Valutazione dell'invasione batterica delle cellule cardiache in coltura e colonizzazione cardiaca nei topi infetti utilizzando listeria monocytogenes

Sommario

La listeria monocytogenes causa infezioni fetali nelle donne in gravidanza e meningite nelle popolazioni sensibili. Le sottopopolazioni di batteri possono colonizzare il tessuto cardiaco, causando miocardite in pazienti e animali da laboratorio. Qui presentiamo un protocollo che descrive come valutare l'invasione delle cellule cardiache di L. monocytogenes in vitro e la colonizzazione cardiaca negli animali infetti.

Abstract

Listeria monocytogenes è un agente patogeno intracellulare facultativo Gram-positivo in grado di causare gravi infezioni invasive in pazienti immunocompro compromessi, anziani e donne in gravidanza. Le manifestazioni più comuni di listeriosi negli esseri umani includono meningite, encefalite e aborto fetale. Una sequela significativa ma molto meno documentata dell'infezione invasiva di L. monocytogenes coinvolge il cuore. Il tasso di mortalità per malattia cardiaca può essere fino al 35% nonostante il trattamento, tuttavia si sa molto poco per quanto riguarda la colonizzazione L. monocytogenes del tessuto cardiaco e le sue patologie risultanti. Inoltre, è recentemente diventato evidente che le sottopopolazioni di L. monocytogenes hanno una maggiore capacità di invadere e crescere all'interno del tessuto cardiaco. Questo protocollo descrive in dettaglio i metodi in vitro e in vivo che possono essere utilizzati per valutare il cardiotropismo degli isolati L. monocytogenes. Sono presentati metodi per l'infezione dei mioblasti cardiaci del ratto H9c2 nella coltura tissutale e per la determinazione della colonizzazione batterica dei cuori dei topi infetti. Questi metodi sono utili non solo per identificare i ceppi con il potenziale di colonizzare il tessuto cardiaco negli animali infetti, ma possono anche facilitare l'identificazione di prodotti genetici batterici che servono a migliorare l'invasione delle cellule cardiache e / o guidare cambiamenti nella patologia cardiaca. Questi metodi prevedono anche il confronto diretto del cardiotropismo tra più ceppi di L. monocytogenes.

Introduzione

La Listeria monocytogenes è un agente patogeno intracellulare gram-positivo in grado di causare gravi malattie nelle popolazioni sensibili, tra cui anziani, donne incinte, persone con HIV / AIDS e persone che ricevono la chemioterapia¹. L'infezione in queste popolazioni è spesso il risultato dell'ingestione di prodotti alimentari contaminati e la maggior parte delle infezioni sono associate a focolai di origine alimentare su larga^{scala 2,3}. Nell'uomo e in altri mammiferi, L. monocytogenes è in grado di trasporre attraverso il confine epiteliale dell'intestino tenue, per poi essere trasportato al fegato^4,5. I modelli a....

Protocollo

1. Condizioni di conservazione e coltura per i ceppi di L. monocitogeni

1. Preparare i supporti solidi autoclavando l'agar per infusione cervello-cuore (BHI) e versando il supporto fuso nelle piastre di Petri. Lasciare asciugare le piastre durante la notte a temperatura ambiente, quindi pernottare di nuovo a 37 °C.
2. Utilizzando un ciclo sterile, ottenere un piccolo campione di L. monocitogenes da scorte congelatori precedentemente realizzate (batteri sospesi al 20% di glicerolo in mezzi liquidi BHI, conservati a -80 °C) o da una piastra di agar contenente colonie precedentemente colpite per l'isolamento.
3. Usando la tecnica a....

Risultati

Isolati selezionati di L. monocytogenes mostrano una maggiore invasione delle cellule cardiache nella coltura cellulare e nei modelli di infezione dei topi. La figura 1 mostra un esempio di come le colonie batteriche possano apparire a seguito della placcatura spot delle sospensioni sui mezzi agar. Questo metodo consente una valutazione accurata dei CFC all'interno di un campione senza utilizzare un gran numero di piastre di supporto agar. La figura 2 mostra un esempio di saggio.......

Discussione

L. monocytogenes è un agente patogeno umano diffuso e ben caratterizzato, in grado di causare una serie di diverse manifestazioni di malattia¹⁵. Il batterio è stato precedentemente descritto per la sua capacità di trasporre attraverso barriere, come la barriera ematico-encefalica e le barriere placentare-fetali, al fine di raggiungere e colonizzare il sistema nervoso centrale e sviluppare il feto, rispettivamente. La capacità in vivo dell'organismo di colonizzare questi tessuti è spesso compl.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Difco	BHI Brodo Base	237200	2 kg di Brain Heart Infusion in polvere (senza agar)
Difco	Agar	214510	2 kg di Agar Granulato
Difco	BHI Agar	241810	2 kg di Brain Heart Infusion in Polvere con il 7,5% di Agar
in vitrogen	LB Broth Base	12975-084	2 kg di Luria Broth Base in Polvere (senza agar)
Fisher	Glass Vetrini coprioggetti	12-545-80	Vetrini coprioggetti in vetro da 12 mm
Piastra per coltura tissutale Falcon a 24 pozzetti	35-3047	Piastra per coltura tissutale trattata al plasma a 24 pozzetti Tubo per coltura tissutale
Falcon	14 ml	352051	Provette in polistirene da 14 ml
Piastra con fondo a U a 96 pozzetti	Falcon	35-3077	Piastra a 96 pozzetti non trattata per coltura tissutale
Corning	0,05% Tripsina, 0,53 mM EDTA (1X)	Soluzione madre 25-052-CI	di tripsina EDTA per coltura tissutale
Corning	DMEM (High glucose, high pyruvate)	15-013-CU	DMEM medium senza FBS, glutammina o antibiotici
Corning	Pen/Strep/Glut Solution	30-009-CI	Miscela madre di penicillina, streptomicina e L-glutammina per la coltura tissutale
Corning	Gentamicin	30-005-CR	50 mg/ml Soluzione madre di Gentamicina per coltura tissutale
Cellgro (Corning)	L-Glutammina	25005197	Soluzione madre di L-glutammina senza antibiotici
Denville	75cm^2 Flask	T1225	75 cm2 Flacone trattato per coltura tissutale
Denville	1,5mL	2013004	provette per microcentrifuga da 1,5 ml
ATCC	H9c2 Cardiaco Mioblasti	CRL-1446	Mioblasti cardiaci di ratto
Siero bovino fetale	Hyclone	SH30070.63	Siero bovino fetale