Zebrafish Keratocyte espianti per studiare la migrazione delle cellule collettiva e riepitelizzazione in guarigione delle ferite cutanee

Sommario

Cheratociti zebrafish migrano in lastre alveolari da espianti e forniscono un modello in vitro per lo studio dei meccanismi di migrazione cellulare collettiva nel contesto di epiteliale guarigione della ferita. Questi protocolli dettaglio un modo efficace per stabilire le culture espianto primarie per l'uso in test di migrazione cellulare collettiva.

Abstract

Grazie alle loro proprietà uniche motilità, cheratociti pesce dissociate da sono da tempo utilizzati culture espianto per studiare i meccanismi della migrazione singola cellula. Tuttavia, quando si stabiliscono espianti, queste cellule si muovono anche collettivamente, mantenendo molte delle caratteristiche che rendono individuo cheratociti un modello interessante per lo studio della migrazione: rapidi tassi di motilità, vasta lamelle ricco di actina con un cavo actina perpendicolari, e di velocità relativamente costante e direzione di migrazione. Nei primi espianti, la rapida interconversione di cellule migranti singolarmente con quelli migrazione collettivamente consente di studiare il ruolo di adesioni cellula-cellula nel determinare la modalità di migrazione e sottolinea i legami molecolari tra le due modalità di migrazione. Le cellule in espianti successivi perdono la loro capacità di migrare rapidamente e collettivamente come la transizione epitelio mesenchimale verifica e geni associati con la guarigione della ferita e l'infiammazione sono espressi in modo differenziale. Così, espianti keratocyte possono servire come modello in vitro per la riepitelizzazione cutanea che si verifica durante la guarigione della ferita e può rappresentare un sistema unico per studiare i meccanismi di migrazione cellulare collettiva nel contesto di un programma definito di cambiamenti di espressione genica. Una varietà di linee di zebrafish mutanti e transgeniche sono disponibili, che consente di espianti di stabilire da pesce con diversi background genetico. Questo permette il ruolo di proteine ​​diverse all'interno di questi processi da affrontare univoco. I protocolli descritti qui descrivono un metodo semplice ed efficace per stabilire queste culture espianto per l'uso in una varietà di saggi legati alla migrazione cellulare collettiva.

Introduzione

Studi di motilità cellulare si sono tradizionalmente concentrati sulle cellule migrano individualmente. Cheratociti coltivate dai pesci e anfibi espianti hanno dimostrato di essere un sistema potente modello per studiare i meccanismi di motilità cellulare utilizzando la modellazione sia sperimentale e matematica approcci ^1-6. Il lavoro sperimentale sulle cellule migrano singolarmente è aiutata dal rapido movimento scorrevolezza delle cellule, mantenendo uniforme forma, velocità e direzione. Tuttavia, in vivo, le cellule si muovono spesso insieme pur mantenendo giunzioni cellula-cellula, in particolare durante l'embriogenesi, la guarigione delle ferite, e le metastasi. Così, la migrazione cellulare collettiva è un settore in crescita e sempre più importante della ricerca nel campo della migrazione delle cellule. La migrazione collettiva di queste cellule è stata recentemente descritta ⁷ ed ha molte caratteristiche uniche che lo rendono un potente sistema per studiare la migrazione delle cellule collettiva in un modello di guarigione delle ferite.

ove_content "> Quando le scale vengono pizzicate da un zebrafish adulto anestetizzato, alcuni tessuti epiteliali rimane attaccato alla parte inferiore della scala. Quando si aggiunge mezzo di coltura cellulare, queste cellule epiteliali, o cheratociti, migrano rapidamente come unità collettiva dalla scala. Il Espianto può essere visto come un modello di guarigione delle ferite epiteliale, in cui le cellule migrano dalla espianto come farebbero nella matrice provvisoria del letto della ferita per ristabilire un epitelio intatto. Dati recenti suggeriscono che questa coltura ex vivo imita molte caratteristiche di in vivo la guarigione delle ferite in zebrafish adulto. tassi chiusura della ferita ⁸ si traducono in una velocità di migrazione simile a quello osservato nella ex vivo sistema ^7. Inoltre, in una ferita in vivo guarigione del modello, il trattamento con warfarin suggerisce che l'emostasi non ha alcun effetto sul tasso di di guarigione, mentre il trattamento con idrocortisone per diminuire la risposta immunitaria non ritardare riepitelizzazione ⁸ . Come il pesce zebra non sanguina quando la bilancia è rimosso dall'animale, emostasi non è un giocatore importante. Anche se abbiamo trovato cellule immunitarie in espianti, non abbiamo studiato gli effetti che potrebbero avere sulla migrazione cellulare collettiva.

Il protocollo presentato qui descritto come stabilire le culture zebrafish keratocyte espianto a garantire la coerenza e riproducibilità per l'uso in molti saggi biologici. Queste culture espianto sono particolarmente convincenti modello in vitro per la migrazione delle cellule collettivo per diversi motivi. In primo luogo, cheratociti zebrafish sono pile utilizzate entro ore di stabilire culture espianto. Pertanto, queste cellule non hanno subito i cambiamenti morfologici e espressione genica associati con passaggio di cellule primarie ^9-13. In secondo luogo, questo sistema rappresenta un modello per lo studio di riepitelizzazione in risposta al ferimento ¹⁴ e, come parte della risposta al ferimento, un epiteliale al mesenchimale transition processo (EMT) è iniziata come evidenziato da cambiamenti nell'espressione genica e riarrangiamenti del citoscheletro ^14,15. Così, lo sfondo cambiamenti nell'espressione genica e motilità che si verificano in cellule non trattate sono stati caratterizzati e fornire un contesto per interpretare modifiche con trattamento. Inoltre, il pesce e la keratocyte cheratinociti umani sono funzionalmente equivalenti; entrambi sono le cellule epiteliali primarie dei rispettivi specie e svolgono un ruolo chiave nella epiteliale guarigione della ferita. In terzo luogo, zebrafish adulto stanno guadagnando il riconoscimento come sistema modello per una varietà di malattie umane ^16-18 tra cui il melanoma e altri tumori ^19-21, ferita cutanea guarigione ^8,14 e Rigenerazione Tissutale ^22-24.

I vantaggi tecnici di questo modello di sistema sono altrettanto convincenti. Un numero crescente di linee mutanti e transgeniche sono disponibili dal non-profit, servizi centralizzati. In particolare, la mutazione progetto Zebrafish (ZMP) Presso il Wellcome Trust Sanger Institute mira a creare un allele knockout in ogni proteina gene nel genoma zebrafish. Attualmente, hanno mutato 11.892 geni, circa il 45% del genoma, con 24.088 alleli caratterizzati. Inoltre, ZMP accetta proposte e genererà knock-out gratuitamente. Metodi Recenti gene atterramento in larvale e adulto zebrafish ^25-28 forniscono la flessibilità per studiare la funzione dei geni evolutivamente importanti per i quali approcci transgenici sono problematici o impraticabili.

Grazie alla loro estremamente rapidi tassi di motilità di ~ 145 micron / h poco dopo creazione di culture ^29, analisi possono essere completate rapidamente (di solito in 24 ore o meno). Come esperimenti possono essere concluse rapidamente e culture crescono bene a temperatura ambiente, molti degli ostacoli tecnici associati sono evitati mammiferi test di migrazione delle cellule che coinvolgono microscopio video. Inoltre, in età di serraggio bilanci di ricerca, zebrafish è facile ed economico mantenuto.

La struttura e il comportamento del trapianto è complessa. Come il pesce non sanguinano quando la scala viene rimosso, è improbabile che molto più strati epidermici superficiali vengono rimossi con la scala. Cheratociti sembrano essere il tipo cellulare predominante nel espianto quando squame sono inizialmente rimossi dal pesce come la stragrande maggioranza delle cellule sembra macchiare con un anticorpo anti-E-caderina ^14. Inoltre, non vi è alcuna prova di fibroblasti in coltura iniziale come giudicato dalla mancanza di vimentina colorazione mediante immunofluorescenza ^14. Tuttavia, con la rimozione ripetuta scala, sembra che vi siano numerosi neutrofili nel espianto (vedi Video 1). Abbiamo identificato queste cellule come neutrofili basati su osservazioni morfologiche delle loro dimensioni, rapidamente motilità e la loro migrazione fuori dello strato di cellule quando esposto a LPS (dati non mostrati). Inoltre, queste cellule si colorano vivacemente with un anticorpo di neutrofili fattore citosolico e con una varietà di anticorpi secondari IgG, che indica che essi hanno FCRS abbondanti sulla loro superficie (dati non mostrati). Strati di cellule multiple sono presenti all'interno del espianto. Microscopia confocale rivela la presenza di un solo strato vicino al bordo superiore per più di due strati di cheratinociti vicino scala con neutrofili visibili sopra, sotto, e tra i fogli keratocyte cellulare.

A momenti iniziali, le cellule sul bordo del multi-layer espianto polarizzare, avviando la migrazione collettiva del cheratociti dalla espianto a tassi iniziali di ~ 145 micron / hr. L'area coperta dal espianto aumenta rapidamente, portando a cellule diffusione, la tensione all'interno del foglio, e un tasso ridotto di avanzamento del bordo d'attacco. Interconversioni rapidi tra le cellule capo e follower si osservano sul bordo di entrata durante la formazione e la chiusura di fori spontaneamente costituiti all'interno del foglio ^7. ComeProcesso di EMT avviato con l'espianto continua, i frammenti fogli e le cheratociti perdono la loro specializzazione, rapida motilità. Espressione genica e cambiamenti morfologici coerenti con EMT, la guarigione delle ferite, e le risposte infiammatorie si verificano entro 7 giorni di coltura con espianti presi in considerazione valida per circa 10 giorni ^14.

Protocollo

Questo protocollo è conforme al benessere Principi AVMA animali per la cura e l'uso di animali da laboratorio ed è stato approvato dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) a Midwestern University.

1. Preparazione di Anestesia, attrezzature, & Media

1. Declorurare circa 1,5 L di acqua di rubinetto per mezzo di un agente commerciale declorante (disponibile nei negozi di animali da compagnia) o il ristagno d'acqua per 24 ore. Ottenere tre bicchieri 1 L e riempire ogni con 500 ml di acqua senza cloro. Etichettare una per tenere il pesce prima di qualsiasi procedura e uno per il recupero. Per il terzo bicchiere, aggiungere 100 mg / ml di tricaine methanesulfonate; questo diventa il becher nel quale verranno anestetizzati pesci.
2. Riempire un vassoio poco profondo con ghiaccio, riscaldare il terreno di coltura (RPMI 1640, il 10% FBS (siero fetale bovino), 50 mg / ml di gentamicina, 100 mg / ml kanamicina, 25 HEPES mM) a RT, e raccogliere pinzette pulito del gioielliere. Pinzette pulite di immercantare le punte in etanolo al 70% e passare attraverso un becco Bunsen, permettendo l'etanolo a bruciare.
3. Decidere se la procedura sarà eseguita senza ingrandimento, con uno spot, tavolo illuminato lente di ingrandimento con 2 - 10X di ingrandimento, o dissezione microscopio (interamente dipendente preferenze personali).

2. Stabilire Culture Explant

1. Prendere il numero desiderato di pesce e mettere in un bicchiere di partecipazione. Trasferire un singolo pesce al bicchiere anestesia; è meglio per anestetizzare il pesce individualmente.
2. Monitorare gli effetti dell'anestesia osservando il nuoto e branchie movimento del pesce. Come anestesia progredisce, il movimento branchia rallenta e il pesce nuoterà in modo irregolare e spesso a testa in giù; considerare pesci anestetizzati, non appena il movimento branchia cessa. Non lasciare il pesce per periodi più lunghi nel bagno anestesia in quanto ciò potrebbe comportare la morte dei pesci.
3. Togliere il pesce dal bicchiere anestesia e trasferimentoin ghiaccio, mettendo il pesce orizzontalmente con la coda rivolta verso la mano che tiene le pinzette. Se sperimentato con la tecnica e se più pesci devono essere utilizzati per rendere espianti, è consigliabile inserire il pesce successivo nel becher anestesia in questo momento.
4. Per rimuovere squame, pinzette posizione parallela al pesce con punta a bordo della scala. Premere parte piatta delle pinzette leggermente sul lato del pesce a causare la scala di elevare dal corpo del pesce. Afferrare scala con le pinzette, cavalo, e il luogo (senza inversione) nel piatto di coltura di tessuti. Ripetere la procedura, la rimozione di un massimo di 12 scale di una grande per adulti (6 da ogni lato), evitando la regione gill, la linea laterale, e pinne.
5. Posizionare il pesce nel becher recupero e monitorare per assicurare che recupera dagli effetti dell'anestesia. In questo momento, i pesci possono essere trasferiti di nuovo ad un serbatoio di individuo. Lasciare che il pesce di recuperare per almeno 21 giorni per consentire la completa rigenerazione scala.
6. A seconda delladisegno sperimentale, posizionare fino a 20 scale per 35 millimetri piatto di plastica coltura trattata con tessuti o 4-6 scale per vetro piatto fondo. Consentire scale di aderire al piatto prima di aggiungere delicatamente supporti in modo da non staccare scale dal piatto.
   NOTA: Con l'esperienza, più pesci possono essere elaborati prima supporto viene aggiunto al primo piatto.
7. Aggiungere 1,2 ml di supporti completo (vedi 1.2 sopra) in ogni piatto da 35 mm.
8. Preferibilmente incubare culture espianto a 28 ° C in 5% di CO ₂ per il periodo di tempo desiderato, con o senza ulteriori trattamenti. In alternativa, incubare le culture su un palco microscopio riscaldata o all'interno di una camera di coltura cellulare dal vivo per la microscopia video.

3. Brightfield e Video Microscopy

1. Piatti di posizione contenenti fogli cellulari sul palco microscopio e inizialmente messa a fuoco utilizzando la lente dell'obiettivo 4X.
   NOTA: Higher ingrandimenti possono essere utilizzati, a seconda dell'esperimento. Marcatura la posizione diogni foglio e / o l'orientamento del piatto sulla scena cellule agevoleranno prendendo immagini nel tempo con i fogli in circa lo stesso orientamento.
2. Rimuovere piatti della incubatore e la fotografia in vari momenti, secondo ogni protocollo sperimentale e mettere di nuovo nel incubatore se sono necessari solo immagini fisse nel periodo di tempo sperimentale.
3. Durante l'esecuzione di microscopia video, prestare attenzione a quanto segue:
   1. Posizionare il / emergente strato cellulare scala all'interno del campo visivo tale che il foglio cellule migrazione rimane nel campo di vista per la durata del video.
      NOTA: Questo potrebbe richiedere una certa esperienza nell'osservare come le cellule migrano da sotto la scala. Per brevi video, questo è meno di una preoccupazione che per video più lunghi.
   2. Per tempi più brevi, incubare a RT. Per tempi più lunghi (18+ HR), utilizzare un palcoscenico riscaldata o una camera di incubazione per mantenere la temperatura, l'equilibrio del pH, e per ridurre al minimo l'evaporazione della cultura medium.

4. Fissazione per immunofluorescenza microscopia

1. Preparare e pre-caldo tutte le soluzioni a 28 ° C. Per visualizzare cheratociti in fluorescenza, crescere culture espianto come sopra descritto con 35 millimetri piatti con fondo di vetro colture di tessuti. In alternativa, utilizzare le diapositive da camera di vetro.
2. Aggiungere 0,8 ml di paraformaldeide al 4% in PBS 1.1x ad ogni piatto. Non rimuovere il terreno di coltura prima. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti quindi aspirare per rimuovere la soluzione.
3. Aggiungere 0,8 ml di paraformaldeide al 4% in PBS 1.1x ad ogni piatto. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti quindi aspirare per rimuovere la soluzione.
4. Salvo usando ligandi esterni o epitopi esterni, cellule permeabilize aggiungendo 0,5 ml di 0,2% Triton X-100 in PBS 1X. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti quindi aspirare per rimuovere la soluzione.
5. Aggiungere 0,5 ml di 1% BSA in PBS 1x e incubare per 1 ora (a RT) o O / N (a 4 ° C).
   NOTA: A seconda delle condizioni sperimentali, phalloidin può essere aggiunto in questa fase.
6. Dopo l'incubazione, aspirare per rimuovere la soluzione e procedere con l'anticorpo colorazione. In alternativa, memorizzare i piatti di coltura aggiungendo almeno 1 - 2 ml di 1% BSA in PBS 1x per 3 - 4 settimane a 4 ° C.

5. immunofluorescenza protocollo

1. Preparare le soluzioni di anticorpi primari e secondari secondo le raccomandazioni del costruttore.
   NOTA: Se le raccomandazioni del produttore non sono disponibili, una buona diluizione iniziale di anticorpi primari (in 1% BSA in 1x PBS) è di 1: 500 per policlonali e 1: 1.000 per gli anticorpi monoclonali; una buona partenza per la diluizione degli anticorpi secondari è 1: 1.000. Regolare questi diluizioni del ceppo originario da parte del produttore più alto se il segnale è debole, più basso se il segnale è forte e lo sfondo è un problema.
2. Aspirare il BSA 1% in soluzione 1x PBS. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di anticorpo primario e incubare per 1 ora (a RT) o O / N (a 4 ° C).
3. Rimuovere la soluzione di anticorpo primario, inserire in un ambiente pulito ed etichettato 1,5 ml provetta, e congelare a -20 ° C.
   NOTA: Questo permette il riutilizzo dell'anticorpo primario, se necessario.
4. Lavare il piatto 3 - 5 volte con 1x PBS, la rimozione e scartando il PBS dopo ogni lavaggio.
5. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di anticorpo secondario. Se lo si desidera, aggiungere falloidina fluorescenza marcata (seguito concentrazione raccomandata di qualsiasi produttore) durante questa fase. Incubare per 1 ora (a RT) o O / N (a 4 ° C).
   NOTA: L'uso di falloidina fluorescenza marcata permette la visualizzazione di filamenti di actina; abbiamo scoperto che falloidina 488 marcato funziona meglio nelle nostre cheratociti zebrafish, ma altri fluorofori possono essere utilizzati.
6. Rimuovere e scartare la soluzione di anticorpo secondario.
7. Lavare il piatto 3 - 5 volte con 1x PBS, la rimozione e scartando il PBS dopo ogni lavaggio.
   NOTA: Il piatto può essere memorizzato, coperto dalla luce, a 4 ° C se non è possibile view immediatamente; assicurarsi 1x PBS viene aggiunto nel piatto prima della conservazione per assicurare le cellule non si seccano ma caldo a RT (20 - 30 min), quindi rimuovere il PBS appena prima di procedere alla fase successiva.
8. Al momento di osservare, aggiungere 2 - 3 gocce di un mezzo di montaggio, con o senza DAPI, a seconda delle esigenze sperimentali, nel piatto e lasciate riposare per 10 minuti a RT.
   NOTA: Usiamo un mezzo di montaggio disponibile in commercio a base di glicerolo-con DAPI, ma altri mezzi di fissaggio possono essere utilizzati. Consentendo 10 min per il mezzo di montaggio per sedersi nel piatto consente una facile rimozione del vetrino di vetro dal fondo del recipiente.
9. Dopo l'incubazione, premere delicatamente ai lati del piatto per allentare e rimuovere il vetrino. Aggiungere un ulteriore calo dei mezzi di montaggio su un vetrino e porre il vetrino, celle in basso, sul vetrino.
   NOTA: Considerare tenuta il vetrino alla diapositiva con chiara unghia polacco se la diapositiva deve essere mantenuto per più di 1 - 2 giorni.
10. Osservare il vetrino sotto un microscopio a fluorescenza.
    NOTA: La maggior parte delle nostre immagini sono state scattate con una lente obiettivo 40X o 63X in olio da immersione, ma l 'obiettivo specifico utilizzato dipende dal protocollo sperimentale.

Risultati

Come illustrato in figura 1, fogli di cheratinociti possono essere osservati migrare da sotto la scala poche ore istituisce cultura espianto. Di tanto in tanto, un keratocyte migrazione personalizzato che si è staccato dal foglio collettivamente la migrazione può essere osservato. Inoltre, come è stato stabilito l'espianto da un pesce precedentemente pizzicate, ci sono abbondanti neutrofili migrano attraverso il foglio. Nei periodi più lunghi di cultura, i frammenti foglio keratocyte le cellule subiscon...

Discussione

La fase più critica per il successo della cultura keratocyte espianto sta permettendo la scala di aderire al piatto di coltura per circa 2 - 3 minuti prima dell'aggiunta del terreno di coltura. Circa il 75% di scale aderire e crescere fogli (il numero di culture stabiliti per ogni esperimento dovrà essere adeguato di conseguenza). Fogli Keratocyte non formano intorno ad ogni scala rimosso dal pesce e messo in coltura per diversi motivi. In primo luogo, DAPI colorazione di espianti rivela che alcune scale hanno poche...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre di coltura con fondo in vetro da 35 mm (rivestite in poli-D di lisina)	MatTek	P35GC-1.5-14-C	Lo spessore di 1,5 mm è il migliore per la rimozione del vetrino. Il diametro di 14 mm offre una maggiore area di coltura.
Pinze stile gioielleria svizzera, Integra, Miltex 17-303	VWR	21909-460	Riteniamo che le pinze strette e sottili funzionino al meglio per la rimozione delle incrostazioni.