Qui, presentiamo un protocollo per determinare l'orientamento e la topologia delle proteine integrali di membrana nelle cellule viventi. Questo semplice protocollo si basa sulla sensibilità selettiva alla proteasi delle chimere tra la proteina di interesse e la GFP.
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Articolo metodologico
Determinazione Membrane Protein Topologia Usando fluorescenza Protease Protection (FPP)
In questo articolo
Sommario
Abstract
La corretta topologia e orientamento delle proteine integrali di membrana sono essenziali per il loro corretto funzionamento, ma tali informazioni non sono state stabilite per molte proteine di membrana. Viene presentata una semplice tecnica chiamata protezione della proteasi a fluorescenza (FPP), che consente di determinare la topologia delle proteine di membrana nelle cellule viventi. Questa tecnica presenta numerosi vantaggi rispetto ad altri metodi per determinare la topologia delle proteine, in quanto non richiede la disponibilità di più anticorpi contro vari domini della proteina di membrana, non richiede grandi quantità di proteine e può essere eseguita su cellule viventi. Il metodo FPP impiega le azioni spazialmente confinate delle proteasi sulla degradazione delle proteine di membrana marcate con proteina fluorescente verde (GFP) per determinarne la topologia e l'orientamento. Questo semplice approccio è applicabile a un'ampia varietà di tipi di cellule e può essere utilizzato per determinare l'orientamento delle proteine di membrana in vari organelli subcellulari come i mitocondri, il Golgi, il reticolo endoplasmatico e i componenti del sistema endosomiale/di riciclaggio. Le proteine di membrana, marcate sia sui terminali N che sui C-terminali con una fusione GFP, sono espresse in una cellula di interesse, che è soggetta a permeabilizzazione selettiva utilizzando la digitonina detergente. La digitonina ha la capacità di permeabilizzare la membrana plasmatica, lasciando intatti gli organelli intracellulari. Le frazioni GFP esposte al citosol possono essere degradate selettivamente attraverso l'applicazione di proteasi, mentre le frazioni GFP presenti nel lume degli organelli sono protette dalla proteasi e rimangono intatte. Il test FPP è semplice e i risultati possono essere ottenuti rapidamente.
Introduzione
Le membrane plasmatiche, nonché numerose membrane intracellulari, servono come barriere che separano due compartimenti acquosi. Nel caso della membrana plasmatica, la separazione è tra l'esterno e l'interno della cella; per organelli intracellulari che è tra il citoplasma e il lume organelli. Ad esempio, la membrana del reticolo endoplasmatico (ER) separa un ambiente ossidante all'interno del lume del ER da un citosolico riducendo ambiente 1. Le proteine di membrana sono sintetizzate sui ribosomi ER-associata, e raggiungere il loro topologia finale entro la membrana ER 2. L'acquisizione di un adeguato orientamento membrane e to....
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Protocollo
1. Generazione e convalida delle Chimere proteina fluorescente
- Append proteina fluorescente verde (GFP) alla ammino o carbossile termini della proteina di interesse utilizzando strategie di DNA ricombinante standard di 13.
NOTA: Anche se abbiamo utilizzato ampiamente GFP, altre varianti come la proteina ciano fluorescente (PCP), proteina fluorescente gialla (YFP), DsRed e mCherry possono essere impiegati. Miglioramenti in fluoroforo pieghevole efficienza, luminosità e fotostabilità vengono costantemente effettuati, e gli investigatori devono avvalersi dei costrutti di ultima generazione.- Confermare sequenza di DNA corretta e assi....
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Risultati
Plasma permeabilizzazione della membrana
Efficient permeabilizzazione della membrana plasmatica è determinato mediante l'uso di proteine fluorescenti solubili (ad esempio, GFP, DsRed) (Passaggio 4). Queste proteine, quando espresso in cellule, sono liberi di diffondere nel citosol, e vengono persi quando la membrana plasmatica è permeabilizzate con digitonina (Figura 2). Una completa scomparsa del segnale fluorescente dovrebbe avvenire entro 10-60 sec.......
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Discussione
L'orientamento e la topologia corretta delle proteine di membrana è essenziale per il loro corretto funzionamento. Nonostante l'importanza di comprendere la topologia proteina di membrana, ci sono molte proteine per i quali i dati sono del tutto carenti. FPP fornisce un modo semplice ed efficace per determinare topologia proteina di membrana, e uno che può essere eseguita dalla maggior parte dei laboratori. L'approccio FPP offre vantaggi significativi rispetto ai metodi precedenti per la determinazione d.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Desideriamo ringraziare la Calcium Imaging Core Facility di CMS per il loro aiuto e la loro guida nell'acquisizione e nell'analisi delle immagini. Questo studio è stato supportato dal National Institutes of Health (NIH) degli Stati Uniti HL102208 a N.A.B. Questo approccio è stato originariamente sperimentato da Holger Lorenz e Jennifer Lippincott-Schwartz al NIH.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | |
| Proteinasi K | Sigma | P2308 | |
| Tripsina | Sigma | T3924 | |
| Cav1-GFP | Addgene | 44433 | |
| pAcGFP-1 Golgi | Clontech | 632464 | |
| Polilisina | Sigma | P4707 | |
| Mezzi di montaggio | Dako | cS704 |
Riferimenti
- Sevier, C. S., Kaiser, C. A. Formation and transfer of disulphide bonds in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 836-847 (2002).
- Brodsky, J. L., Skach, W. R. Protein folding and quality control in the endoplas....
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Ristampe e permessi
