Valutazione sperimentale del mouse Socialità con un approccio Image Processing automatizzata

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per quantificare socialità mouse. I topi sono videoregistrati mentre si muovono e interagiscono in una gabbia speciale. trasformazione di film consente la quantificazione automatizzata di socialità con ottima precisione e affidabilità.

Abstract

Mouse è l'organismo modello preferito per testare i farmaci progettati per aumentare la socialità. Presentiamo un metodo per quantificare socialità topo in cui il mouse esame viene posto in un apparecchio standardizzato e relativi comportamenti sono valutati in tre diverse sessioni (chiamato sessione I, II, e III).

L'apparecchio ha tre scomparti (vedi figura 1), i compartimenti sinistro e destro contenere un bicchiere rovesciato che può alloggiare un mouse (chiamato "stimolo mouse").

In sede I, il mouse esame viene posto in gabbia e la sua mobilità è caratterizzata dal numero di transizioni effettuate tra i compartimenti. In sessione II, un topo di stimolo è posto sotto una delle tazze invertite e la socialità del mouse test viene quantificato dagli importi di tempo che trascorre vicino alla tazza contenente il mouse stimolo chiusa contro la tazza rovesciata vuoto. In sede III, le coppe invertite vengono rimossi un d entrambi i topi interagiscono liberamente. La socialità del mouse di prova in sessione III è quantificata dal numero di approcci sociali lo rende verso il mouse stimolo e per il numero di volte che evita un approccio sociale dal mouse stimolo.

La valutazione automatica del film rileva il naso del mouse test, che consente la determinazione di tutte le misure sociability descritte in seduta I e II (in sessione III, approcci vengono identificati automaticamente ma classificate manualmente). Per trovare il naso, l'immagine di una gabbia vuota viene sottratto digitalmente da ogni fotogramma del film e l'immagine risultante viene binarizzata per identificare i pixel del mouse. La coda del mouse viene rimosso automaticamente e i due punti più distanti del mouse restanti vengono determinati; queste sono vicino al naso e la base della coda. Analizzando il movimento del mouse e utilizzando argomenti di continuità, il naso è identificato.

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Figura 1. Valutazione di socialità durante 3 sessioni I (in alto):.. Acclimatazione di topo test per la gabbia Sessione II (centrale):. Prova del mouse si muove liberamente nella gabbia mentre il mouse stimolo è racchiuso in una tazza rovesciata Sessione III (in basso): Sia il mouse e mouse prova di stimolo sono autorizzati a muoversi liberamente e interagire con l'altro.

Introduzione

Socialità alterata è uno dei domini sintomo principale in una serie di disturbi dello sviluppo neurologico, inclusi i disturbi dello spettro autistico (ASD) ^1,2. Si limita gravemente la capacità dei pazienti di sviluppare relazioni e influisce notevolmente i pazienti, le famiglie e gli operatori sanitari ^2,3.

Nel tentativo di comprendere meglio il meccanismo alla base della socialità ridotta e sviluppare trattamenti, diversi modelli di topo sono stati studiati ^1,4-9. Uno di questi è il ceppo topo BALB / c, un ceppo inbred che presenta sorprendentemente bassa socialità, che assomiglia caratteristiche osservate in pazienti con ASD5 ^8-12. Ad esempio, il topo BALB / c mostra una minore frequenza di approcci sociali e una risposta di solito negativa approcci sociali da un mouse stimolo (ad esempio, evitamento sociale) che l'Swiss Webster comparatore ceppo ^10.

Per verificare se un trattamento proposto è effective ad aumentare la socialità, sono necessarie misure oggettive. Un quadro ampiamente accettata è quello di analizzare la socialità in un apparato standardizzato che ha tre scomparti (vedi Figura 1).

Gli scomparti a sinistra ea destra contengono ciascuno una coppa filo rovesciato che ospita un mouse stimoli socialmente saliente. Il mouse test viene rilasciato nell'apparecchio per tre intervalli di 10 min (sessioni I-III); sessione ho valuta l'attività locomotoria del mouse di prova, mentre le sessioni II e III valutare diversi aspetti della socialità del topo di prova.

In sede ho, il mouse di test è consentito di acclimatarsi all'apparato. In questa sessione, viene misurato il numero di transizioni che il mouse di prova rende tra i diversi comparti. È importante sottolineare che le misure socialità ottenuti negli apparati tre compartimenti di serie dipendono attività locomotoria e ridotta attività locomotoria possono confondere l'interpretazione dei sociDati abilità.

In sessione II, il mouse di prova si muove liberamente e un mouse stimolo è posto sotto una delle tazze invertite (controbilanciato). I topi sono di stimolo di 4 settimane topi ICR maschi outbred vecchi, età e sesso-abbinato ai topi di prova. Il mouse stimolo è racchiuso in un bicchiere rovesciato nel lato designato come vano sociale, ed un bicchiere rovesciato vuoto viene posizionato nel lato designato come vano non sociale. In sede II, la socialità del mouse test è quantificata confrontando il tempo che passa vicino alla coppa "sociale" invertita (meno di 2 cm di distanza) rispetto al tempo che passa vicino alla tazza rovesciata "non sociale", e per il momento spende nel vano sociali contro il tempo che trascorre nel vano non sociale. topi di confronto Swiss Webster trascorrono molto più tempo nel compartimento sociale e vicino alla tazza rovesciata sociale, rispetto ai topi BALB / c che mostrano nessuna preferenza significativa per il socialetazza rovesciata o il vano sociali ^12.

In sessione III, topi di prova e di stimolo possono interagire liberamente (tazze invertite vengono rimossi). Le misure di socialità, comportamenti stereotipati e le transizioni tra i compartimenti sono affidabile ottenuti nella terza sessione di 10 min di libera interazione tra prova e topi di stimolo e analizzati. In questa relazione, la socialità del mouse test viene quantificato tramite due misure: 1) il numero di approcci sociali rende verso il mouse stimolo, dove un approccio sociale è definito come movimento in avanti (naso prima) verso il mouse stimoli in modo che il il naso è inferiore a 2 cm di distanza dal mouse di stimolo; 2) il numero di evitamenti degli approcci sociali con il mouse stimolo. Il mouse test è considerato essere evitando l'approccio se gira o si allontana dal mouse stimolo, o se si ferma temporaneamente movimento ( "congelamento comportamento") dopo che il puntatore stimolo è avvicinato il mouse test. BALB /topi c mostrano una diminuzione del numero di approcci sociali realizzati verso il mouse stimolo e un aumento del numero di risposte negative approcci sociali nel topo stimolo, rispetto al Swiss Webster comparatore ceppo ^10.

La valutazione dei film comportamentali è stato tradizionalmente fatto manualmente, cioè, guardando il film con attenzione (eventualmente a velocità ridotta) e attivando cronometri per il tempo trascorre il mouse in un certo compartimento o vicino ad una delle tazze invertite ^10. Questo metodo richiede monitorando del film volte ed è, quindi, molto tempo. Inoltre, la precisione è limitata dal tempo di reazione del rater per le misurazioni del cronometro e la capacità di percepire se il mouse si trova a 2 cm di coppa rovesciata. In un lavoro recente, due composti, (D-serina e D-cicloserina) si sono dimostrati efficaci nel ripristinare la socialità in BALB topi / c ^9,10,12. È noto che sia componenti moduin ritardo il recettore NMDA, che è noto a svolgere un ruolo centrale nel comportamento sociale ^2,12. Una vasta gamma di composti è noto per modulare l'attività del recettore NMDA in una varietà di modi ben definiti, e il potenziale di una svolta nel trattamento ASD rende la valutazione accelerata di questi composti una priorità e un metodo automatico per la valutazione rapida altamente desiderabile.

Descritto di seguito è una procedura di analisi automatica sviluppata per la valutazione della socialità del mouse. Esso utilizza metodi di elaborazione delle immagini su tutti i fotogrammi di film mouse per identificare la posizione del mouse o topi. In sessioni I e II, rileva ulteriormente la posizione del naso e la usa per calcolare misure socialità. In sessione III, rileva automaticamente tutti gli approcci, ma è richiesta la classificazione manuale (approccio sociale, evitamento sociale, o altro).

Protocollo

Il protocollo per la facilità di spiegazione è stato suddiviso in 2 parti: 1) procedura sperimentale e 2) Analisi automatizzata. Tutti gli animali sono stati trattati secondo la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio ^15, e tutte le procedure sono state approvate dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali.

1. Procedura sperimentale

1. Impostare la gabbia, che è un plexiglas antiriflesso neri scatola rettangolare (52 x 25 x 23 cm ³⁾ divisa in tre scomparti: sociali, non sociali, e un vano centrale neutra (Figura 1). Mettere coppe filo invertite in ciascuno dei comparti finali durante le sessioni I e II (discusso sotto) e la casa del topo di stimolo durante la sessione II.
2. Impostare la fotocamera in modo che la gabbia riempie il campo visivo. Poiché illuminazione può interferire con quello del mouse, mantenere una luminanza di non più di 3,5 lux all'interno della gabbia, proveniente dalla luce indiretta dauna lampada ad incandescenza e misurata sul pavimento della gabbia in direzione verso l'alto. Anche utilizzare una sorgente di luce infrarossa, che i topi non può percepire ma la fotocamera può rilevare. Registrare tutti i film in 720 x 480 definizione standard.
3. Registrazione di un singolo fotogramma di una gabbia vuota per l'elaborazione delle immagini in seguito (chiamato il "quadro di riferimento") e salvare come immagine in scala di grigi.
4. Sessione I: introdurre il mouse di prova nella gabbia e Wave mano sopra la gabbia, che indica l'inizio della sessione (confrontare l'analisi automatizzata). Record di film per 10 min. Alla fine di 10 min, mettere il mouse avanti nella sua gabbia originale.
5. Sessione II: Mettere il mouse stimolo sotto una delle tazze invertite (controbilanciato).
6. Utilizzare il pulsante "Social sinistra" o "destra sociale" per selezionare se il mouse stimolo è nella tazza rovesciata a sinistra o nella tazza rovesciata sulla destra.
   NOTA: La tazza rovesciata con il mouse stimolo viene chiamato "coppa sociale", mentre l'altraCoppa del "calice non sociale". Il vano in cui la coppa sociale si trova è chiamato il comparto sociale, il vano con la coppa non sociale è il comparto non sociale, ed il vano centrale è la "vano neutrale".
7. Introdurre il mouse di prova nella gabbia. Onda mano sulla gabbia per indicare l'inizio della sessione. Record di film per 10 min. È importante sottolineare che, mantenere topi dell'apparato socialità prima di rimuovere le tazze invertite per iniziare Sessione III.
8. Sessione III: Rimuovere le coppe invertite, rilasciare entrambi i topi e permettere ai topi di prova e di stimolo di interagire liberamente con l'altro. Onda mano sulla gabbia per indicare l'inizio della sessione. Record di film per 10 min. Alla fine di 10 min, mettere entrambe topi nelle loro rispettive gabbie.

2. Analisi automatizzata

NOTA: I comandi nella sezione 2 sono rilasciati tramite un'interfaccia utente grafica (vedi figura 2), che concontrolli il nostro software. Qui spieghiamo il trattamento passo-passo che il nostro software permette; il software è anche in grado di realizzare l'analisi in modalità batch senza intervento dell'utente.

1. Per ogni film, eseguire le seguenti fasi di lavorazione:
   1. film di carico (pulsante Carica clicca).
   2. Selezionare la configurazione gabbia, che dice al programma di analisi della posizione dei confini della gabbia, i confini del vano, e le posizioni di coppa. Selezionare una delle quattro configurazioni salvate o regolare manualmente tutte le coordinate.
      NOTA: La configurazione normalmente non cambia da un esperimento all'altro e può quindi essere riutilizzato.
   3. Per ogni fotogramma del filmato, eseguire le seguenti fasi di lavorazione (2.1.3.1-2.1.3.6).
      1. Convertire il telaio in scala di grigio facendo clic sul pulsante "scala di grigi".
      2. sottrarre digitalmente il quadro di riferimento in scala di grigi (vedi punto 1.3) facendo clic sul pulsante "Sottrarre". NOTA: L'obiettivo di questa fase è quello di rendere le va pixellues del telaio molto vicino a zero ovunque tranne per la posizione del mouse.
      3. Binarizzare il telaio impostando tutti i pixel al di sotto di un certo livello di soglia al nero, tutti i pixel sopra di tale livello al bianco (fare clic sul pulsante "binarizzare").
         Nota: L'idea è che, poiché i pixel del mouse hanno generalmente valori più elevati rispetto ai rimanenti pixel, i pixel del mouse diventerà bianco e tutti gli altri pixel nero. Il livello di soglia ottimale dipende dalle condizioni di illuminazione e può essere determinata valutando la forma del mouse durante un film. Se la soglia viene scelta troppo bassa, il mouse appare troppo grande, e pixel che non appartengono al mouse può essere colorato bianco. Se la soglia è troppo alta, il mouse diventa piccola e può disintegrarsi in pezzi sconnessi. Nei film registrati, la soglia ottimale è sempre compresa tra 20 e 35 (su una scala da 0 a 255).
      4. Erodono ¹³ le binarizzate immagine e volte, poi si dilatano ¹³ 2e volte, poi erode volte ancora e, premendo il tasto "Erod / Dil".
         Nota: Lo scopo di questa procedura è di rimuovere la coda. Per la risoluzione (720 x 480) che è stato utilizzato, e = 3 lavorato in tutte le circostanze.
         Nota: Il software controlla automaticamente la presenza di una mano nella foto (durante la registrazione dei filmati, le mani sono agitò attraverso l'immagine per indicare l'inizio di una sessione). Se è presente una mano, ci saranno insolitamente molti pixel bianchi nel telaio binarizzata perché la mano è molto più grande di un topo. La condizione per la presenza di una mano è che ci sono più di 10.000 pixel bianchi nel telaio binarizzata. Il software determina l'inizio di sessioni I, II, e III, rilevando l'intervallo di fotogrammi in cui si verificano movimenti della mano.
2. In sessioni I e II, continuare come segue:
   1. Rilevare la più grande componente connessa dell'insieme di pixel bianchi (clicca "LComp"). Nota: Lo scopo of questo passaggio è quello di eliminare i pixel bianchi che non appartengono al mouse, ad esempio, causata dal movimento del mouse stimolo sessione II. Il più grande componente collegato è in quasi tutti i fotogrammi del mouse.
   2. Determinare i due pixel bianchi più lontani (chiamati i "fini" del mouse) cliccando su "Trova Ends".
      Nota: Il software stabilisce la continuità delle due estremità, cioè, per ciascuna delle estremità del primo telaio al quale delle estremità dei fotogrammi successivi appartengono. L'idea generale è che poiché le cornici sono rilevate al tasso alto, le estremità non possono viaggiare lontano da un fotogramma a quello successivo, in modo che per il corretto mantenimento delle estremità da un fotogramma successivo è quella che minimizza la somma delle distanze le estremità si muovono. Vedi la discussione per maggiori dettagli.
   3. Determinare quale fine del mouse è il naso.
      1. Determinare la direzione in cui un mouse mosse da osservare come il centro di gravità (COG)cambiamenti da fotogramma a fotogramma (moto della COG è il moto della somma di tutti i pixel di topo).
         Nota: Il COG di un insieme di pixel p _1, ..., p _n con coordinate x _1, .., x _n è definita da:
         
         I topi di solito si muovono in avanti (cioè verso il naso). In una sezione di diverse centinaia di cornici, c'è sempre molto alta fiducia nella rilevazione testa / coda.
         Nota: il software determina automaticamente verso quale delle rilevato termina il mouse è in movimento; questo scopo è identificato come il naso e contrassegnato con un cerchio rosso nel film. Quando il naso rilevato è contrassegnato con un cerchio rosso in ogni fotogramma, l'utente può controllare la qualità della rilevazione.
3. In sessione III, continuare come segue:
   1. Rileva due maggiori componenti di pixel bianchi.
      1. Se entrambi sono di dimensioni accettabili per AMOuse e le loro centri di gravità (COGS) sono compatibili con gli ingranaggi del mouse del fotogramma precedente, prendere in considerazione queste due componenti i due topi.
      2. Considerare il mouse di dimensioni accettabili, se non hanno cambiato di più del 20% dal momento che il fotogramma precedente, e prendere in considerazione ingranaggi della due fotogrammi consecutivi come compatibile se la loro differenza non è maggiore della distanza di un mouse può viaggiare nel tempo tra i fotogrammi (questa distanza segue dalla velocità massima del mouse, che può essere determinata come parte dei preparativi di una serie di esperimenti analizzando il movimento di vari topi individuali (come in sessioni i e II).
         Nota: Se i due componenti principali sono formati non accettabili per un mouse, o gli ingranaggi sono troppo diverse da quelle nel frame precedente, il software aumenta automaticamente la soglia di binarizzazione finché i due componenti principali sono di dimensioni accettabili e loro COGs sono compatibili con quelli del frame precedente.
   2. Clicca con il mouse provail primo fotogramma. Utilizzare l'analisi 2.3.1 per identificare sia di test e il mouse di stimolo in ogni fotogramma della sessione III.
   3. Identificare le cornici in sessione III in cui un mouse avvicina socialmente l'altro. Nota: Il software implementa questo passaggio controllando automaticamente che la distanza tra i topi è inferiore alla distanza tipica interazione dei topi (usiamo 2 cm).
   4. Quando il software gioca un breve segmento del film con l'approccio rilevato all'utente, selezionare un pulsante per indicare se questo approccio si qualifica come un approccio sociale dal mouse prova, evitamento sociale dal mouse di prova, o nessuno.
      Nota: Passo 2.3.4 può essere automatizzata se è noto che il mouse è il mouse di prova. Dal momento che queste informazioni si perde quando i topi diventano troppo vicini l'uno all'altro (o salire su uno sopra l'altro), e non dal momento che abbiamo ancora trovato un modo per etichettare i topi in un modo che può essere rilevato in modo affidabile dal nostro software e fa non influenzare il loro comportamento, abbiamo ritornati alclassificazione manuale per ora.
4. Per valutare i filmati elaborati, film di carico utilizzando il pulsante Carica.
   1. Fare clic su Start Sessione 1 per visualizzare il primo fotogramma della sessione 1 (o Inizia Sessione 2 per visualizzare il primo fotogramma della sessione 2).
   2. Clicca su Play / Stop per riprodurre e interrompere i filmati.
      Nota: I film elaborati verranno visualizzati il ​​mouse con la testa e la coda contrassegnati con cerchi di colore diverso. Tutte le misure socialità vengono visualizzati sullo schermo e aggiornati come il film gioca.
   3. Export socialità dati in formato Excel cliccando "Export".
   4. Clicca su "Compile dati" per compilare tutti i dati di tutti i filmati in una cartella in un unico file di Excel.

Risultati

La figura 3 mostra una struttura di colore di un film comportamentale con una gabbia vuota. Il mouse non è stato introdotto nella gabbia ancora. La posizione delle coppe, (sociali e non sociali) ei confini vano sono sovrapposte. La struttura di colore della gabbia vuota viene convertita in scala di grigi 8 bit, come mostrato in Figura 4 e utilizzato come sistema di riferimento. Il telaio di riferimento viene sottratto da ogni altro fotogramma del filmato acquisito.

Discussione

Combinando i topi videoregistrazione e l'analisi di film automatica, abbiamo creato un, affidabile tecnica di screening high-throughput a prezzi accessibili.

L'accuratezza dell'analisi automatizzata stato confrontato con i risultati delle analisi manuale per più di 100 film. Nella stragrande maggioranza dei telai (> 99%) di frame, il naso del mouse è identificato con buona precisione. La maggior parte dei (pochi) misdetections non hanno effetto sulle misure socialità, in modo che circa l'...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Gabbia in plexiglas	Norva Plastics, Norfolk, VA	su misura	Dimensioni e layout descritti nel manoscritto, possono essere regolati in base alle esigenze. Utilizzare plexiglas non riflettente per facilitare l'elaborazione delle immagini
Tazze in filo Cucina	plus	315	Utilizzare uno per alloggiare il mouse stimolo, una videocamera vuota
	SONY	HDR-PJ790	Può essere sostituito da qualsiasi fotocamera con Specifiche comparabili
OpenCV (libreria di elaborazione delle immagini)	Willow Garage	N/A È	possibile utilizzare qualsiasi libreria di elaborazione delle immagini moderna .