Articolo metodologico

Generazione di cellule staminali adiposo umano attraverso dedifferenziazione di adipociti maturi in Culture soffitto

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DOI:

10.3791/52485

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7 marzo 2015

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1IUCPQ Research Center, 2CHU de Québec Research Center, 3Laval University

In questo articolo

Sommario

Gli adipociti maturi possono rappresentare un'abbondante fonte di cellule staminali attraverso la dedifferenziazione, che porta a una popolazione omogenea di cellule simili a fibroblasti. La digestione della collagenasi viene utilizzata per isolare gli adipociti maturi dal grasso umano. L'obiettivo del nostro protocollo è quello di ottenere cellule adipose multipotenti e dedifferenziate da adipociti maturi umani.

Abstract

Gli adipociti maturi hanno dimostrato di invertire il loro fenotipo in cellule simili a fibroblasti in vitro attraverso una tecnica chiamata coltura a soffitto. Gli adipociti maturi possono anche essere isolati da tessuto adiposo fresco per la caratterizzazione specifica del deposito della loro funzione e delle loro proprietà metaboliche. Qui, descriviamo un protocollo consolidato per isolare gli adipociti maturi dai tessuti adiposi utilizzando la digestione della collagenasi e i passaggi successivi per eseguire colture a soffitto. In breve, i tessuti adiposi vengono incubati in un tampone Krebs-Ringer-Henseleit contenente collagenasi per distruggere la matrice tissutale. Gli adipociti maturi galleggianti vengono raccolti sulla superficie superiore del tampone. Le cellule mature vengono piastrate in un pallone T25 completamente riempito di terreno e incubate capovolte per una settimana. Un approccio alternativo di coltura su piastra a 6 pozzetti consente la caratterizzazione di adipociti in fase di dedifferenziazione. La morfologia degli adipociti cambia drasticamente nel corso della coltura. L'immunofluorescenza può essere facilmente eseguita su vetrini coltivati in piastre a 6 pozzetti, come dimostrato dalla colorazione in immunofluorescenza FABP4. La proteina FABP4 è presente negli adipociti maturi ma è sottoregolata attraverso la dedifferenziazione delle cellule adipose. La dedifferenziazione degli adipociti maturi può rappresentare una nuova strada per la terapia cellulare e l'ingegneria tissutale.

Introduzione

La dedifferenziazione in vitro degli adipociti maturi si ottiene attraverso una tecnica chiamata coltura del soffitto1. A causa della loro naturale tendenza a galleggiare in soluzioni acquose, gli adipociti maturi isolati aderiscono alla superficie di un pallone capovolto completamente riempito di terreno di coltura. Nel giro di pochi giorni, le cellule modificano la loro morfologia sferica e diventano cellule simili ai fibroblasti. Le cellule risultanti, chiamate cellule adipose dedifferenziate (DFAT), sono multipotenti2. Gli articoli di ricerca sulla dedifferenziazione degli adipociti, in particolare sulle cellule umane, sono limitati. Tuttavia, hanno già fornito informazioni interessanti riguardo la multipotenza, il fenotipo cellulare e la capacità replicativa delle cellule DFAT2. Gli adipociti maturi provenienti da vari compartimenti adiposi sono stati dedifferenziati con successo, compresi quelli provenienti dai tessuti adiposi viscerali e sottocutanei umani2-4. Oltre a questi depositi, Kishimoto e collaboratori hanno campionato il tessuto adiposo dai cuscinetti adiposi buccali e gli adipociti dedifferenziati in cellule DFAT5. Matsumoto e collaboratori hanno generato con successo cellule DFAT sottocutanee da pazienti che coprivano un'ampia gamma di età e la maggior parte delle cellule aveva un alto tasso proliferativo e meno del 6% di senescenza anche dopo 10 passaggi in coltura2.

Le cellule DFAT sono state ridifferenziate con successo in diversi lignaggi, tra cui adipogenico, osteogenico, condrogenico e neurogeno2,3,6. Queste cellule esprimono diversi marcatori di cellule staminali embrionali come Nanog e i quattro fattori pluripotenti identificati Oct4, c-myc, Klf4 e Sox23. Esprimono anche marcatori specifici per ciascuno dei tre strati germinali7. Inoltre, le cellule DFAT sono simili alle cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo (MSC derivate da BM) in base alla loro firma epigenetica3. Sfruttando la capacità delle cellule staminali delle cellule DFAT, molti gruppi hanno studiato il loro potenziale per trattare o migliorare varie malattie8,9. Miglioramenti delle condizioni patologiche, come il tessuto cardiaco infracletto, le lesioni del midollo spinale e la disfunzione dello sfintere uretrale, sono stati osservati con iniezioni di cellule DFAT in modelli di ratto della malattia10-12.

Oltre alle proprietà delle cellule staminali delle cellule DFAT, potrebbero rappresentare un nuovo modello cellulare per gli studi di fisiologia degli adipociti. La linea cellulare 3T3-L1 viene spesso utilizzata a questo scopo poiché queste cellule si differenziano in adipociti aderenti che immagazzinano lipidi sotto stimolazione adipogenica13. Tuttavia, queste cellule provengono dal tessuto embrionale di topo13. Inoltre, la specificità del deposito non può essere studiata con questo modello e potrebbe non riflettere pienamente la fisiologia degli adipociti umani14. Altri laboratori lavorano con cellule adipose isolate da depositi di grasso murino, ma la distribuzione del grasso non è dimorfica nei topi e la configurazione anatomica della cavità addominale del roditore impedisce l'estrapolazione diretta all'uomo15. Al fine di studiare gli adipociti nel contesto della fisiopatologia dell'obesità umana, è diventata essenziale considerare la distribuzione del grasso corporeo e le differenze specifiche del deposito di grasso16. Alcune limitazioni delle colture primarie di preadipociti, tra cui le quantità di cellule ottenute da campioni di biopsia di tessuto adiposo e la loro senescenza dopo alcuni passaggi in coltura, hanno creato la necessità di modelli alternativi. Perrini e collaboratori hanno studiato la specificità del deposito nell'espressione genica delle cellule DFAT originate dal grasso viscerale e sottocutaneo e le hanno confrontate con le cellule staminali di derivazione adiposa (ASC) provenienti dallo stesso deposito di grasso. Hanno dimostrato che le differenze nell'espressione genica e nella funzione si trovano principalmente tra i depositi che tra i tipi di cellule, suggerendo che le cellule DFAT sono fisiologicamente vicine alle ASC dello stesso deposito. Le cellule DFAT possono rappresentare un'interessante alternativa ai modelli disponibili per gli studi sulla distribuzione del grasso nella fisiopatologia dell'obesità umana. Inoltre, la coltura a soffitto è un metodo promettente per ottenere cellule staminali adulte per scopi di ingegneria tissutale.

Qui, descriviamo la digestione della collagenasi, una tecnica ampiamente utilizzata per isolare gli adipociti maturi dai campioni di grasso sottocutaneo e/o viscerale17, e i passaggi successivi per eseguire la coltura a soffitto e dedifferenziare queste cellule in cellule multipotenti, simili a fibroblasti.

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Protocollo

Dichiarazione etica: Il progetto è stato approvato dal Comitato Etico della Research IUCPQ prima del reclutamento dei pazienti. Ai fini del presente articolo / video, abbiamo ottenuto i tessuti da 2 pazienti: 1) A 62 anni, paziente di sesso maschile con un BMI di 50,7 kg / m 2 e 2) 35 anni paziente di sesso femminile con un BMI di 57 kg / m 2. Esperimenti può essere fatto con due scomparti grasso, ma sono limitati a un compartimento grasso ai fini di questo video. Aspetti tecnici del video sono state effettuate con il paziente e 1 FABP4 immunofluorescenza è stata eseguita con le cellule dedifferenziate da paziente 2.

Elaborazione 1. Campione

  1. Chiedi chirurghi a raccogliere il tessuto adiposo dal comparto grasso omentale e sottocutaneo, al momento della chirurgia bariatrica laparoscopica.
  2. Portare rapidamente campioni adipose al laboratorio a temperatura ambiente ed elaborare immediatamente.
  3. Eseguire la digestione in laboratorio, in un ambiente non sterile. Ilcellule saranno eventualmente trasferiti nel locale cultura e coltivati ​​in condizioni sterili. Per evitare la contaminazione, preparare tampone KRH con acqua distillata e filtrata e seguire da una filtrazione (filtro 0.22μM) prima della digestione. Tubi accuratamente puliti con etanolo prima cessione nel cofano coltura cellulare per pallone e preparazione piastra.
  4. Collocare il tessuto adiposo su un piatto pre-pesate e il peso record. Fissare una piccola parte di ogni campione di tessuto (meno di 1 cm 2) in 10% formalina tampone a temperatura ambiente per almeno 24 ore prima della paraffina. Utilizzare questo esempio incorporato per esperimenti di immunoistochimica (tecnica non mostrato).
  5. Inserire un altro pezzo in una provetta da 50 ml e flash-congelamento in azoto liquido prima della conservazione a -80 ° C per ulteriori studi sui tessuti adiposi interi (ad esempio, l'espressione genica - tecnica non mostrati).

2. Collagenase Digestione

  1. Posizionare il restante pezzo di tessuto adiposo in un ml tu 50essere per la digestione.
  2. Aggiungere 4 ml di KRH-WB integrati con collagenasi (350 U / ml) per grammo di campione nel tubo di digestione.
  3. Tritate tessuto adiposo con le forbici.
  4. Inserire sospensione tessuto adiposo macinate in un agitatore, 37 ° C, 90 rpm massima, per una incubazione di 45 minuti (massimo 1 ora).

3. Purificazione di adipociti e preadipociti

  1. Versare la soluzione traslucido con pochi pezzi di grasso attraverso un nylon 400 micron maglia in un bicchiere di plastica.
  2. Con pinzette, strofinare la preparazione cellulare sulla rete di nylon e lavare con 5 ml di KRH-WB.
  3. Delicatamente trasferire la sospensione cellulare filtrato in un tubo da 50 ml con il tubo di plastica in esso e una siringa 60cc attaccata all'estremità tubo.
  4. Sia la sospensione con adipociti maturi riposare per circa 10 min, permettendo alle cellule di raggiungere la parte superiore del buffer galleggiamento.
  5. Lentamente aspirare il tampone nella parte inferiore del tubo utilizzando 60cc Syrinaspirazione ge.
  6. Aggiungere 20 ml di KRH-WB per lavare. Ripetere la procedura dal punto 3.4 per 2 lavaggi aggiuntivi.
  7. Raccogliere il buffer di portare la sospensione adipociti ad un volume finale di 5 o 10 ml, a seconda della quantità di cellule. Perseguire con passaggi nella sezione 5.
  8. Recupero della frazione stromale-vascolare dal buffer raccolti con la siringa 60cc mediante centrifugazione (3000 rpm, RT, 5 min) per ulteriore coltura cellulare primaria se desiderato (tecnica non mostrato).

Cell Count 4. adipociti maturi

  1. Carico 10 ml di sospensione degli adipociti scosso delicatamente in una camera di conteggio (emocitometro). Eseguire conta delle cellule in quadruplicato.
  2. Calcolare il numero di cellule mature isolate.

5. Coppia degli adipociti dedifferenziazione in T-25 Flask

  1. Riempire a 25 cm 2 tessuto pallone di coltura a ¾ del volume con il siero di vitello DMEM / F12-20%.
  2. Secondo il conteggio delle cellule, versare 500.000 cellule mature nel pallone.
  3. Riempire il pallone completamente utilizzando un tubo da 50 ml con il mezzo ed eliminare come bolle che possibile.
  4. Avvitare il tappo non ventilate sul pallone.
  5. Pulire il pallone con etanolo prima dell'incubazione per evitare la contaminazione.
  6. Incubare la beuta capovolto per una settimana senza toccarlo per evitare movimenti nella cultura che potrebbero disturbare l'adesione cellulare.
  7. Prima invertendo il matraccio a 7 giorni di coltura invertito, manipolare delicatamente il matraccio e rimuovere tutta medie nel pallone per aspirazione, evitando movimenti bruschi.
  8. Aggiungere 12 ml di siero di vitello% DMEM-F12-20 e coltivare cellule con tecniche standard. Un filtrato, tappo ventilato può essere aggiunto al pallone.

6. maturo degli adipociti dedifferenziazione in un 6-pozzetti

  1. Inserire un coprioggetto sul fondo di ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti
  2. Aggiungi un ½ "boccola di plastica sulla parte superiore di ogni coprioggetto.
  3. Riempire pozzetti con 8 ml di 20% di siero di vitello-DMEM.
  4. Metti un coprioggetto su ogni boccola in plastica.
  5. Inserire puntale tra la slitta e il tubo di iniettare le cellule sotto il vetrino (50.000 cellule per pozzetto).
  6. Incubare le piastre in un incubatore standard di coltura cellulare a 37 ° C con 5% di CO 2 per una settimana.
  7. Coprioggetto Reverse con le cellule attaccate in ogni pozzetto contenente 2 ml di media integrato con siero di vitello del 20% e perseguire la cultura.
  8. Utilizzare coprioggetto con cellule in fase di de-differenziazione per diversi scopi, tra cui immunofluorescenza (tecnica non mostrato).

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Risultati

Importanti cambiamenti morfologici avvengono a maturare adipociti durante dedifferentiation (Figura 1). Come mostrato in Figura 2, le cellule in fase dedifferentiation state colorate con un anticorpo anti-FABP4 per analisi di fluorescenza. Le cellule con una morfologia rotonda espresso la proteina FABP4 mentre la maggior parte delle cellule di fibroblasti, come non ha fatto. Dopo dedifferentiation, cellule DFAT possono essere coltivati ​​con procedure standard per diversi passaggi. Siam...

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Discussione

Dedifferenziazione di adipociti maturi con la tecnica di coltura soffitto è un nuovo approccio per ottenere cellule staminali adipose da un piccolo campione di tessuto adiposo nativo. Sulla base della nostra esperienza e quella di altri 2, un grammo di tessuto è sufficiente al piatto un pallone da 25 cm 2 e per ottenere una popolazione di cellule DFAT per i quali l'omogeneità è stata dimostrata da Poloni e collaboratori 3. Adipociti dedifferentiation sembra possibile con le cellule d...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo studio è stato supportato dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (371697-2011, AT). Gli autori vogliono ringraziare l'aiuto dei chirurghi bariatrici Drs S. Biron, F-S. Hould, S. Lebel, O. Lescelleur, P. Marceau e Christine Racine e Caroline Gagnon della IUCPQ Tissue Bank. Ringraziamo Jacques Cadorette dei servizi audiovisivi dell'IUCPQ per le riprese e il montaggio video.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Albumina sierica bovinaSigmaA7906
AdenosinaSigmaA4036
Acido ascorbicoSigmaA0278
NaClÈ possibile utilizzare qualsiasi marca
KClÈ possibile utilizzare qualsiasi marca
CaCl2Qualsiasi marca può essere utilizzata
MgCl2Qualsiasi marca può essere utilizzata
KH2PO4Qualsiasi marca può essere utilizzata
HEPESQualsiasi marca può essere utilizzata
GlucosioQualsiasi marca può essere utilizzata
I collagenasiWorthington Biochemical CorpLS-004196
DMEM/F-12, HEPES, senza rosso fenoloGibco-Life Technologies11039-021Aggiungi al terreno : 20% siero di vitello, gentamicina (50 µ g/ml) e fungizone (2,5 µ g/ml)
Siero di vitello, integrato con ferro, da vitelli alimentati con latte artificialeSigmaC8056-500 ml
1/2 In boccola di plasticaIberville2704-CPSKU:1000120918 (Home Depot)
Azoto liquidoSoluzione di formalina Linde
, tamponato neutro, 10%SIGMAHT501128
Pinzetta
Forbici
Siringhe da 60 ccSiringa
Tubo di plastica Tampone
madre Krebs-Ringer-Henseleit (KRH)Preparare il tampone madre come segue: 25 mM HEPES pH 7,6, 125 mM NaCl, 3,73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2,5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Regolare il pH a 7,4.
Tampone di lavoro Krebs-Ringer-Henseleit (KRH-WB)Aggiungere i seguenti componenti freschi al tampone KRH: 4% di albumina sierica bovina, 5 mM di glucosio, 0,1 e micro; M adenosina, 560 &; M acido ascorbico
KRH-WB integrato con collagenasiAggiungere 350 U/ml di collagenasi di tipo I
T25 fiaschetta per coltura tissutale con tappo non ventilatoSarsted o altra marca
Piastra per coltura tissutale a 6 pozzettiBD Falcon o altra marca
Vetro di copertura per microscopio 22x22Fisherbrand12-542-B
Bechersterili
Tipo sterilesteriliBD di tipo I

Riferimenti

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