Qui si descrive un procedimento per inibire la funzione del gene in zanzare vettori di malattie attraverso l'uso di chitosano / RNA interferenti nanoparticelle che vengono ingeriti da larve.
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Articolo metodologico
Il chitosano / interferenti RNA nanoparticelle mediata silenziamento genico in Disease Vector Mosquito Larve
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Zanzare vettore infliggono sofferenze più umano di qualsiasi altro organismo - e uccidono più di un milione di persone ogni anno. I progetti genoma zanzara facilitato la ricerca in nuove sfaccettature della biologia della zanzara, inclusi studi genetici funzionali nel primario malaria vettore africano Anopheles gambiae e la dengue e la febbre gialla vettore Aedes aegypti. RNA interferenze (RNAi-) mediato silenziamento genico è stato utilizzato per colpire geni di interesse in entrambe le specie di zanzare vettori della malattia. Qui, descriviamo un procedimento per la preparazione di chitosano / interferenti nanoparticelle RNA che si combinano con il cibo e ingerite dalle larve. Questo tecnicamente semplice, ad alta velocità, e la metodologia relativamente poco costoso, che è compatibile con lunghi RNA a doppio filamento (dsRNA) o piccole interferenti RNA (siRNA) molecole, è stato utilizzato per il colpo di successo di diversi geni in A. gambiae e A. aegyptilarve. Dopo poppate larvali, atterramento, che viene verificata attraverso qRT-PCR o ibridazione in situ, possono persistere almeno fino alla fase avanzata di pupa. Questo metodo può essere applicabile ad un'ampia varietà di zanzare ed altri specie di insetti infestanti, compresi agricoli, nonché altri organismi non-modello. Oltre alla sua utilità nel laboratorio di ricerca, in futuro, chitosano, un polimero poco costoso, non tossico e biodegradabile, potrebbero essere utilizzati nel campo.
Introduzione
Zanzare sanguigni che alimentano vettore dei generi anofele e Aedine trasmettere agenti patogeni responsabili di alcuni dei peggiori flagelli dell'umanità. Si stima che 3,4 miliardi di persone sono a rischio di contrarre la malaria, che è responsabile di oltre mezzo milione di morti ogni anno in tutto il mondo. Risultati malaria da infezione da Plasmodium sp. Parassiti, che sono trasmessi alle persone attraverso le punture di zanzare infette del genere Anopheles, tra cui il principale vettore africano Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) 1. A....
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Protocollo
1. Mosquito Specie e allevamento
- Mantenere A. gambiae G3 e A. ceppi aegypti Liverpool IB12 (utilizzati negli studi rappresentativi sotto) o da altri ceppi di interesse secondo prassi di laboratorio standard o come descritto in precedenza 23,24.
2. dsRNA e siRNA Progettazione e Produzione
- Primer design per costruire modelli lunghi dsRNA specifiche per il gene di interesse. Utilizzare lo strumento E-RNAi 25. Produrre dsRNA secondo il metodo di scelta o come descritto in precedenza 19.
- Per un controllo negativo, sintetizzare dsRNA 19 c....
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Risultati
A. gambiae:
Nanoparticelle Chitosan / dsRNA si formano a causa della interazione elettrostatica tra i gruppi amminici del chitosano ei gruppi fosfato di dsRNA. L'efficienza di dsRNA incorporazione in nanoparticelle è generalmente superiore al 90% come misurato dalla deplezione del dsRNA dalla soluzione. Immagini microscopia a forza atomica mostrano che il chitosano-dsRNA medie dimensioni delle particelle 140 nm di diametro, che vanno 100-200 nm (Fi.......
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Discussione
Il chitosano / interferenti metodologia nanoparticelle RNA qui descritto è stato utilizzato per indirizzare efficacemente i geni durante lo sviluppo larvale in A. gambiae (figure 2, 3) e A. aegypti (figure 4, 5, 6, Tabelle 1, 2). Nanoparticelle chitosano possono essere preparati sia con lunghi dsRNA o siRNA, entrambi i quali sono stati utilizzati con successo in zanzare, come dimostrano i risultati rappresentativi qui descritti. Sintesi di dsRNA è meno costoso rispetto.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il finanziamento della Kansas Agricultural Experiment Station e del K-State Arthropod Genomics Center a KYZ ha sostenuto lo sviluppo originale del silenziamento genico mediato da chitosano/dsRNA in A. gambiae19. Il lavoro di A. gambiae qui descritto è stato supportato in parte da R01-AI095842 da NIH/NIAID a KM. Lo sviluppo del silenziamento genico mediato da chitosano/siRNA in A. aegypti20,21 è stato supportato dal premio NIH/NIAID R01-AI081795 a MDS. I contenuti di questo studio sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni ufficiali del NIH.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| pipettatore da 0,02 ml | Rainin | PR20 | per la risospensione di RNA interferente |
| Pipettatore da 0,2 ml | Rainin | PR200 | per la risospensione di RNA interferente e la preparazione di RNA/nanoparticelle interferenti |
| Provetta graduata da 0,5 ml | Fischer Scientific | 05-408-120 | per l'aliquotazione di RNA interferente risospeso |
| 1 ml pipettatore | Rainin | PR1000 | per la risospensione di RNA interferente e preparazione di RNA/nanoparticelle interferenti |
| Provetta graduata da 1,5 ml | Fischer Scientific | 05-408-046 | per la preparazione di RNA/nanoparticelle interferenti |
| 1M Acetato di sodio, pH 4,5 | TEKnova | S0299 | per preparare tampone acetato di sodio |
| Acido acetico, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade | BDH | VWR BDH3092-500MLP | per preparare il tampone di acetato di sodio |
| Agarosio Genetic Technology Grade | MP Biomedicals LLC. | 800668 | per rivestire RNA/nanoparticelle interferenti preparati |
| Centrifuga | Eppendorf AG | 5415D | per pellettare RNA/nanoparticelle interferenti |
| Chitosano, da gusci di gamberetti | Sigma-Aldrich | C3646-25G | per combinare con RNA interferente per la preparazione di RNA/nanoparticelle interferenti |
| Lievito secco | Universal Food Corp | NA | per preparare cibo larvale di zanzara con RNA interferente/ Strumento |
| E-RNAi per nanoparticelle | tedesco per la ricerca sul cancro | NA | per la progettazione di dsRNA; cibo per |
| pesci rossi | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | per preparare cibo larvale di zanzara con RNA/nanoparticelle interferenti |
| Bagno d'acqua riscaldato | Thermo Scientific | 51221048 | per riscaldare l'RNA/nanoparticelle interferenti a 55oC |
| Ghiaccio | non applicabile | non applicabile | per lo scongelamento dell'RNA interferente e la preparazione di RNA/nanoparticelle |
| [header] | |||
| Secchiello per il ghiaccio | Fisher Scientific | 02-591-44 | per la conservazione del ghiaccio utilizzato durante la procedura polvere di |
| fegato | MP Biomedicals LLC. | 900396 | per nutrire le larve di zanzara dopo il trattamento con RNA/nanoparticelle interferenti |
| Forno a microonde | Una varietà di fornitori | non applicabile | per preparare la petridia in soluzione di agarosio al 2% |
| (100 x 15 mm) | Camera di alimentazione di RNA/nanoparticelle interferenti | Fischer Scientific | 875713 |
| Misuratore di pH | Mettler Toledo | S220 | per la preparazione di tamponi |
| Lama di rasoio | Fischer Scientific | 12-640 | per dividere il pellet di RNA/nanoparticelle interferenti per l'alimentazione |
| siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | personalizzato | per la preparazione di siRNA/nanoparticelle |
| Solfato di sodio, anidro (Na2SO4) | BDH/distribuito da VWR | VWR BDH0302-500G | per preparare una soluzione di solfato di sodio da 50 mM in cui verrà l'RNA interferente termometro a sospensione |
| VWR | 61066-046 | per misurare la temperatura del bagno d'acqua | |
| Stuzzicadenti | VWR | 470146-908 | per l'agitazione durante la preparazione di alimenti a RNA/nanoparticelle interferenti e il taglio di pellet di gel |
| Congelatore ultrabasso | Una varietà di fornitori | non applicabile | per lo stoccaggio di aliquote di RNA interferenti e RNA/nanoparticelle interferenti a -80oC |
| Miscelatore a vortice | Fischer Scientific | 02-216-108 | per la preparazione di chitosano/RNA interferente |
| Grammatura in carta | Fischer Scientific | NC9798735 | per dividere il pellet di RNA/nanoparticelle interferenti per l'alimentazione |
Riferimenti
- Malaria. , World Health Organization. http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
- Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. http://www.cdc.gov/dengue/ (2014).
- Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organizat....
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Ristampe e permessi
