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Articolo metodologico

Utilizzando il mouse cellule tumorali mammarie per insegnare concetti di biologia di base: un modulo di laboratorio semplice

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⸱

DOI:

10.3791/52528

⸱

18 giugno 2015

 ,  , 
1Department of Natural Sciences, Marymount Manhattan College

In questo articolo

Sommario

Viene descritto un modulo di laboratorio fattibile per studenti universitari di biologia che esplora concetti cellulari e molecolari avanzati utilizzando colture cellulari animali. Gli studenti coltivano, caratterizzano e manipolano un modello di cellula di cancro al seno mediante esposizione ad agenti chemioterapici. La vitalità cellulare viene analizzata attraverso la conta cellulare utilizzando sia un metodo standard che innovativo.

Abstract

Gli studenti universitari di biologia sono tenuti ad apprendere, comprendere e applicare una varietà di concetti e tecniche di biologia cellulare e molecolare in preparazione per programmi biomedici, laureati e professionali o carriere scientifiche. Per affrontare questo problema, è stato ideato un semplice modulo di laboratorio per insegnare i concetti di divisione cellulare, comunicazione cellulare e cancro attraverso l'applicazione di tecniche di coltura cellulare animale. Qui la linea cellulare del tumore mammario di topo (MMT) viene utilizzata per modellare il cancro al seno. Gli studenti imparano a coltivare e caratterizzare queste cellule animali in coltura e testano gli effetti di agenti chemioterapici tradizionali e non tradizionali sulla proliferazione cellulare. In particolare, gli studenti determinano la concentrazione cellulare ottimale per la placcatura e la crescita delle cellule, imparano come preparare e diluire le soluzioni farmacologiche, identificare il miglior dosaggio e il miglior corso del tempo di trattamento degli agenti antiproliferativi e accertare il tasso di morte cellulare in risposta a vari trattamenti. Il modulo impiega sia una tecnica standard di conteggio cellulare che utilizza un emocitometro sia un nuovo metodo di conteggio cellulare che utilizza un software di microscopia. La procedura sperimentale si presta a un'indagine aperta in quanto gli studenti possono modificare i passaggi critici del protocollo, inclusi i test di agenti omeopatici e farmaci da banco. In breve, questo modulo di laboratorio richiede agli studenti di utilizzare il processo scientifico per applicare le loro conoscenze sul ciclo cellulare, le vie di segnalazione cellulare, il cancro e le modalità di trattamento, il tutto sviluppando una serie di abilità di laboratorio tra cui la coltura cellulare e l'analisi di dati sperimentali non insegnati di routine nelle aule universitarie.

Introduzione

Spesso in corsi di biologia generale, di laurea, i temi della regolazione del ciclo cellulare e cancro sono toccati, ma non approfondite in particolare perché l'ampiezza del contenuto di questi corsi lascia poco tempo per la profondità. Inoltre, gli studenti di biologia universitari in genere non sono esposti alle tecniche avanzate associate a colture cellulari animali. Per aiutare gli studenti a sviluppare una più profonda comprensione di questi concetti, durante l'applicazione e l'analisi di ciò che hanno imparato, una attività di laboratorio è stato sviluppato come una modifica del Walter Reed Army Institute di Ricerca (WRAIR) ha esteso l'attività di laboratorio 1. Il modulo laboratorio utilizza una strategia di sperimentazione graduale che include crescere e caratterizzare un modello di cellula tumorale, lo sviluppo e l'esecuzione di metodi di conteggio delle cellule, che stabilisce decorso ottimale e dosaggi per il trattamento di cellule con agenti anti-proliferativi, e individuando percorsi di segnalazione cellulare aberranti . L'esperimento consente inoltre apertoRichiesta -ended.

La maggior parte delle tecniche necessarie per questa attività può essere realizzato in un tipico laboratorio di biologia insegnamento. L'attività inizia con gli studenti che caratterizzano il tasso di morfologia e di crescita della linea di cellule tumorali del mouse mammaria (MMT), un modello per il cancro al seno umano 2. Il cancro al seno è stato scelto come modello di cancro a causa della sua prevalenza nella popolazione, la conoscenza di studenti universitari età, ed i dati diffusi disponibili. La linea cellulare MMT è stato appositamente selezionato perché è facilmente ottenibile, ben caratterizzato, ha un tempo di raddoppio breve ed è facile da coltivare. Inoltre, le cellule MMT sono estrogeno-dipendente, che è in linea con la maggior parte dei tumori al seno femminile. Gli studenti poi identificare i percorsi di segnalazione cellulare aberrante nelle cellule MMT trattando le cellule con farmaci chemioterapici cui meccanismo d'azione è ben established.The concentrazione dei farmaci e la lunghezza dei trattamenti sono variati consentendo agli studentiper valutare l'effetto di queste variabili sul tasso di divisione cellulare. Il test chiave per questa attività è la determinazione della vitalità cellulare, che richiede semplicemente il conteggio delle cellule, utilizzando uno dei due metodi. Ogni metodo dipende forti competenze microscopia. Gli studenti di determinare la vitalità cellulare, utilizzando un normale metodo emocitometro e un metodo photomicroscopy romanzo e propongono. Sulla base dei loro risultati, che possono proporre e testare le modifiche all'attività. Gli studenti poi rappresentano i loro dati e interpretare i risultati per perfezionare la loro ipotesi e mettere a punto nuove strategie sperimentali.

Questa attività di laboratorio è adatto per matricole o livello sophomore studenti, la specializzazione in scienze biologiche. Si è condensato in un modulo di laboratorio di una settimana che può essere completato in un primo anno, biologia generale e secondo anno, cellulare / molecolare corso di biologia. Competenze necessarie per il corretto completamento dell'attività includono aritmetica di base e algebra, la familiarità con una serie di ccompetenze di laboratorio minerale (per esempio, pipettaggio, fabbricazione soluzione tecnica sterile), l'analisi dei dati, la microscopia ottica e la gestione del tempo di base, insieme con la conoscenza istruttore di coltura cellulare e software del foglio elettronico. Reagenti richiesti comprendono un modello linea di cellule animali per il cancro (ad esempio, il mouse mammari cellule tumorali, MMT 2), agenti chemioterapici (ad esempio, il tamoxifene, la curcumina, la metformina, e aspirina), trypan blu cultura e di cellule di supporto (ad esempio, Minimum Essential Medium dell'Aquila ; EMEM) con i supplementi adeguati (per esempio, a cavallo dei donatori e siero fetale bovino). Gli strumenti necessari sono un microscopio invertito luce con attacco fotocamera digitale, computer, 100 mm e 24 piastre di coltura dei tessuti e, di CO 2 incubatore (o equivalente), armadio biosicurezza (BSC; classe II), emocitometro, e il software di microscopia digitale.

Ci sono buoni esempi di specifiche attività di laboratorio che si basano su colture cellulari animali a Teacstudenti universitari h sui concetti di biologia cellulare 3. Tuttavia molti richiedono forniture o tecniche che non sono facilmente accessibili (ad esempio, gli isotopi radioattivi, tessuti di animali vivi, attrezzature avanzate di imaging 1,4,5), descrivono i protocolli che sono abbastanza avanzati (ad esempio, adatto per un corso di 400 livello 6), o richiedere più settimane o semestre progetti lunghi 6,7. L'attività di laboratorio qui descritto è semplice e può essere effettuata in una sola settimana, con apparecchiature di laboratorio comune.

In sintesi, questo modulo laboratorio introduce efficacemente o rafforza i concetti di ciclo cellulare, vie di segnalazione cellulare e cancro, mentre l'insegnamento delle competenze di laboratorio di base e avanzate, analisi dei dati sperimentali, il metodo di coltura delle cellule animali e il processo scientifico. Il modulo di laboratorio è semplice ed economicamente accessibile e offre sia la flessibilità e opportunità per l'inchiesta a tempo indeterminato. L'attività incoraggia la creatività degli studentifornendo una strategia sperimentale modello che funge da guida, ma non una ricetta. Ancora più importante, l'attività soddisfa tutti i domini di apprendimento di Blooms Tassonomia 8 come si richiede a ricordare, la comprensione, l'applicazione, l'analisi, la valutazione e la creazione coinvolgendo gli studenti in un processo che li tira fuori del libro di testo e nel mondo della ricerca scientifica.

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Protocollo

Note: Comportamento tutto il lavoro con le cellule e reagenti colture cellulari in un armadio biosicurezza di classe II (BSC) 9. Cellule MMT sono classificati come livello di biosicurezza io, in quanto rappresentano basso a moderato rischio biologico. Applicare le procedure di pulizia e decontaminazione propri del BSC tra usi (ad esempio, la luce ultravioletta, il 70% di etanolo pulire giù).

1. Crescere le cellule MMT

  1. Crescere cellule in 10 centimetri piastre di coltura tissutale contenente 10 ml di mezzi ricchi di nutrienti che si compone di Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS), glutammina 2 mm e 1% contro funghi / antibiotici (10 unità di penicillina , 100 mg di streptomicina, 0,25 mg amfotericina B). Coltivare cellule in un umidificata al 5% camera di CO 2, a 37 ° C. Cellule piastra a una densità di 3,6 x 10 6 cellule / cm 2 (vedere il conteggio delle cellule al punto 2).
  2. Sostituire la metà dei mezzi di coltura cellulare con mezzi freschi ogni 48 ore Unless altrimenti indicato. Verificare la vitalità cellulare e la morfologia di un esame con un microscopio ottico a contrasto di fase invertito.
    1. Nota e caratterizzare le cellule per le dimensioni, la struttura, la forma, l'organizzazione e il numero stimato sotto a 100 - 200 ingrandimenti. A questa densità, le cellule devono apparire in un piano, non ragruppato uno sopra l'altro e nelle immediate vicinanze. Ogni cella è costituita da una spessa, nucleo sferico con estensioni, sottili, lunghe ramo-come espansione da essa che vengono a un punto (vedi figura 1).
  3. Suddividere cellule quando raggiungono una densità cellulare di 7,2 x 10 6 cellule / cm 2. Le cellule mostrano un tasso di raddoppio di 1,8 x 10 6 cellule / cm 2 per 24 ore. Designare cellule Passage X (Px) per indicare il numero di volte in cui sono state suddivise.
    1. Alla generazione 3 (ossia, dopo tre passaggi, P3), il raccolto, Numero, e piastra le cellule su una piastra di coltura tissutale 24 bene ad una densità di 3,6 x 10 6 cellule / cm 2.
  4. Vedi cellule ogni giorno e microfotografie digitali registrare. Nota e descrivere la morfologia delle cellule (ad esempio, dimensione, forma, luce proprietà riflettenti). Determinare cella raddoppio tempo contando le cellule regolarmente e relativo tempo trascorso al numero di cellulare.

2. Conta Cellule MMT

Nota: Contare le celle per determinare se le cellule hanno bisogno di essere subcoltura, a creare per un esperimento o per determinare la vitalità cellulare. Ci sono due metodi qui presentati.

  1. Uso di un emocitometro, una tecnica standard per contare le cellule.
    1. Ottenere un emocitometro luminoso-line, una soluzione allo 0,2% del trypan colorante blu, un microscopio ottico composto, provette sterili, pipette e un contatore di cellule manuale.
    2. Sotto il BSC, utilizzare una pipetta 10 ml per rimuovere le cellule da un 10 centimetri piatto di coltura di tessuti. Se le cellule sono coltivate su una piastra ben 24 usare una pipetta 1 ml o 1.000 micropipetta microlitri per rimuovere il supporto.
    3. Draw supporti cella nella pipetta, posizionare la punta della pipetta contro il fondo del piatto ed espellere il supporto mentre scorrere la punta della pipetta nella piastra. Ripeti 4-5 volte per aiutare a muovere le cellule, dissociarsi ciuffi e portare a una conta di cellule più accurato.
    4. Posizionare la sospensione cellulare risultante in una provetta sterile da 15 ml (1 ml o micro centrifuga o altro tubo piccolo volume). In caso contrario, lasciare le cellule nella piastra di coltura tissutale originale / bene.
    5. Sotto il BSC, unire 10 ml di sospensione cellulare con 10 ml di soluzione di blu di trypan (rapporto 1: 1) in una microcentrifuga non-sterile o altro tubo piccolo volume.
      Nota: blu Trypan è una colorazione vitale che non viene assorbito dalle cellule vitali sane. Quando le cellule sono danneggiate o morti, blu trypan possono entrare nella cellula permettendo cellule morte da contare (aka tingere metodo di esclusione). Pertanto al microscopio, le cellule morte appaiono viola scuro, mentre le cellule vitali sono un luminoso e di colore chiaro.
    6. Covarea temperatura ambiente per 5 min.
    7. Posizionare il vetrino sul emocitometro. Applicare 10 ml di miscela di sospensione di cellule blu trypan nella scanalatura. Visualizza il emocitometro a 100 - 200 ingrandimenti. Una griglia di quattro angolo è evidente (vedi figura 2).
    8. Contare il numero di cellule vitali (senza macchia) contro cellule totali in ogni area grigliata. Calcolare la media dei quattro griglie e moltiplicare per 1 x 10 4 per ottenere cellule / ml.
      1. Estrapolare il numero totale di cellule per piatto (o cellule / cm 2). Utilizzare questo numero per determinare sia il corretto volume della sospensione cellulare da utilizzare per inizializzare una nuova piastra di coltura tissutale alla densità desiderata di 3,6 x 10 6 cellule / cm 2 o determinare il numero totale di cellule vitali sul piatto o nel pozzo.
        Nota: Per ulteriori indicazioni sull'impiego di un emocitometro, vedere 10.
  2. Utilizzare il software e una fotocamera digitale per contare le cellule vitali.
    1. Ottenere una difotocamera gital, il suo software di accompagnamento, una soluzione 0,4% del trypan colorante blu, un microscopio ottico composto, provette sterili, pipette e un computer.
      Nota: Una fotocamera digitale Moticam 2.000 con accompagnamento Motic software è impiegato qui. Ogni fotocamera e del software comparabili dovrebbero essere sufficienti. Verificare che il software della fotocamera digitale è stato calibrato in anticipo (secondo il protocollo del produttore).
    2. Sotto il BSC, utilizzare una pipetta 1 ml o 1.000 microlitri micropipetta di rimuovere il supporto da parte delle cellule MMT che crescono in un 24 ben piatto di coltura di tessuti. Lavare le cellule aderenti applicando delicatamente una piccola quantità (circa 500 ml) di un-integrato (ovvero, EMEM senza supplementi) mezzi freschi al piatto poi rimuoverlo. Applicare 10 ml di 0,2% trypan blu (fatta diluendo 1: 1 con un-integrato EMEM) direttamente al pozzo.
    3. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 5 minuti.
    4. Osservando la lastra sotto il microscopio a 100 - 200 ingrandimenti won una fotocamera digitale collegata. Piatto può essere lavato con i media non integrate se colorazione con 2% trypan blu è troppo scura.
    5. Aprire il software sul computer un ND verificare che il software è calibrato per l'obiettivo utilizzato tramite la scheda Impostazioni. Dovrebbe apparire Un'immagine del FOV.
    6. Selezionare la griglia dalla scheda Misura. Circa apparirà 0,005 centimetri di larghezza Una griglia di quadrati. Selezionare Griglia Info per confermare l'area di ogni quadrato.
    7. Scegli una determinata area di griglia per contare le celle (cioè, 5 piazze x 9 quadrati). Selezionare Rettangolo dalla scheda Misura. Fare clic sull'angolo di un quadrato e trascinate il cursore per comprendere le piazze di scelta.
      Nota: Una tonalità di verde coprirà piazze di scelta e apparirà in un angolo che fornisce la larghezza, l'altezza, zona una scatola bianca, e il perimetro della sezione della griglia scelta (vedere Figura 3).
    8. Contare il numero di viabLe cellule all'interno dell'area determinata. Fare lo stesso per altre due località dello stesso bene o piatto spostando il piatto sotto il microscopio.
    9. Assicurarsi che l'area misurata è la stessa e l'ingrandimento non è cambiata. Calcolare il numero medio di cellule vitali all'interno dell'area. Utilizzando la zona del pozzo (per una piastra ben 24, un pozzetto ha una superficie di 2 cm 2, per un 100 mM piatto zona è 78,6 centimetri 2), estrapolare il numero di cellule vitali dalla zona delimitata nella griglia per il numero totale di cellule all'interno del pozzo (cellule / cm 2).

3. il trattamento di cellule MMT con agenti anti-proliferativi

  1. Preparare le soluzioni degli agenti selezionati anti-proliferative terapeutici (tamoxifene, la curcumina e metformina) e droga opzionale, aspirina sotto il BSC.
    1. Sciogliere curcumina e tamoxifene in 100% di etanolo per generare una concentrazione scorta di 27 mm. Sciogliere metformina e aspirina in unsupplemented EMEM per generare una concentrazione magazzino di 500 mm e 15 mm rispettivamente.
  2. Stabilire una risposta alla dose.
    1. Trattare cellule MMT con i tre agenti anti-proliferativi terapeutici (tamoxifene, la curcumina e metformina) e droga opzionale (aspirina) a diverse concentrazioni per 96 ore per generare una curva dose-risposta. Inizialmente amministrare tutti i farmaci in un intervallo di concentrazioni basati su rapporti pubblicati 1,11-16 e poi a concentrazioni maggiori o minori di quelli pubblicati.
      Nota: una dose risposta determina la concentrazione minima di un farmaco necessaria per produrre i risultati desiderati. Qui il risultato desiderato è una riduzione della proliferazione cellulare rispetto al controllo.
      1. Per tamoxifene e curcumina, utilizzare concentrazioni (e volumi corrispondenti) di 0,054 mm (1 ml), 0.108 mm (2 ml), 0.162 mm (3 ml) e 0.216 mm (4 pl).
      2. Per la metformina, utilizzare concentrazioni (e volumi corrispondenti) di 2 mm (2 microlitri), 4 mm (4 pl), 6 mm (6 pl), 8 mm (8 ml) e 10 mm (10 ml).
      3. Per l'aspirina, utilizzare concentrazioni (e volumi corrispondenti) di 0,030 mm (1 ml), 0,060 mm (2 ml), 0.099 mm (3,3 ml), 0.150 mm (5 ml), e 0.216 mm (6,7 ml).
    2. Split cellule MMT dal piatto 10 centimetri su una piastra 24 pozzetti ad una concentrazione di 3,6 x 10 6 cellule / cm 2. Calcolare la concentrazione cellulare iniziale con entrambi i metodi di conteggio cellulare (Fase 2). Chiamare questo nuovo piatto 24 bene di cellule "Giornata Split".
    3. 24 ore dopo la placcatura delle cellule, trattare le cellule MMT con ciascuno dei agenti terapeutici anti-proliferativa, tamoxifene, la curcumina, metformina e aspirina, alle concentrazioni descritti nel passaggio 3.2.1. Fare riferimento a questo come "giorno 0".
      1. Come ogni bene può contenere un massimo di 500 ml di mezzi di comunicazione, l'uso Micropipette con punte micropipetta sterile e una nuova punta ogni volta che un nuovo pozzo è trattato per evitare crcontaminazione oss. Utilizzare due pozzi come controlli: cellule coltivate in assenza di qualsiasi trattamento farmacologico (controllo negativo) e le cellule cresciute in presenza di 100% di etanolo (controllo solvente).
    4. Crescere le cellule e ri-somministrare farmaci alle concentrazioni descritte quando le cellule vengono alimentati a giorni alterni (vedere il punto 1.2) per 96 ore (fino al 4 ° giorno) nei giorni di 1 -. 4 di trattamento, osservare le cellule al microscopio e contare utilizzo il metodo nel passaggio 2.2 (vedi figura 4).
    5. Ripetere l'esperimento almeno tre volte.
    6. Determinare la concentrazione ottimale di ciascun farmaco rappresentando graficamente la relazione tra la vitalità cellulare e dosaggio del farmaco sulla durata dell'esperimento (vedere Figura 5).
  3. Stabilire un corso a tempo.
    1. Trattare cellule MMT con i tre agenti terapeutici anti-proliferative (tamoxifene, la curcumina e metformina) ad una concentrazione fisso per vari periodi di tempo. Utilizzare il identif concentrazione ottimaleied attraverso esperimenti Dose Response (vedi punto 3.2).
      1. Utilizzare i seguenti concentrazioni: 0,216 tamoxifene mM, la curcumina 0.216 mM e metformina 10 mm.
        Nota: Un corso tempo determina la quantità di tempo necessario per un farmaco per produrre il risultato desiderato ottimale. Qui, il risultato desiderato è una riduzione della proliferazione cellulare rispetto al controllo.
    2. Split cellule MMT dal piatto 10 centimetri su una piastra 24 pozzetti ad una concentrazione di 3,6 x 10 6 cellule / cm 2. Calcolare la concentrazione cellulare iniziale con entrambi i metodi di conteggio cellulare (Fase 2). Chiamare questo nuovo piatto 24 bene di cellule "Giornata Split".
    3. 24 ore dopo la placcatura delle cellule, trattare le cellule MMT con ciascuno dei agenti terapeutici anti-proliferativa, tamoxifene, la curcumina, metformina e aspirina, alle concentrazioni ottimali individuate nella Fase 3.2. Fare riferimento a questo come "giorno 0".
      1. Come ogni bene può contenere un massimo di 500 ml di media, noie Micropipette con punte micropipetta sterile e una nuova punta ogni volta che un nuovo pozzo è trattato per evitare la contaminazione incrociata.
      2. Utilizzare due pozzi come controlli: cellule coltivate in assenza di qualsiasi trattamento farmacologico (controllo negativo) e le cellule cresciute in presenza di 100% di etanolo (controllo solvente).
  4. Crescere le cellule e ri-somministrare farmaci alla concentrazione desiderata, quando le cellule vengono alimentati a giorni alterni (vedere il punto 1.2) per 96 ore (fino al 4 ° giorno). Nei giorni 1 - 4 di trattamento, osservare le cellule al microscopio e contare con il metodo nel passaggio 2.2 (vedere Figura 4).
  5. Ripetere l'esperimento almeno tre volte.
  6. Determinare il tempo di esposizione ottimale delle cellule MMT per ciascun farmaco rappresentando graficamente la relazione tra la vitalità cellulare e la lunghezza (tempo) di trattamento farmacologico alla concentrazione desiderata (vedere Figura 6).

4. Il modulo Lab

Nota: Il seguente è un giorno 5pianificazione laboratorio per il modulo laboratorio. figura 7 è un diagramma di flusso di ciò che il programma comporterebbe nei 5 giorni. Per questa attività da completare in cinque giorni è generato un ciclo di tempo o una curva dose-risposta. Non c'è il tempo sufficiente per generare entrambe le curve. Un esperimento risposta alla dose è descritto di seguito. Un esperimento decorso è facilmente intercambiabile

  1. Dividere la classe in gruppi: un gruppo ha stabilire una dose risposta e l'altro corso una volta scelta una concentrazione nel mezzo delle concentrazioni dose-risposta proposti.
    1. Mantenere le culture e le scorte di farmaci sufficienti a concentrazioni appropriate. Se non diversamente specificato, eseguire tutti i lavori sotto il BSC.
  2. Giorno 1
    1. Studenti diretti a rendere i media e crescere le cellule (come al punto 1).
    2. Come studenti ottengono uno stock di cellule MMT su una piastra 10 cm dirigere gli studenti di prepararsi terreni di coltura cellulare e dare un tutorial nell'uso del hemocytometer, microscopia digitale e il software microscopio fotocamera digitale (come al punto 2).
    3. Calibrare il software agli obiettivi utilizzati sul microscopio (ad esempio, 4X, 10X, 20X) ora utilizzando il protocollo del produttore.
  3. Day 2
    1. Invita gli studenti confermano numero totale delle cellule e la vitalità cellulare (come al punto 2).
    2. Gli studenti a contare le cellule sul piatto 100 millimetri utilizzando sia il software microscopia e metodi emocitometro, per confermare si ottengono risultati simili.
    3. Studenti diretti a ottenere un 24 piatto e split e cellule dal piatto 100 millimetri ai 24 pozzetti per l'avvio densità di placcatura cellulare desiderato (come al punto 1). Questo è considerato giorno Spalato. Posizionare la piastra a 24 pozzetti in un incubatore di coltura cellulare per 24 ore.
  4. 3 ° giorno
    1. Crescere cellule MMT per 24 ore su una piastra ben 24. Chiedere agli studenti di osservare le cellule sotto il microscopio e contano utilizzando il software microscopio (come al punto 2).
    2. Dare allo studente / teSono esempi di scorte di farmaci di trattamento del cancro. Avere a prepararsi e diluire la soluzione madre originale (come al punto 3). Aggiungere le varie concentrazioni dei farmaci nelle loro celle per stabilire una curva dose-risposta. Questo si chiama Giorno 0.
    3. Incubare le cellule (passo 1,2) con i farmaci per massimo di 48 ore.
  5. Giorno 4
    1. Chiedere agli studenti di osservare cellule trattate dopo 24 ore. Questo è il giorno 1.
    2. Contare ciascun pozzetto utilizzando il software microscopia. Fotografie record di ogni bene in modo che il conteggio possono essere condotte al di fuori del laboratorio (come al punto 2).
    3. Incubare le cellule (passo 1,2) con i farmaci per altre 24 ore.
      Nota: Istruttore fornisce esercitazioni supplementari e le opinioni di analisi dei dati e presentazione grafica. Gli studenti imparano a creare figure, grafici e analisi statistiche per il giorno successivo della raccolta dei dati.
  6. 5 ° giorno
    1. Hanno studenti cellule trattate dopo 48 ore, Giorno 2.
    2. Contare ognibene con il software microscopia. Fotografie record di ogni bene in modo che il conteggio possono essere condotte al di fuori del laboratorio (come al punto 2).
    3. Harvest e raccogliere le cellule per il conteggio con il metodo emocitometro tradizionale come mezzo per verificare la capacità studente utilizzare efficacemente il metodo software microscopia (step 2).
      Nota: Raccogliere i dati e trarre conclusioni o rivedere le ipotesi, di conseguenza.

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Risultati

Crescere cellule MMT e confrontando metodi di conteggio.

Cellule tumorali mammarie di topo furono cresciuti e caratterizzati con successo (Figura 1) e un metodo di conteggio cellulare romanzo sviluppato utilizzando Motic Software, un programma software della fotocamera associata digitale per microscopio. Questo nuovo metodo di conteggio delle cellule è stato confrontato con un metodo di conteggio tradizionale utilizzando un emocitometro (Figura 2) e...

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Discussione

Un modulo laboratorio è presentato che si propone di insegnare una varietà di argomenti in biologia cellulare attraverso le tecniche avanzate di coltura delle cellule animali. Il modulo realizza questo analizzando gli effetti di una serie di sostanze chimiche antiproliferativi sulla replicazione di cellule che modello di cancro al seno umano. Il saggio primario si basa sulla tecnica fondamentale del conteggio delle cellule e introduce un nuovo modo per contare le cellule usando il software microscopia. Le attività che c...

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Dichiarazioni

Gli autori hanno ricevuto alcun sostegno finanziario o comparabili da Motic.

Ringraziamenti

Questo lavoro è supportato dalla Joseph Alexander Foundation, dall'ASBMB Undergraduate Research Award, 2013-2014, e da un Science Award Grant, Marymount Manhattan College, 2012-2013.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cappa per coltura tissutale CappaESCO Labculture ReliantClasse II Tipo A2
Waterjactor CO2 IncubatoreCEDCOModello 1510
Emocitometro a linea chiaraAmerican Opticalcon due griglie separate
Motic Images PlusMac OSX Verison 2.0 o superiore
Gilson PipetmanRainin instrument co. incP-20D, P-200D, P-1000D
CK30/CK40 Microscopiocolture Microscopio a luce invertita a 4 obiettiviOlympus
con fotocamera 200 μ l Punte per pipetteMidSci40200C
1.000 μ l Punte per pipetteMidSciAVR4
10 ml Pipette seriologicheTPPTP94010
piastre da 24 pozzettiCoStar- Cluster di coltura tissutale352424 pozzetti, diametro 16 mm di pozzetti, sterilizzato con radiazioni
Soluzione blu di tripano 0,4%SigmaT8154100 ml, testato per colture cellulari non haz
Vetrino coprioggetto di ricambio per ematocitometro Bright-line, non hazSigma
cellule del tumore mammario di topo (MMT)ATCCCCL-51
Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM)ATCC30-2003500 ml
Siero fetale bovinoSigmaF0926500 ml
Metformina cloridratoSigmaPHR1084500 mg
TamoxifeneSigmaT5648polvere bianca o bianco-gialla
CurmuminSigmaC1386giallo-arancio in polvere
AspirinaSigmaA2093soddisfa le specifiche dei test USP
di sicurezza biologica per Z375357

Riferimenti

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