livello della membrana plasmatica

Nina Milosavljevic; Mallorie Poët; Michael Monet; Eléonore Birgy-Barelli; Isabelle Léna; Laurent Counillon

doi:10.3791/52453

Articolo metodologico

Caratterizzazione funzionale di Na⁺ / H⁺ Scambiatori di intracellulare compartimenti, utilizzando Proton-uccidere selezione di esprimerle livello della membrana plasmatica

DOI:

10.3791/52453

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30 marzo 2015

Nina Milosavljevic^*¹ , Mallorie Poët^*¹ , Michael Monet¹ , Eléonore Birgy-Barelli¹ , Isabelle Léna¹ , Laurent Counillon¹

¹Université Nice-Sophia Antipolis, Laboratoire de Physiomédecine Moléculaire, CNRS UMR7370, and Laboratories of Excellence Ion Channel Science and Therapeutics

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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La prima parte di questo articolo mostra come selezionare linee cellulari mutanti che esprimono scambiatori vescicolari Na⁺/H⁺ sulla loro membrana plasmatica. La seconda parte fornisce protocolli basati su misure di pH intracellulare e rapido assorbimento di ioni, che vengono utilizzati per determinare la selettività ionica e i parametri cinetici di questi scambiatori.

Abstract

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Acidificazione endosomali è critica per una vasta gamma di processi, quali il riciclaggio proteica e la degradazione, desensibilizzazione del recettore, e neurotrasmettitore caricamento in vescicole sinaptiche. Questo acidificazione è descritto per essere mediato da ATPasi protonica, insieme ai trasportatori di cloruro CLC. Altamente conservata protoni elettricamente trasportatori, la Na ⁺ / H ⁺ scambiatori (NHE) 6, 7 e 9 sono espresse anche in questi comparti. Le mutazioni nei loro geni sono stati collegati con le malattie cognitive e neurodegenerative umane. Paradossalmente, i loro ruoli rimangono elusivi, come la loro localizzazione intracellulare ha impedito dettagliata caratterizzazione funzionale. Questo manoscritto mostra un metodo per risolvere questo problema. Questo consiste nella selezione di linee cellulari mutanti, capaci di sopravvivere acidificazione citosolica acuta mantenendo NHEs intracellulari alla membrana plasmatica. Quindi raffigura due protocolli complementari per misurare la selettività e attività ionicadi questi scambiatori: (i) una basata su misurazioni di pH intracellulare mediante videomicroscopia a fluorescenza, e (ii) uno basato sulla cinetica veloci di litio assorbimento. Tali protocolli possono essere estrapolati per misurare altri trasportatori non elettrogeniche. Inoltre, la procedura di selezione qui presentata genera cellule con fenotipo ritenzione intracellulare difettoso. Pertanto queste cellule esprimono anche altre proteine di membrana vescicolare a livello della membrana plasmatica. La strategia sperimentale descritta qui può quindi costituire uno strumento potenzialmente efficace per studiare altre proteine intracellulari che saranno poi espressi a livello della membrana plasmatica insieme con la vescicolare Na ⁺ / H ⁺ scambiatori usati per la selezione.

Introduzione

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La maggior parte dei compartimenti intracellulari mostrano un pH luminale acido, che è un parametro fondamentale per la maturazione, il traffico, il riciclaggio di proteine o ormoni e neurotrasmettitori loading. E 'stato dimostrato che il gradiente di pH tra contenuto citosol e vescicolare è generato da vacuolar H ⁺ ATPasi ^1, accoppiato ad vescicolari trasportatori cloruro ClC ^2. Sia in knock-out (KO) topi e pazienti umani, l'importanza di questi trasportatori è stata evidenziata dai fenotipi pesanti causate da mutazioni nei loro geni ^3-6.

I membri della famiglia SLC9A scambiatori sodi....

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Protocollo

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1. H ⁺ Uccidere Selezione

Linee cellulari
1. Stabilmente trasfettare cellule NHE-deficienti (ad esempio, il PS120 linea cellulare CCL39-derivato ¹⁶⁾ utilizzando qualsiasi combinazione di mammiferi vettore di espressione e di metodo di trasfezione che produrrà rendimenti trasfezione efficienti e selezione in una linea cellulare di fibroblasti.
  NOTA: Per molti anni fosfato di calcio precipitazioni ¹⁹ è stato utilizzato con buoni rendimenti trasfezione. Questo è stato sostituito più recentemente da reagenti commerciali come Lipofectamine2000, le trasfezioni essere eseguiti seguendo le istruzioni del produ....

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Risultati

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Selezione:

La selezione ⁺ uccidendo H si basa sulla diffusione della ammonio base debole, come illustrato nella Figura 1A. L'effetto di basi deboli e acidi diffusione sul pH intracellulare è stata introdotta da Walter Boron e collaboratori ^22. L'elegante idea di utilizzare questo fenomeno per la produzione di una acidificazione letale per la selezione genetica positiva è stata poi sviluppata da Jacques Pouysségur ^17. Sotto tale protocollo, il.......

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Discussione

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Questo protocollo descrive come selezionare le cellule che esprimono intracellulare Na ⁺ / H ⁺ scambiatori a livello della membrana plasmatica, senza alterarne la sequenza primaria per mutagenesi sito-specifica. Questi scambiatori possono essere caratterizzati.

Questo metodo si basa sulla tossicità cellulare di protoni intracellulari per selezionare linee cellulari che esprimono vescicolare Na ⁺ / H ⁺ scambiatori a livello della membrana plasmatica.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori sono profondamente in debito con tutti i membri della comunità scientifica che lavorano sul pH e sul trasporto ionico, che hanno originato e migliorato le misure qui descritte. Ringraziano in particolare il Dr. Jacques Pouysségur che ha dato origine alla tecnica di selezione H⁺-killing qui utilizzata. Ringraziano l'Università di Nizza-Sophia Antipolis, il CNRS, l'ANR (JCJC SVSE1 NHEint) e l'ICST Labex per il loro sostegno.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Attrezzatura			Utilizzato per la selezione dell'uccisione dell'H+ composta da molti dispositivi con diversi numeri di catalogo
Incubatore con CO₂	Sanyo	MCO15A
Incubatore senza CO₂	Heraeus Strumento	BB6220
Cappa a flusso laminare PSM1200NF	Fisher
DMEM medio	sigma	D5796
FBS oro	GE Healthcare	A15-151
Penicilina/streptomicina	PAA	P11-010
Tripsina 10x	PAA	L11-003
Spettrometro ad assorbimento atomico con sistema di forni Zeeman	Thermo Scientific	ICE 3500 GFZ
LiCl	sigma	L4408
Acido nitrico	sigma	438073
Set di videomicroscopia a fluorescenza	Leica		Composto da molti dispositivi con diversi numeri di catalogo
Microscopio automatizzato invertito	Leica	DMI6000B
supporto per microscopio	leica	11888906
		11888911

		11888377
fluorescenza incidente	Leica	11888901
		11504166
staffa motore	Leica	11888379
		11505234
		11521505
		11522106
Luce di trasmissione a LED	Piastra motorizzata Leica	8097321
		8102034
		11521580
	Leica	11522068
		11531172
		11521734
		11521719
		11888423

uscita telecamera	Leica	11888373
		11507807
		11888393
		11888259
		11888258
		11541510
software di acquisizione/analisi immagini	Leica	11888375
ottica	leica	11506507
		11506243

fluorescenza lampada allo xeno	leica	telecamera DMI6000
	hamamatsu	8100601
software		11640905
sonda sensibile al pH, BCECF-AM	life technologies	B1170
Nigericin	Sigma	N7143

standard per colture cellulari 52010120 11505180 11888424 11506203 metafluor/Mmfluor

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CL....

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Scambiatore sodio protone recupero del pH intracellulare cinetica di captazione del litio microscopia video a fluorescenza spettroscopia di assorbimento atomico acidificazione endosomiale espressione della membrana plasmatica misurazione della selettivit ionica

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