Esame di Rapid dopamina Dynamics con Fast Scan voltammetria ciclica Durante intraorale sapida Amministrazione in Rats Awake

Sommario

Le rapide fluttuazioni della dopamina extracellulare (DA) mediano sia l'elaborazione della ricompensa che il comportamento motivato nei mammiferi. Questo manoscritto descrive l'uso combinato della voltammetria ciclica a scansione rapida (FSCV) e della somministrazione intraorale di tastant per determinare come i tastants alterano il rapido rilascio di dopamina nei ratti svegli e in movimento libero.

Abstract

Il rilascio rapido e fasico di dopamina (DA) nel cervello dei mammiferi svolge un ruolo fondamentale nell'elaborazione della ricompensa, nell'apprendimento per rinforzo e nel controllo motivazionale. La voltammetria ciclica a scansione rapida (FSCV) è una tecnica elettrochimica con un'elevata risoluzione spaziale e temporale (sub-secondo) che è stata utilizzata per esaminare il rilascio fasico di DA in diversi tipi di preparazioni. Esperimenti in vitro su singole cellule e fette di cervello ed esperimenti in vivo su roditori anestetizzati sono stati utilizzati per identificare i meccanismi che mediano il rilascio e l'assorbimento della dopamina in condizioni normali e in modelli di malattia. Negli ultimi 20 anni, gli esperimenti in vivo di FSCV su roditori svegli e in movimento libero hanno anche fornito informazioni sui meccanismi dopaminergici nell'elaborazione della ricompensa e nell'apprendimento della ricompensa. Uno dei principali vantaggi della preparazione sveglia e in movimento libero è la capacità di esaminare rapide fluttuazioni DA che sono bloccate nel tempo a specifici eventi comportamentali o alla presentazione di ricompense o segnali. Tuttavia, una limitazione degli esperimenti combinati di comportamento e voltammetria è la difficoltà di dissociare gli effetti DA che sono specifici degli stimoli primari di ricompensa o avversivi dalle fluttuazioni DA concomitanti che mediano i comportamenti diretti alla ricompensa o altri comportamenti motori. Qui, descriviamo un metodo combinato che utilizza FSCV in vivo e infusione intraorale in un ratto sveglio per studiare direttamente le risposte DA ai sapori orali. In questi esperimenti, i sapori orali vengono infusi direttamente sul palato del ratto, bypassando il comportamento diretto alla ricompensa e il comportamento volontario del bere, consentendo l'esame diretto delle risposte DA agli stimoli tattivi.

Introduzione

Il rilascio di DA fasico svolge un ruolo importante nel mediare il comportamento diretto alla ricompensa ^[1-3]. Tuttavia, isolare e studiare come una ricompensa primaria altera il rilascio fasico di DA è spesso complicato da processi comportamentali o cognitivi concomitanti che sono anche in grado di alterare il rilascio fasico di DA, come i processi decisionali o il comportamento motorio diretto alla ricompensa per acquisire la ricompensa. Nel presente lavoro, isoliamo le risposte fasiche di DA ai tastants attraverso l'uso della voltammetria ciclica a scansione rapida (FSCV) in vivo combinata con la somministrazione di tastant attraverso cannule intraorali. Questa tecnica bypassa la scelta e l'azione e ci permette di esaminare il rilascio extracellulare di DA durante l'infusione diretta di un tastant al palato di un ratto.

FSCV è una tecnica elettrochimica ad alta risoluzione temporale e spaziale, che permette di misurare il rilascio di DA in un'area locale discreta (circa 100 μm) su una scala inferiore al secondo (risoluzione di 10 Hz). La combinazione di somministrazione intraorale e FSCV offre il vantaggio di osservare risposte DA rapide e "in tempo reale" a un tastant, che non possono essere esaminate con i metodi convenzionali di microdialisi. Inoltre, il rilascio fasico di DA in risposta a ricompense o segnali associati alla ricompensa si verifica a concentrazioni comprese tra 20-100 nM, che è superiore alla soglia di rilevamento di 10-20 nM per FSCV ^[4]. L'elevata risoluzione spaziale di FSCV consente anche la registrazione da sottoregioni di piccole aree cerebrali, come il nucleo accumbens (NAc). Pertanto, l'FSCV combinato con infusioni intraorali di astanti è un modello ideale per studiare come i tastants o altri stimoli alterano il rilascio fasico di DA in un animale sveglio e comportante. Infatti, queste tecniche hanno permesso esperimenti che indagano su come i sapori gratificanti e avversi alterino il rilascio extracellulare ^{di DA [5].}

Nell'ultimo decennio, le analisi FSCV sono state combinate con successo con i paradigmi di somministrazione endovenosa di farmaci ^[6] e di autosomministrazione di ratti ^{[7, 8]} per identificare il ruolo dei meccanismi di DA fasica nei modelli di tossicodipendenza. Inoltre, la somministrazione intraorale combinata con FSCV è stata utilizzata per esaminare come i segnali di tastano abbinati alla disponibilità di cocaina modulano il rilascio fasico di DA e le risposte comportamentali che riflettono l'affetto emotivo ^[3]. Questa metodologia combinata intraorale e FSCV può anche essere utilizzata in modo potente per esaminare le risposte fasiche della DA agli aromatizzanti, come il mentolo e i dolcificanti orali, che vengono aggiunti alle sigarette e ai prodotti del tabacco solubili ^[9-11]. Sebbene molti degli aromatizzanti aggiunti ai prodotti del tabacco siano appetibili ^[9-11], non è noto se questi aromatizzanti aumentino il rilascio fasico di DA in modo coerente con una valenza edonistica gratificante. Infatti, gli aromatizzanti aggiunti alle sigarette e ai prodotti del tabacco solubili possono avere effetti diretti sul sistema di ricompensa DA e possono agire attraverso meccanismi dopaminergici per influenzare la valenza gratificante delle sigarette e di altri prodotti del tabacco. Pertanto, la somministrazione intraorale combinata con FSCV può fornire nuove conoscenze su come gli aromatizzanti modulano il rapido rilascio di DA. L'uso della metodologia FSCV combinata intraorale e in vivo e i dati ottenuti da tali studi possono anche facilitare studi futuri per determinare come gli aromatizzanti e la nicotina interagiscono per alterare la segnalazione DA e per modulare potenzialmente il rinforzo della nicotina. Inoltre, i dati ottenuti da tali studi possono essere utilizzati per informare le decisioni normative sugli aromatizzanti dei prodotti del tabacco.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo il National Institutes of Health (NIH) Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dalla Institutional Animal Care and Use Committee Yale University (IACUC).

Preparazione 1) Pre-chirurgiche

1. Preparazione della soluzione orale
   1. Creare soluzioni di 10% di saccarosio e 0,005% L-mentolo in acqua deionizzata (pH 7,4). Conservare queste soluzioni in contenitori chiusi, a temperatura ambiente, e rifare ogni 2 settimane, per evitare il degrado.
2. Soluzioni di riferimento di elettrodi
   1. Rendere tampone Tris (pH 7,4) in qualsiasi momento prima della calibrazione. La soluzione consiste di 12,0 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 3,25 mM KCl, 1,20 mM di CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1.20 mM MgCl _2, e 2,00 mM Na ₂ SO _4.
   2. Create una soluzione di dopamina 10 mm (DA, dopamina cloridrato) in 0,1 M di acido perclorico. L'acido perclorico aiuta a prevenire l'ossidazione della dopaminae. Conservare questa soluzione, a -20 ° C e utilizzare per un massimo di 6 mesi. Fate diverse aliquote della soluzione di riserva DA per l'archiviazione di usare ogni aliquota solo una volta.
   3. Dal magazzino DA 10 mm, soluzioni diluite in tampone Tris a concentrazioni di 1 micron, 500 nM, 250 Nm, 125 nM, 62,5 nm e 31.25 nM.
   4. Per la calibrazione del pH, preparare soluzioni tampone Tris con il pH di 7.2, 7.3, 7.5, e 7.6. Ciò fornirà soluzioni che imitano pH cambiamenti che possono verificarsi durante l'esperimento in vivo.
3. Fabbricazione di elettrodi
   1. Con aspirazione a vuoto, aspirare una fibra di carbonio T-650 (7 micron di diametro) in un capillare di vetro borosilicato (lunghezza 10 mm, diametro esterno 0,6 mm 0,4 millimetri di diametro interno).
   2. Posizionare capillare di vetro riempita con fibra di carbonio in un elettrodo estrattore verticale. Per i parametri iniziali, impostare il riscaldatore a 55,0 e spegnere il magnete. Tuttavia, un'ulteriore ottimizzazione può essere necessario sia come riscaldamento e impostazioni magnetici variano frlaboratorio om al laboratorio.
      Nota: L'elettrodo dovrebbe essere lunga almeno 5,5 centimetri (comprese cono) in modo che possa facilmente adattarsi micromanipolatore ed essere inserito almeno 6,9 millimetri al di sotto dura nel cervello di ratto. Se l'elettrodo è troppo breve, registrazioni da parte ventrale del nucleus accumbens non sarà realizzabile. D'altra parte, la lunghezza totale dell'elettrodo non deve superare 6,5 centimetri altrimenti sarà troppo lunga per micromanipolatore.
   3. Utilizzando un microscopio ottico, tagliare la fibra di carbonio esposto in modo tale che si estenda 75-100 micron oltre l'estremità del vetro. Verificare che l'elettrodo ha una molto stretto, appena percettibile, tenuta tra l'elettrodo di vetro e fibra di carbonio, che produrrà minimo rumore durante la registrazione successiva. Eliminare l'elettrodo se ci sono delle crepe evidenti nel vetro o se il sigillo è sciolto, che è indicativo di una scarsa tenuta. Per informazioni più dettagliate, consultare [12] e [13].
4. Montaggio del elettrodo nel microfonoromanipulator
   1. Ottenere un 3, 30G filo che è isolato lungo metà della lunghezza del filo e utilizzare un piccolo pennello per applicare uno strato sottile di argento vernice direttamente al filo. Immediatamente dopo l'applicazione della vernice argento, inserire il filo nel foro sulla parte superiore dell'elettrodo per fornire una connessione fisica ed elettrica alla fibra di carbonio. Al microscopio, assicurarsi che il filo di argento viene a contatto con la fibra di carbonio.
   2. Fissare il filo d'argento e elettrodo al micromanipolatore utilizzando termorestringente.
   3. Inserire l'elettrodo di carbonio preparati in alcool isopropilico purificato (IPA) per almeno 10 minuti per pulire la superficie dell'elettrodo e aumentare successiva sensibilità alla dopamina. Dopo l'immersione in IPA, sciacquare la fibra di carbonio con acqua di rubinetto per rimuovere l'IPA.
5. Riferimento fabbricazione di elettrodi
   1. Prendete un filo 13 millimetri argento contenente uno di circa 6 millimetri maglie Ag / Ag Cl (7 millimetri filo d'argento da solo 6 mm di maglia, di diametro 0,4 millimetri),tagliare la parte d'argento fino a circa metà della sua lunghezza originale e saldare la parte d'argento del filo ad un perno oro.
   2. Applicare resina epossidica sulla saldatura sul perno.
   3. Immergere l'Ag / Ag Cl maglia fine in un copolimero di 5% politetrafluoroetilene e perfluoro-3,6-dioxa-4-metil-7octene-solfonico acido 5 volte, con 30 min periodi di essiccazione dell'aria tra ogni dip.
   4. Lasciare che il rivestito Ag / Ag Cl maglia asciugare O / N.
   5. Cure in forno caldo a 120 ° C per 1 ora.

2) Chirurgia combinata intraorale e intracranica Incannulazione Chirurgia (circa 75 min)

1. Catetere orale fabbricazione
   1. Rendere il catetere per via orale, e sterilizzare in ossido di etilene, almeno 10 giorni prima dell'intervento.
   2. Tagliare PE 100 tubi in 6 cm di lunghezza segmenti.
   3. Utilizzando un saldatore, fondere un'estremità del tubo PE e premere immediatamente contro una superficie solida per raffreddare il tubo PE. Il risultato dovrebbe creareun piccolo disco piatto ad una estremità del tubo PE e non deve essere flangiato. Utilizzare un ago (18 G) o perno di spinta per creare un foro al centro di questo disco.
   4. D'altra estremità del tubo in PE, comodamente inserire l'estremità smussata di un ago G nel tubo 18.
   5. Utilizzando uno standard foro di carta perforatore, pugno diversi pezzi circolari di un foglio di politetrafluoroetilene (spessore 3,18 millimetri, 6 millimetri di diametro) per creare rondelle politetrafluoroetilene.
   6. Creazione di un foro al centro della rondella. Prendere l'ago attaccato al tubo PE e spingerlo completamente attraverso la rondella. Una volta che l'ago è attraverso, far scorrere la rondella sul fondo del tubo PE in modo che sia a filo contro la rondella.
2. Chirurgia orale
   1. Dopo la sterilizzazione di strumenti chirurgici, cannula (tagliato a 2,5 mm sotto il piedistallo prima della sterilizzazione), ed elettrodo di riferimento, anestetizzare il ratto con una iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg).
      1. After 5 min, applicare un test di stimolo nocivo (a piedi o un pizzico di coda) per valutare il livello di anestesia. Se il soggetto mostra alcuna reazione fisica al test stimolo nocivo (indietreggiare risposta, aumento della frequenza respiratoria e cardiaca), somministrare una spinta ketamina del 10% al 15% della dose iniziale e ripetere il protocollo stimolo nocivo sopra.
   2. Dopo il ratto è completamente anestetizzato e non mostra alcuna reazione al test stimolo nocivo, utilizzare tosatrici animali per radere il pelo del topo dagli occhi a circa 2 mm dietro le orecchie. Poi mettere il topo su un ricircolo d'acqua piastra elettrica sottile per mantenere la temperatura corporea durante l'intervento chirurgico. Applicare lubrificante occhio. Somministrare il farmaco non steroideo anti-infiammatori (FANS), carprofen (5 mg / kg), mediante iniezione intraperitoneale prima di eseguire eventuali incisioni e prima dell'inserimento cannule intraorali. Utilizzare una tecnica asettica in ogni momento.
   3. Applicare betadine seguito dal 70% di etanolo per pulire la pelle. Ripetere 3 volte.
   4. PlaCe il ratto sulla sua schiena, e aprire la bocca con un tampone di cotone sterile. Trova il primo molare superiore.
   5. Inserire l'ago nel tessuto tra la guancia e il primo molare superiore fino a quando l'ago esce appena dietro e mediale per le orecchie.
   6. Pierce l'ago attraverso la pelle fino a quando il tubo PE esce dalla pelle ed è accessibile.
   7. Sollevare la cannula (presa dalla cannula stessa e non l'ago) e fissare la rondella politetrafluoroetilene nei molari in modo che il catetere rimane al suo posto.
      Nota: Tagliare la rondella in una forma trapezoidale e fissandolo contro i molari, con il lato piatto rivolto verso la guancia rende questo passaggio più semplice.
   8. Prendete un'altra rondella politetrafluoroetilene e farlo scorrere sopra l'ago esposto, lungo il tubo di plastica, e andare in battuta contro l'incisione.
   9. Per fissare la rondella politetrafluoroetilene, utilizzare il nastro sterilizzato per creare un "flag" triangolare in modo che la rondella non scivola su. Fissare il lavaggioer contro la pelle del topo e il nastro sterilizzato.
   10. Tagliare il catetere esposto per consentire 2-4 cm di tubo da esporre sopra la testa del topo.
   11. Ripetere i passaggi 2.2.1 attraverso 2.2.10 per l'altro lato della bocca.
3. Chirurgia intracranica per voltammetria
   1. Mettere il topo nel frame stereotassico e pulire il cuoio capelluto del animale con un due scrub stadio (uno scrub betadine seguito da una macchia di etanolo al 70%, eseguire con una ripetizione di 3 cicli).
   2. Utilizzare sterilizzati aghi pinze naso e forbici chirurgiche per tagliare via una sezione 15 x 15 mm di tessuto del cuoio capelluto.
   3. Pulire delicatamente la superficie del cranio con sterilizzati applicatori di punta di cotone. Ulteriori pulire il cranio applicando 2 o 3 gocce di 3% di perossido di idrogeno.
   4. Utilizzare un trapano stereotassico per fare 3 piccole (diametro 1 mm) fori nel cranio per il successivo inserimento di viti, 1 foro per la cannula guida, 1 foro per l'elettrodo stimolante, e 1 foro per gli eletti di riferimentoha guidato.
   5. Per le registrazioni nel nucleo NAc, posizionare la cannula guida a 1.2 mm anteriormente e 1,4 millimetri lateralmente alla Bregma. Abbassare l'apparato della cannula fino a quando la base di plastica è a filo con il cranio.
   6. Posizionare l'elettrodo di riferimento sterilizzato nel controlaterale emisfero alla guida cannula. Abbassare il riferimento circa 2 mm sotto la dura.
   7. Posizionare l'elettrodo stimolante al 5,2 mm posteriormente e 1,0 mm lateralmente a Bregma e abbassato 8,0 millimetri sotto dura per colpire l'area tegmentale ventrale (VTA).
   8. Usare un piccolo cacciavite chirurgica sterilizzato per fissare le viti al cranio. Poi, inserire l'elettrodo di riferimento, stimolando l'elettrodo, e guidare cannula. Infine, fissare tutti i componenti con cemento cranioplastic.
   9. Per le prime 48 ore di cure post-operatorie, amministrare il non-steroidei farmaci anti-infiammatori (FANS) Carprofen mediante iniezione sottocutanea (5 mg / kg). Lasciare almeno 1 settimana per il recupero completo chirurgica prima di eseguire voltamRegistrazione metria.
      1. Durante l'assistenza post-operatoria, cateteri per via orale a filo al giorno con acqua. Fornire cibo saturo in acqua per 2 giorni per aiutare l'animale in masticare e mangiare. Fornire monitoraggio quotidiano per i potenziali segnali di stress del dolore (a causa di infezione lieve o disidratazione) e fornire interventi adeguati, se necessario, (compresa l'amministrazione di liquidi, somministrazione topica di antisettici e amministrazione o FANS Carprofen a 5 mg / kg).

3) voltammetrica Registrazioni in Awake, Ratto liberamente Muoversi

1. Abbassando l'elettrodo e l'acquisizione di un insieme di addestramento DA.
   1. Il giorno dell'esperimento, controllare la pervietà della cannula orale infondendo 200 ml di acqua e osservando le risposte orofacciale (per verificare che il ratto è la degustazione l'acqua).
   2. Fissare il headstage FSCV al ratto inserendo l'elettrodo stimolante (sul headstage) nella stimolante bipolare dell'elettrodo Cannula (sul ratto). Così, headstage (miniaturizzato convertitore corrente-tensione) collega direttamente l'elettrodo bipolare stimolante.
   3. Rimuovere la cannula fittizia dall'apparato cannula ed applicare due gocce di soluzione di eparina 50% nella cannula. Poi inserire delicatamente una cannula fittizia (leggermente più lungo che la cannula fittizia precedentemente rimosso) per annullare eventuali coaguli di sangue o cicatrici glial che possono essersi verificati, che si rompono elettrodi in fibra di carbonio che saranno successivamente inseriti durante l'esperimento. Estendere la cannula utilizzata per la compensazione coaguli 3-4 mm sotto il cranio (di almeno 2 mm al di sopra del sito di registrazione).
   4. Inserire il micromanipolatore, con l'elettrodo, nella cannula guida e posizionare l'anello omega in una posizione "bloccata".
   5. Collegare il cavo elettrodo di riferimento dal headstage per il perno adatto. Quindi, collegare il cavo elettrodo di lavoro dal micromanipolatore al filo appropriato sul headstage.
   6. Abbassare le elecelettrodo a circa 4-4,5 mm al di sotto del cranio.
   7. Utilizzare un potenziostato per applicare una forma d'onda triangolare (400 V / s, -0.4 a +1.3 V). Applicare la forma d'onda per l'elettrodo a 60 Hz per almeno 10 minuti, quindi cambiare la frequenza di applicazione della forma d'onda di 10 Hz per le successive registrazioni sperimentali.
      Nota: La fase di applicazione della forma d'onda di 60 Hz produce una superficie stabile in fibra di carbonio e contribuirà a evitare la dispersione elettrica
   8. Applicare stimolazione elettrica al VTA utilizzando diverse frequenze (da 10 a 60 Hz) impulsi (10 a 30 impulsi) e correnti (50 a 150 μA) il tutto con una larghezza di impulso di 2 ms / fase, per evocare diverse concentrazioni di rilascio di DA e pH turni. Acquisire almeno 5 diverse concentrazioni di rilascio di DA e 5 turni diversi pH. Attendere (2-3 min minimo) tra stimolazioni per consentire la ricarica vescicolare [14].
      Nota: È importante ottenere stimolazioni che producono concentrazioni DA sull'intera gamma che verranno raccolti durante il successivoesperimento in quanto saranno utilizzati come set di formazione per Analisi delle Componenti Principali (vedere paragrafo 5.1).
   9. Abbassare l'elettrodo nel nucleo NAc (6,3 millimetri ventrale a dura). Successivamente abbassare l'elettrodo in 100 micron incrementi all'interno del nucleo NAc fino eventi transitori rilascio di DA sono osservate a frequenze di almeno 1 per min.
   10. Collegare il tubo (diametro interno 1/32 ", diametro esterno 3/32") per una siringa da 20 ml, collegato a una pompa a siringa. Sull'altra estremità del tubo, utilizzare un ago 23 G smussato per collegare il tubo della cannula del ratto. Assicurarsi che il tubo è riempito completamente con il sapida desiderato e verificare che non esistono bolle nel tubo.
       Nota: Tipicamente, somministrare una piccola quantità di sapida nella bocca del ratto prima di registrare per garantire che la prima infusione per la registrazione fornisce la quantità di infusione pieno e non l'acqua residua o aria nel tubo. Inoltre, questo permette all'animale di avere un po 'di spirito prima esperienzah la sapida dal romanzo tastants, anche quelli appetitive, può essere avversivi inizialmente a causa della sua novità.
   11. Per la raccolta dei dati, in infusione 200 ml di sapida (6.5 sec con una pompa e tubi precedentemente descritto). Infondere la sapida ogni 1-3 min. Infondere un totale di 25 volte al sapida. Ogni infusione eroga 200 ml di soluzione.
   12. Se più tastants vengono consegnati in un singolo esperimento, irrigare il catetere per via orale con acqua dopo aver raccolto i dati per una sapida e attendere almeno 20 minuti prima di infondere nuova sapida.
   13. Dopo la sessione di registrazione DA, prepararsi per la verifica istologica creando una piccola lesione nel sito di registrazione. Per conservare l'elettrodo fibra di carbonio per la successiva calibrazione, retrarre l'elettrodo e rimuovere il micromanipolatore. Quindi utilizzare un nuovo micromanipolatore con un microelettrodo di vetro e un filo di tungsteno (100 micron estende oltre la punta di vetro) alla stessa profondità (sotto dura) come il carbonio originale fmicroelettrodo Iber.
   14. Per la verifica istologica, creare una piccola lesione applicando 3 V al filo di tungsteno e aumentando la tensione incrementi di 1 V, ogni 10 secondi, fino a raggiungere l'impostazione 10 V.
   15. Se una curva concentrazione standard è già stato creato utilizzando elettrodi multipli in fibra di carbonio, eseguire il punto sopra lesione (3.1.14) applicando direttamente il potenziale dell'elettrodo di fibra di carbonio.
       Nota: Questo metodo lesione danneggia la fibra di carbonio e prevenire la successiva calibrazione con quella dell'elettrodo specifico.
   16. Euthanize l'animale con un pentobarbital iniezione letale (150 mg / kg, ip).
   17. Rimuovere la headcap con le cannule con una pinza tirando direttamente verso l'alto la headcap. Non torcere il headcap poiché questo causerà inutili danni al cervello e rendere difficile per identificare la posizione degli elettrodi durante istologico.
       1. Togliere il cervello e mettere in formalina 4% per 3 giorni, seguiti da 30% suCrose per 1 settimana. Creare 30 micron porzioni utilizzando un criostato, montare su vetrini ed esaminare fette al microscopio ottico per identificare la posizione della fibra di carbonio o tungsteno lesione.
          Nota: Perfusione è opzionale per 3.1.17.

4) elettrodo Taratura

1. Utilizzando la cella di flusso per creare un fattore di conversione corrente-concentrazione.
   1. Al fine di determinare la sensibilità dell'elettrodo, calibrare elettrodi dopo ogni esperimento utilizzando un flusso apparecchiatura "t-cell". Abbassare l'elettrodo nel "cellule T" mentre tampone Tris, pH soluzioni o soluzioni DA vengono lavati sulla superficie dell'elettrodo (ad una velocità di 2 ml / min). Utilizzare un sei posizioni elettrovalvola aria attuatore per passare avanti e indietro tra tampone e pH o soluzione DA.
   2. Per ogni calibrazione, raccogliere i dati voltammetrici durante 5 applicazione sec di tampone Tris (baseline) seguito da 5 applicazione secondi di pH o soluzione DA, seguiti da 20 secondi unpplicazione di tampone Tris (file totale 30 sec). Ripetere ogni corsa per 3 volte per ogni taratura concentrazione standard, controbilanciando tra le diverse concentrazioni di ogni standard.
   3. Per ogni raccolta del campione, misurare il picco di DA o corrente pH evocato. Nella media la corrente di picco attraverso ogni prova per ottenere una concentrazione di picco rispetto al rapporto attuale. Per informazioni più dettagliate, consultare [12] e [13].

5) Analisi dei dati

1. Utilizzando una formazione ambientato in analisi delle componenti principali (PCA)
   Nota: Durante un esperimento voltammetria, uscita viene prodotta come corrente, che è il risultato di ossidazione e di riduzione dopamina, cambiamenti di pH, e il rumore elettrochimico. PCA permette la separazione di questi fattori in modo che si può isolare i componenti desiderati (DA e pH) e rimuovere i componenti aggiuntivi che potrebbero falsare i segnali desiderati (per una descrizione più dettagliata, vedi ^{15, 16).}
   1. Assegnare un fattore di calibrazione per thCorrente e di uscita (circa il 5-10 nA / micron) dopo PCA per consentire valori di concentrazione degli analiti da determinare.
   2. Usare il training set ottenuto durante un esperimento per "addestrare" il modello APC per separare DA, pH, e di altri fattori. PCA prende il training set voltammograms ciclici (raccolte nella sezione 3.1.8), e determina quali caratteristiche essenziali del voltammogramma possono essere utilizzati per identificare ciascun analita raccolte durante le registrazioni in vivo voltammetria.
   3. Per determinare il numero di componenti principali per mantenere, utilizzare un Malinowski F-test. In genere, mantenere solo 2 o 3 principali componenti che normalmente spiegano circa il 95-99% della varianza nei dati. Per ulteriori discussioni in atto del Malinowski F-test, vedere ^17.
      Nota: Una volta che il numero di componenti sono determinati, l'analisi PCA efficacemente proietterà i voltammograms misurati da DA e formazione pH imposta sui principali componenti che sono stati conservati.Il risultato è un insieme di dati che è stata filtrata in modo che solo DA (o pH) dati rimangono ei dati residua che non assomiglia DA o pH viene rimossa (Vedi Risultati rappresentativi per output atteso). Per una spiegazione dettagliata e un'ulteriore passo per passo le istruzioni per l'utilizzo di PCA per l'analisi voltammetrica vedi scheda Materiali e ^{16, 17.}

Risultati

FSCV combinato con intraorale catetere impianto è stato utilizzato per esaminare come il saccarosio, una sapida appetitivo, modula fasica rilascio di DA nel nucleo NAc. Prima dell'infusione sapida, stimolazione elettrica (150 μA, 60 Hz, 24 impulsi, indicato dalla barra rossa) della VTA produce aumenti robusti fasica rilascio di DA nel NAc (Figura 1) Figura 1 mostra un grafico a colori con potenziale. l'asse y, tempo sul asse x, e la corrente (rappresentato come falsi colori) sul l'asse z. Sotto la trama...

Discussione

Consegna sapida intraorale combinato con FSCV permette l'analisi di "real-time" DA risposte a aromatizzanti orali. Ci sono tre fasi critiche nel protocollo che sono necessari per il successo delle misurazioni DA. In primo luogo, il corretto fissaggio del catetere orale è critico per l'attuazione di aromatizzanti. Assicurare che il catetere viene inserito dietro il primo molare e incuneato in posizione impedisce il catetere di perdere pervietà e impedisce la rimozione accidentale da parte dell'anima...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Elettrodo stimolante	PlasticsOne	MS303/2-A/SPC	al momento dell'ordine, richiedere un taglio di 22 mm sotto il piedistallo
Cannula per elettrodo	BioAnalytical Systems	MD-2251
Sistemi A-M	capillari in vetro	624503
Thornel	T650		fibra di carbonio
	Narishige International	PE-22
Isolatore di stimolo Neurolog	Digitimer Ltd.	DS4
Termorestringente	3M	FP-301
Fili isolati per elettrodi	Squires electronics	Custom	L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Micromanipolatore	Univ. dell'Illinois a Chicago, Engineering Machine Shop
Epossidico	ITW Devcon	14250	"5 minuti epossidico
"Copolimero di acido perfluoro-3,6-diossa-4-metil-7octene-solfonico e tetrafluoroetilene	Potenza ionica	LQ-1105	cioè Nafion
Vernice argento	GC Electronics	22-023
Alimentatore	BK Precision	9110
Tubo per cateteri intraorali	Intramedic	427426	PE 100, D.I. = 0,86 mm; D.E. = 1,52 mm
Tubo per infusione intraorale	Fischer Scientific	02-587-1A	I.D. 1/32"; D.E. 3/32"
Pompa a siringa per cella a flusso	Pump Systems Inc.	NE 1000
Cemento chirurgico	Dentsply Caulk	675571 e 675572
Attuatore d'aria	VICI	A60	Interfaccia digitale della valvola a 6 posizioni
Interfaccia digitale della valvola	VICI	DVI	230 VAC
Quad headstage	Univ. della Carolina del Nord, Impianto
Alimentazione UEI	Univ. della Carolina del Nord, Elettronica Facility
UEI breakout box	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility Alimentazione
per pompa a siringa tastant	Med Associates	SG-504
Pompa a siringa Tastant	Med Associates	PHM-107
Microelettrodo di tungsteno	MicroProbes	WE30030.5A3
Riferimento filo d'argento con AgCl	InVivo Metrico	E255A
Saccarosio	Sigma	80497
Cloruro di magnesio	Sigma	M8266
Cloroide di sodio	Sigma	S7653
Acido perclorico	Sigma	244252
Acido cloridrico (4 M)	Sigma	54435
Idrossido di sodio	Sigma	306576
Perossido di idrogeno	Sigma	H1009
Dopamina cloridrato	Sigma	H8502
TarHeel HDCV Software	Università della Carolina del Nord-Chapel Hill		Deve richiedere il software: clicca qui per il link alla pagina di richiesta del software