Articolo metodologico

Purificazione delle proteine ​​tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine ​​Ndc10 e Ndc80

DOI:

10.3791/52482

⸱

3 maggio 2015

 ,  , 
1Genetics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institute of Health

In questo articolo

Sommario

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Questo manoscritto descrive la rilevazione di sumoilazione e ubiquitinazione delle proteine ​​cinetocore, Ndc10 e Ndc80, nel lievito Saccharomyces cerevisiae erba.

Abstract

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Modificazioni post-traduzionali (PTM), come fosforilazione, metilazione, acetilazione, ubiquitinazione e sumoilazione, regolano la funzione cellulare di molte proteine. PTM di proteine ​​cinetocore che associano con il DNA centromerico mediano fedele segregazione dei cromosomi per mantenere la stabilità del genoma. Approcci biochimici come la spettrometria di massa e analisi di western blot sono più comunemente utilizzati per l'identificazione di PTM. Qui, un metodo di purificazione della proteina è descritto che permette il rilevamento di entrambe sumoylation e ubiquitinazione delle proteine ​​cinetocore, Ndc10 e Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. Un ceppo che esprime polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) e Myc-tagged Ndc10 o Ndc80 è stato costruito e utilizzato per i nostri studi. Per il rilevamento di sumoylation, abbiamo ideato un protocollo per affinità purificare proteine ​​sumoylated His-tagged utilizzando perline di nichel e usato western blot con anticorpi anti-Myc per rilevare sumoylated Ndc10 unnd Ndc80. Per il rilevamento di ubiquitinazione, abbiamo ideato un protocollo per immunoprecipitazione di proteine ​​Myc-tag e utilizzato analisi Western Blot con anticorpi anti-Ub per dimostrare che Ndc10 e Ndc80 sono ubiquitinate. I nostri risultati mostrano che epitopi di proteine ​​tag di interesse per il suo-Flag tagged ceppo Smt3 facilita l'individuazione di molteplici PTM. Studi futuri dovrebbero consentire lo sfruttamento di questa tecnica per identificare e caratterizzare le interazioni proteina che dipendono da uno specifico PTM.

Introduzione

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Ubiquitinazione e sumoilazione permettono la coniugazione di ubiquitina e Modifier Piccolo ubiquitina-simile (SUMO, Smt3 in S. cerevisiae 1) ad una proteina bersaglio, rispettivamente. PTM di proteine ​​cinetocore influenzano i livelli cellulari e interazioni proteina-proteina durante le diverse fasi del ciclo cellulare per garantire fedele segregazione dei cromosomi. Ad esempio, i livelli cellulari di Cse4 / CENP-A e proteine ​​cinetocore esterno DSN1 sono regolate da proteolisi ubiquitina-mediata per garantire la stabilità del genoma 2-5. Destabilizzazione degli allegati cinetocore-microtubuli non corretti richiede la B chinasi Ipl1 / Aurora, che fosforila Dam1 e Ndc80 complessi che interagiscono direttamente con i microtubuli 6-8. Nonostante l'identificazione di oltre settanta proteine ​​cinetocore, ci sono molto pochi gli studi che indagano le modifiche di queste proteine ​​con PTM, ad esempio, l'ubiquitina e SUMO. Una limitazione importante è la capacità di conservare la PTMs durante la purificazione e la scarsità di anticorpi personalizzati per la rilevazione di PTM come sumoylation, fosforilazione, metilazione, e altri. Caratterizzazione di proteine ​​cinetocore sumoylated Ndc10, Cep3, Bir1, e Ndc80 utilizzato un anticorpo personalizzato 9. Inoltre, Ndc10 è stata implicata come substrato per 10 ubiquitinazione. Hec1 umana (Ndc80 in S. cerevisiae) è anche substrato per ubiquitinazione, regolato da APC / C-hCdh1 E3 ligasi 11. Pertanto, Ndc10 e Ndc80 sono buoni candidati per l'ottimizzazione del protocollo per rilevare sia sumoilazione e ubiquitinazione in S. cerevisiae.

Per facilitare l'individuazione di sumoilazione, abbiamo costruito i ceppi che esprimono HF-Smt3 e Myc-tag Ndc10 o Ndc80. L'uso di tag epitopi (HF: His6-Flag) riduce al minimo il fondo a causa della cross-reattività che è frequente nel siero policlonale sollevata contro una proteina candidato. Abbiamo ideato un protocollo per affinitàpurificare coniugati HF-Smt3 e poi utilizzati commerciale anti-Flag e anticorpi anti-myc per rilevare la presenza di sumolyated Ndc10 e Ndc80 nella preparazione Smt3 purificato. Per ubiquitination, abbiamo ideato un protocollo immunoprecipitazione modificata che conserva ubiquitinazione delle proteine ​​cinetocore Myc-targhette e svolta western blot con l'anticorpo commerciale anti-Ub per rilevare ubiquitinazione di Ndc10 e Ndc80.

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Protocollo

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1. La crescita di cellule di lievito

  1. Inoculare cellule di lievito in 30 ml di YPD (Tabella 1) in un palloncino. Incubare a 30 ° C per una notte con agitazione.
  2. Diluire le cellule ad una densità ottica di 0,2 a 600 nm (OD 600 = 0.2) in 50 ml di YPD e incubare a 30 ° C con agitazione.
  3. Crescere la coltura ad una densità ottica di 1,0 a 600 nm (OD 600 = 1.0).
  4. Celle di centrifugazione per 5 min a 2000 xg e scartare il surnatante.
  5. Risospendere il pellet di cellule in 40 ml di acqua sterile e centrifugare per 5 min a 2000 xg per lavare le cellule. Eliminare il surnatante e conservare il pellet cellulare a -20 ° C.

2. Estrazione di proteine

  1. Risospendere le cellule in 0,5 ml di ghiacciata buffer di guanidina (Tabella 1) per il dosaggio di pull-down con Ni-NTA perline Superflow o tampone A (Tabella 1) per immunoprecipitazione. Tenere tubi sul ghiaccio in ogni momento.
  2. Trasferimento a 2 ml tubo tappo a vite.
  3. Aggiungere lo stesso volume di perline di vetro (Table of Materials).
  4. Bead-battere le celle di una mini tallone battitore (tabella dei materiali) per 2 minuti a temperatura ambiente, poi posto in ghiaccio per 2-3 minuti. Ripetere questa operazione tre volte.
  5. Vortex sulla alta velocità a 4 ° C per 30-60 min. Controllare le cellule mediante visualizzazione al microscopio per assicurare che le cellule sono lisate.
    Nota: cellule lisate appariranno fantasmi scuri e la mancanza di un confine o una forma definita. In modo ottimale almeno l'80% delle cellule dovrebbe essere lisato.
  6. Perforare un foro nella parte inferiore del tubo con una puntina e posto in una collezione tubo da 15 ml (tappo a vite deve essere sciolto).
  7. Centrifugare a 1000 xg per 1 minuto per raccogliere il lisato.
  8. Trasferire il lisato in una provetta da centrifuga micro.
  9. Centrifugare a 15.000 xg per 30 min a 4 ° C per raccogliere le proteine ​​estratte.
  10. Misurare la concentrazione delle proteine ​​estratte usando l'assa proteiney Kit (Tabella dei Materiali) e normalizzare tutti gli estratti per contenere la stessa quantità di proteine. Portare il volume totale di 1 ml con tampone appropriato.
    Nota: Circa 5 mg di proteine ​​totali è ottenuta da 50 OD 600 cellule.
  11. Risparmia il 50 microlitri (250 ug di proteine ​​se la proteina totale estratto dal punto 2.10 è di 5 mg), come estratto di cellula intera (WCE). Aggiungere 50 ml di tampone campione 2x Laemmli (Tabella 1) e incubare a 100 ° C in un blocco di calore per 3-5 min. Carico 10 ml di ogni campione in un gel SDS-PAGE per Western Blot analisi (Sezione 5: analisi Western Blot).

3. Purificazione di HF-Smt3 Coniugati

  1. Ottenere le perline Superflow Ni-NTA (Tabella dei Materiali) necessari per gli esperimenti (100 ml di perline per campione) tramite centrifugazione a bassa velocità (800-1,500 xg) per 1 min. Rimuovere il surnatante.
  2. Lavare perline 5x con 1 ml di PBS (Table of Materials): Inverti top-overfondo fino a quando le perle sono risospese, raccogliere perle di centrifugazione a bassa velocità, e rimuovere il surnatante.
  3. Sospendere perline in 1 ml di tampone guanidina (Tabella 1) e un'aliquota nel numero di tubi corrispondenti ai campioni da trattare. Raccogliere perle per centrifugazione a bassa velocità, e rimuovere il surnatante. Mescolare le perline ben invertendo top-over in basso.
    Nota: Miscelare cordoni ben invertendo bottom top-over.
  4. Per ciascun campione, aggiungere 950 microlitri della restante WCE (dal punto 2.11: Estrazione di proteine) a 100 ml di Ni-NTA perline Superflow.
  5. Incubare su una piattaforma oscillante a 4 ° C per almeno 4 ore o tutta la notte.
  6. Centrifugare a 800-1,500 xg per 1 min a 4 ° C.
  7. Risparmia il 50 microlitri come surnatante (SUP). Aggiungere 50 ml di tampone campione 2x Laemmli e incubare a 100 ° C in un blocco di calore per 3-5 min. Carico 10 ml di ogni campione in un gel SDS-PAGE per Western Blot analisi (Sezione 5: anal Western BlotYsis).
  8. Perline Lavare una volta con 1 ml di tampone guanidina per 5-10 minuti su una piattaforma oscillante.
  9. Lavare perline 5x con 1 ml di tampone di rottura (Tabella 1) per 5-10 minuti su una piattaforma oscillante.
  10. Perline Risospendere in 90 ml di tampone campione 2x Laemmli.
  11. Aggiungere 10 ml di 1 M imidazolo.
    Nota: Imidazolo aiuta a dissociarsi proteina His-tag da perline Ni-NTA dovuta all'interazione competizione tra imidazolo e le perle.
  12. Incubare a 100 ° C in un blocco di calore per 3-5 min.
  13. Vortex, quindi centrifugare a 13.000 g per 30 sec. Trasferire il surnatante in una nuova provetta.
  14. Carico 10-20 ml di ogni campione in un gel SDS-PAGE per Western Blot analisi (Sezione 5: analisi Western Blot).
    Nota: 10-20 ml corrisponde a 0,5-1,0 mg di ingresso, se viene utilizzato 5 mg di WCE.

4. Immunoprecipitation di Myc-tag cinetocore Proteine

  1. Ottenere anti-c-Myc affinità agarosio gel untibody (Tabella dei Materiali) necessari per gli esperimenti (25 microlitri di resina per campione) tramite centrifugazione a bassa velocità (800-1,500 xg). Rimuovere il surnatante.
  2. 5x resina Lavare con 1 ml di tampone A: Inverti top-over-basso fino la resina viene risospeso, raccolgono resina tramite centrifugazione a bassa velocità, e rimuovere il surnatante.
  3. Sospendere resina in 1 ml di tampone A e Aliquotare nel numero di tubi corrispondenti ai campioni da trattare. Raccogliere resina mediante centrifugazione a bassa velocità, e rimuovere il surnatante.
    Nota: Mescolare la resina ben invertendo top-over-bottom.
  4. Aggiungere 950 microlitri della restante WCE (dal punto 2.11: Estrazione di proteine) a 25 ml di resina.
  5. Incubare su una piattaforma oscillante a 4 ° C durante la notte.
  6. Centrifugare a 800-1,500 xg per 1 min a 4 ° C.
  7. Risparmia il 50 microlitri come surnatante (SUP). Aggiungere 50 ml di tampone campione 2x Laemmli e incubare a 100 ° C in un blocco di calore per 3-5 min. Load 10 ml di ogni campione in un gel SDS-PAGE per l'analisi Western Blot (Sezione 5: analisi Western Blot).
  8. 5x resina Lavare con 1 ml di tampone A: Inverti top-over-basso fino la resina viene risospeso, raccolgono resina tramite centrifugazione a bassa velocità, e rimuovere il surnatante.
  9. Risospendere la resina in 100 ml di tampone campione SUMEB (Tabella 1).
    Nota: tampone campione SUMEB contiene 8 M Urea e 1% SDS (forte condizione di denaturazione).
  10. Incubare a 100 ° C in un blocco di calore per 3-5 min.
  11. Vortex, quindi centrifugare a 13.000 g per 30 sec. Trasferire il surnatante in una nuova provetta.
  12. Carico 10-20 ml di ogni campione in un gel SDS-PAGE per Western Blot analisi (Sezione 5: analisi Western Blot).
    Nota: 10-20 ml corrisponde a 0,5-1,0 mg di ingresso, se viene utilizzato 5 mg di WCE.

5. Western Blot analisi

  1. Caricare i estratti proteici di 4-12% Bis-Tris gels (Tabella dei Materiali) e perfelettroforesi orm a 120 V per 90 min (buffer di Esecuzione: Tabella dei Materiali).
  2. Trasferire le proteine ​​da gel su una membrana di nitrocellulosa (Table of Materials) usando un dispositivo di trasferimento a 30 V per 90 min (Buffer di trasferimento: Table of Materials).
  3. Bloccare la membrana in 5% di latte / 1x TBST (Tabella 1) per 1 ora a temperatura ambiente.
  4. Incubare a membrana con anticorpo primario (Table of Materials) a 5% di latte / 1x TBST notte a 4 ° C. Per anticorpi primari, utilizzare una diluizione di 1: 1.000 (anticorpi anti-Flag e anti-Ub) o 1: 5.000 (anticorpo anti-Myc).
  5. Lavare membrana 3x per 10 minuti ciascuno con 1x TBST.
  6. Incubare a membrana con anticorpo secondario (Tabella dei Materiali) a 5% di latte / 1x TBST per 1 ora a temperatura ambiente. Usare una diluizione 1: 5.000 del anticorpi secondari.
  7. Lavare membrana 3x per 10 minuti ciascuno con 1x TBST.
  8. Incubare a membrana con ECL workisoluzione ng (Table of Materials) per 5 min.
  9. Esporre la membrana blu X-ray film sensibile (Tabella dei Materiali) e sviluppare utilizzando uno sviluppatore automatica (Table of Materials).

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Risultati

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Per rilevare sumoylation di proteine ​​cinetocore Ndc80 e Ndc10, ceppi con HF-Smt3 e proteine ​​cinetocore Myc-tag (Ndc80 o Ndc10) sono stati costruiti (Tabella 2), come descritto in precedenza 9,12. Coniugati HF-Smt3 stati affinità purificate utilizzando Ni-NTA perline. Analisi Western blot di purificato HF-Smt3 con un anticorpo anti-Flag permesso rilevamento di forme sumoylated di substrati SUMO che erano assenti nel ceppo di controllo senza HF-Smt3 (Figura 1A e 1B,...

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Discussione

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Tag epitopo quali HA, Myc, Bandiera, e GST sono ampiamente utilizzati per l'analisi biochimica delle proteine. Costruzione di ceppi con HF-Smt3 e proteine ​​cinetocore Myc-tag, come Ndc10 e Ndc80, facilita l'individuazione di PTM, come sumoilazione e ubiquitinazione. HF-Smt3 tirare giù test permette la rilevazione di proteine ​​cinetocore sumoylated, Ndc10 e Ndc80 (Figura 1). Il protocollo di purificazione per affinità e western blot utilizzando un anticorpo anti-Flag stabilire la specificità di...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il Dr. Oliver Kerscher per il supporto e i consigli e i membri del laboratorio di Basrai per il loro supporto e commenti sull'articolo. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health Intramural Research Program.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Perle di vetroBioSpec Products110791050,5 mm di diametro
Mini beadbeaterBioSpec Products#6938 disgregatore cellulare
Ni-NTA superflowQiagen30430100 ml
Cocktail di inibitori della proteasiSigma-AldrichP82151 ml
Anti-c-Myc agarosio affinità gel antbody prodotto nel coniglioSigma-AldrichA74701 ml
Anticorpo monoclonale anti-Flag M2 prodotto nel topoSigma-AldrichF1804Anticorpo primario, diluizione 1:1.000
anticorpo c-Myc (A-14)Santa Cruz Biotechnologysc-789Anticorpo primario, diluizione 1:5.000
Anticorpo di topo purificato monoclonale 9E10CovanceMMS-150PAnticorpo primario, diluizione 1:5.000
Ubiquitina (P4G7) anticorpo monoclonaleCovanceMMS-258RAnticorpo primario, diluizione 1:1.000
ECL IgG di coniglio, intero AbGE Healthcare Life SciencesNA934VAnticorpo secondario, diluizione 1:5.000
ECL IgG di topo, HRP-Linked interoGE Healthcare Life SciencesNA931VAnticorpo secondario, diluizione 1:5.000
Saggio delle proteine DCBio-Rad500-0116
Membrana in nitrocellulosaNovexLC20010,45 mm dimensione dei pori
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein GelsNovexNP0321BOX1,0 mm, 10 pozzetti
NuPAGE MES SDS Running BufferNovexNP000220x
NuPAGE Transfer BufferNovexNP0006-120x
SuperSignal West Pico Substrato chemiluminescenteThermo Scientific34078
10x PBS pH7.4GIBCO70011-044
Pellicola radiografica sensibile al bluDbioDBOF30003
Sviluppatore automaticoKodakM35AX-OMAT
NocodazoloSigma-AldrichM140450 mg
MG-132Selleck ChemicalsS261925 mg
Ab

Riferimenti

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