Usando fluorescenza cellulare attivo Ordinamento per esaminare Cell-Type-specifica espressione genica nel cervello di ratto tessuto

Summary

L'obiettivo di questo protocollo è utilizzare la tecnica di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per ordinare tipi specifici di cellule neurali per la successiva analisi dell'espressione genica specifica del tipo di cellula, dei marcatori epigenetici e/o dell'espressione proteica.

Abstract

Il cervello è composto da quattro tipi di cellule primarie, tra cui neuroni, astrociti, oligodendrociti e microglia. Pur non essendo il tipo di cella più abbondante nel cervello, i neuroni sono i più studiati di questi tipi cellulari dato il loro ruolo diretto nella impatto comportamenti. Altri tipi di cellule del cervello impatto anche la funzione e il comportamento dei neuroni attraverso le molecole di segnalazione che producono. I neuroscienziati devono capire le interazioni tra i tipi di cellule del cervello per capire meglio come queste interazioni impatto funzione neurale e la malattia. Ad oggi, il metodo più comune per analizzare proteine ​​o espressione genica utilizza l'omogeneizzazione di campioni di tessuto intere, di solito con il sangue, e senza riguardo per tipo di cellula. Questo approccio è un approccio informativo per l'esame cambiamenti generali del gene o l'espressione di proteine ​​che possono influenzare la funzione e il comportamento nervoso; Tuttavia, questo metodo di analisi non si presta ad una maggiore comprensione delle cellule-tipo-specifica espressione genica e l'effetto di comunicazione cellula-cellula sulla funzione neurale. Analisi dell'epigenetica comportamentali è stata una zona di crescente attenzione che esamina come modificazioni del acido desossiribonucleico (DNA) impatto struttura espressione genica a lungo termine e di comportamento; Tuttavia, queste informazioni possono essere rilevanti solo se analizzato in modo cellula-specifico tipo specificato lineage differenziale e pertanto marcatori epigenetici che possono essere presenti su alcuni geni dei singoli tipi di cellule neuronali. La fluorescenza cellulare attivo (FACS) tecnica descritta di seguito fornisce un modo semplice ed efficace per isolare le cellule neurali singole per la successiva analisi di espressione genica, l'espressione della proteina, o modificazioni epigenetiche del DNA. Questa tecnica può anche essere modificato per isolare più specifici tipi di cellule neuronali nel cervello per l'analisi di cellule-tipo specifico successiva.

Introduction

Lo scopo del protocollo descritto di seguito è isolare singoli tipi di cellule da una popolazione eterogenea di tessuto neurale per la successiva analisi dell'espressione genica specifica del tipo di cellula, dell'espressione proteica o persino dei marcatori epigenetici. Il cervello è composto da molti tipi di cellule che derivano da cellule progenitrici distinte e che hanno proprietà e funzioni specifiche del tipo di cellula. Nonostante queste differenze, questi distinti tipi di cellule neurali possono esprimere recettori simili e molecole di segnalazione intracellulare che rendono l'analisi di queste proteine più ubiquitarie difficile da misurare o interpretare in modo specifico per tipo di cellula utilizzando metodi convenzionali. I neuroscienziati devono identificare la funzione e l'attivazione di questi tipi di cellule distinte nel cervello e come possono influenzare individualmente il comportamento, poiché questo sarà in definitiva il primo passo per identificare farmaci più specifici e bersagli terapeutici per malattie neurologiche e neuropsichiatriche. Nonostante questo obiettivo generale della ricerca neuroscientifica, può essere difficile isolare singoli tipi di cellule neurali dal cervello per l'analisi dell'espressione genica o proteica, l'attivazione di molecole di segnalazione o la modifica di marcatori epigenetici sul DNA. Tra le tecniche attualmente utilizzate, l'immunoistochimica può identificare l'espressione delle proteine in modo specifico per il tipo di cellula se combinata con l'ulteriore colorazione di un marcatore specifico per il tipo di cellula, sebbene ciò si basi su anticorpi specifici che possono colorare correttamente per le proteine di interesse e può essere difficile da quantificare. L'ibridazione in situ può identificare la localizzazione specifica dell'acido ribonucleico messaggero (mRNA) in singole cellule del cervello, ma questo è un processo laborioso che limita anche la co-analisi di specifici tipi di cellule e consente solo l'analisi di uno o forse di pochi geni di interesse. La micro-dissezione a cattura laser utilizza un laser per isolare sottopopolazioni di cellule che vengono visualizzate tramite microscopia; tuttavia, la natura dispendiosa in termini di tempo di questo processo e la resa relativamente bassa possono limitare significativamente la successiva analisi delle proteine o dei livelli di mRNA, in particolare se l'espressione di queste molecole è bassa fin dall'inizio. Il cell sorting attivato dalla fluorescenza (FACS) è una tecnica relativamente nuova nel campo delle neuroscienze per isolare singoli tipi di cellule dal cervello per la successiva analisi dell'espressione genica¹ e/o dei bersagli epigenetici². Questo processo può essere utilizzato anche per ordinare tipi specifici di cellule neurali per la successiva analisi dell'espressione genica specifica del tipo di cellula, dell'espressione proteica o dei marcatori epigenetici. La FACS è stata utilizzata per decenni in una serie di campi di ricerca medica come il cancro e l'immunologia per contare e ordinare diverse cellule in base a caratteristiche fisiche o biochimiche³. Inoltre, la citometria a flusso è stata classicamente utilizzata per analizzare l'espressione proteica su base cellulare, utilizzando anticorpi specifici. La procedura descritta di seguito sfrutta le classiche tecniche di citometria a flusso per isolare i singoli tipi di cellule per la successiva analisi degli endpoint di biologia molecolare. Il citometro a flusso può analizzare diverse migliaia di cellule in un secondo, il che lo rende un'alternativa rapida ed efficiente alle tecniche sopra descritte. Inoltre, le cellule possono essere isolate in base all'espressione cellulare di una specifica proteina (ad esempio un recettore del neurotrasmettitore) o a una combinazione di due o più proteine (colocalizzazione di più proteine in un tipo di cellula specifico). Ciò consente all'utente di isolare tipi di cellule neurali molto selettive in base alle loro proprietà molecolari per identificare la loro funzione nel cervello.

Per eseguire il FACS, le cellule neurali vengono preparate in una sospensione a singola cellula che viene fatta passare attraverso una cella a flusso che trasporta e allinea le cellule in modo che passino in fila singola attraverso un raggio di luce e laser per l'analisi. Un computer acquisisce i dati da ogni cella e li traccia su un istogramma per l'analisi dei parametri specificati (dimensioni, granularità e fluorescenza). Sulla base di questi parametri, le cellule possono essere immediatamente ordinate in provette separate per il loro ricordo e la successiva analisi di qualsiasi punto finale desiderato. Il protocollo descritto di seguito utilizza tre anticorpi per selezionare i neuroni (utilizzando un antigene 1 del timocita, un anticorpo Thy1), gli astrociti (utilizzando un trasportatore gliale del glutammato, l'anticorpo GLT1) e la microglia (utilizzando un cluster di molecole di differenziazione 11B, anticorpi CD11b). Questo protocollo può essere utilizzato come descritto di seguito o modificato con anticorpi diversi a seconda del tipo di cellula che si desidera isolare per i propri esperimenti.

Ci sono alcuni avvertimenti da considerare quando si determina se questo protocollo è appropriato per esperimenti specifici. Un avvertimento importante può riguardare il tipo specifico di cellula che si desidera isolare. In questo protocollo, i tre anticorpi che vengono utilizzati sono anticorpi extracellulari, che permettono allo sperimentatore di mantenere intatti i tipi di cellule durante la procedura di colorazione, preservando così l'integrità dell'RNA, del DNA e delle proteine all'interno. È possibile che si desideri isolare uno specifico tipo di cellula neurale utilizzando un anticorpo che identifica una proteina che è espressa solo all'interno di quella particolare cellula. Ad esempio, si potrebbero voler isolare i neuroni dopaminergici usando un anticorpo contro la tirosina idrossilasi o isolare i neuroni dell'acetilcolina usando un anticorpo per la colina acetiltransferasi. Queste proteine sono intracellulari e quindi richiederebbero la fissazione e la permeabilizzazione della membrana cellulare per la successiva colorazione con gli anticorpi appropriati. Sebbene ciò sia stato fatto prima del ^4,5, questo processo può ridurre significativamente la resa di RNA o DNA da queste cellule permeabili. Un altro avvertimento potrebbe essere che non tutti gli anticorpi sono appropriati per la FACS. Ad esempio, attualmente si può utilizzare un anticorpo che funziona molto bene per il western blot, una tecnica che richiede la denaturazione delle proteine. Questo anticorpo potrebbe non essere necessariamente adatto per l'identificazione di questi tipi di cellule utilizzando FACS, dato che le proteine non sono denaturate in nessun punto di questo protocollo e quindi l'anticorpo potrebbe non avere modo di legarsi al suo antigene intrinseco. Le aziende forniscono schede tecniche che identificano le applicazioni per le quali un anticorpo è stato approvato. Se un anticorpo non è stato approvato per la citometria a flusso, non dovrebbe scoraggiare dal provare questo protocollo con un particolare anticorpo; tuttavia, bisogna essere consapevoli del fatto che non è garantito che funzioni per FACS. Un terzo avvertimento di questo protocollo ha a che fare con il numero di cellule che si sta cercando di isolare. La FACS è una tecnica eccellente per produrre il maggior numero possibile di cellule anche da un piccolo pezzo di tessuto, ma è anche possibile che se si desidera isolare una popolazione relativamente sparsa di cellule da una regione cerebrale relativamente piccola, la resa di un animale sarà intrinsecamente bassa. In questo caso, può essere necessario raggruppare il tessuto cerebrale di alcuni animali nello stesso gruppo di trattamento al fine di ottenere il numero di cellule necessarie per l'analisi successiva; tuttavia, una recente pubblicazione ha utilizzato la pre-amplificazione del cDNA mirata ai geni per la successiva analisi dell'espressione genica da un piccolo numero di neuroni attivati (5-6%) da un insieme più ampio di neuroni ordinati, indicando che è possibile analizzare l'espressione genica anche da piccoli sottogruppi di cellule neurali senza raggruppare un gran numero di animali⁶Un ultimo avvertimento di questa tecnica è che si dovrebbe avere accesso a un selezionatore di cellule che non sia troppo lontano. La selezionatrice cellulare è una macchina complicata che richiede una formazione significativa per essere utilizzata correttamente. Pertanto, queste macchine sono spesso gestite da un tecnico qualificato in una struttura principale. Inoltre, l'obiettivo di questa procedura è dissociare il tessuto neurale, colorarlo per anticorpi specifici e portare immediatamente quei campioni a uno smistatore entro un breve periodo di tempo (forse mezza giornata). Questo lasso di tempo contribuirà ad aumentare la sopravvivenza e la resa delle cellule isolate e a mantenere l'integrità delle cellule per la successiva elaborazione e analisi. Se tutti questi parametri sopra descritti sono soddisfatti, il FACS è un metodo eccellente per analizzare l'espressione specifica del tipo di cellula di geni e proteine dal tessuto neurale.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Delaware e la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

Protocol

1. Preparazione per la raccolta dei tessuti (15 – 30 min)

1. Lucidare a fuoco tre set di pipette Pasteur in vetro di diametro decrescente e numerarle "1" = circa 1 mm di diametro, "2" = circa 0,75 mm di diametro e "3" = circa 0,50 mm di diametro.
2. Risospendere l'enzima A liofilizzato con tutto il tampone A secondo il protocollo fornito con il kit di dissociazione neurale (vedi Tabella dei materiali). Non vortice. Aliquotare la soluzione in aliquote da 50 μl e conservare a -20 ºC per un uso successivo.
3. Preparare 1 litro di tampone per la rimozione della mielina e filtro sottovuoto per la sterilizzazione [tampone per la rimozione della mielina = 1.000 ml di soluzione salina tamponata con fosfato 0,1 M (PBS), 2 ml di acido etilendiamminotetraacetico 500 mM (EDTA) e 10 g di albumina sierica bovina (BSA)].
4. Tagliare il foglio di rete di nylon in piccoli quadrati da 1 x 1 pollice (2,5 x 2,5 cm) che verranno utilizzati per filtrare i detriti cellulari e l'autoclave in un piccolo bicchiere ricoperto di un foglio di alluminio.
5. Preparare 1 litro di tampone di lavaggio [tampone di lavaggio = 1.000 ml di 0,1 M PBS, 2 ml di 500 mM di EDTA e 10 g di BSA].

2. Raccolta dei tessuti

1. Accendere il bagnomaria a 37 ºC.
2. Preparare il tampone X dal kit di dissociazione neurale aggiungendo beta-mercaptoetanolo al tampone X fino a una concentrazione finale di 0,067 mM (per 4 campioni, aggiungere 13,5 μl di 50 mM di beta-mercaptoetanolo a 10 ml di tampone X).
3. Preparare la Miscela Enzimatica 1 mescolando 50 μl di Enzima P con 1.900 μl di Buffer X per ciascun campione, come descritto nel protocollo per il Neural Dissociation Kit. Ad esempio, per 4 campioni, mescolare 200 μl di Enzima P con 7.600 μl di Buffer X.
4. Mettere il tampone X nel bagnomaria a 37 ºC.
5. Mettere 2 ml di soluzione salina tamponata di Hank (HBSS) fredda (senza Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺) in un pozzetto di una piastra di coltura sterile a 6 pozzetti per ogni campione che verrà raccolto e conservare in ghiaccio per la dissezione tissutale.

3. Dissezione tissutale (45 min – 1 ora)

1. Iniettare nell'animale un volume appropriato di soluzione per eutanasia (soluzione di barbiturici commerciale, ad es. Euthasol), secondo le linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), e perfondere tutto il sangue con una soluzione salina fredda allo 0,9%.
   1. Somministrare ai ratti un'overdose di soluzione per eutanasia.
   2. Monitorare l'anestesia attraverso la respirazione e il pizzicamento delle dita. Quando l'animale è sufficientemente anestetizzato (nessuna risposta al pizzicamento delle dita dei piedi e respirazione profonda e lenta), il ratto può essere perfuso.
   3. Per perfondere il topo, tagliare la cavità toracica con un paio di forbici pesanti. Tagliare il diaframma per consentire l'accesso fino al cuore. Taglia le costine lungo entrambi i lati fino alla parte superiore del petto, per consentire il pieno accesso al cuore. A quel punto, la gabbia toracica può essere tenuta di lato utilizzando un paio di emostatici.
   4. Eseguire la perfusione cardiaca inserendo un ago da 18 G (per ratti adulti) collegato a una pompa elettrica nel ventricolo sinistro del cuore. La pompa aspira una soluzione salina fredda allo 0,9%.
   5. Quindi taglia l'atrio destro con un piccolo paio di forbici per consentire al sangue e al perfusato liquido di defluire dal corpo.
   6. Perfondere i ratti con circa 10 ml (per i ratti adulti) di soluzione fisiologica allo 0,9% per rimuovere tutte le cellule e i fattori immunitari periferici.
2. Sezionare la parte desiderata della regione del cervello utilizzando lame di rasoio sterili e un'appropriata dissezione, quindi posizionare i pezzi di tessuto nell'HBSS freddo senza Ca²⁺ e Mg²⁺.
   NOTA: Il protocollo richiede HBSS senza Ca²⁺ e Mg²⁺ nelle prime fasi del protocollo, poiché questi ioni possono interferire con gli enzimi necessari per la dissociazione neurale.
3. Dopo che tutti i campioni di tessuto sono stati raccolti, rimetterli al banco pulito o alla cappa di coltura sterile per il trattamento dei tessuti.

4. Dissociazione neurale (1 ora)

1. Tagliare ogni campione di tessuto in piccoli pezzi utilizzando lame di rasoio sterili sul coperchio della piastra di coltura a 6 pozzetti. Questo protocollo è stato utilizzato per campioni di tessuto di circa 30 - 100 mg, ma è approvato per campioni di tessuto fino a 400 mg. Per campioni di tessuto di dimensioni superiori a 400 mg, i volumi dei reagenti devono essere aumentati in modo appropriato.
2. Utilizzare 1 ml di HBSS fresco senza Ca²⁺ e Mg²⁺ per trasferire i pezzi di tessuto tagliati a dadini con una pipetta in una provetta da centrifuga sterile da 2 ml. Ripetere i passaggi 4.1 e 4.2 per tutti i campioni fino a quando tutti i campioni non sono stati trasferiti in una provetta da centrifuga da 2 ml.
3. Centrifugare i campioni a 300 x g per 2 minuti a RT e aspirare il surnatante.
4. Aggiungere 1.900 μl di Enzyme Mix 1 caldo, come preparato nei passaggi 2.2 e 2.3, a ciascun campione e chiudere le provette.
5. Incubare i campioni per 15 minuti nel bagno d'acqua a 37 ºC, capovolgendo le provette più volte ogni 5 minuti per risospendere i pezzi di tessuto depositati.
6. Nel frattempo, preparare la Miscela Enzimatica 2 mescolando 20 μl di Buffer Y con 10 μl di Enzima A scongelato (per 4 campioni, mescolare 80 μl di Buffer Y con 40 μl di Enzima A scongelato).
7. Aggiungere 30 μl di Enzyme Mix 2 a ciascun campione e capovolgere delicatamente. Non vortice.
8. Dissociare ogni campione di tessuto con la pipetta Pasteur "1", triturando su e giù 30 volte.
9. Incubare i campioni per 15 minuti in un bagno d'acqua a 37 ºC; capovolgere le provette più volte ogni 5 minuti per risospendere i pezzi di tessuto depositati.
10. Dissociare ogni campione di tessuto con la pipetta Pasteur "2", triturando su e giù 30 volte. Evita di generare bolle.
11. Dissociare ogni campione di tessuto con la pipetta Pasteur "3", triturando su e giù 30 volte. Evita di generare bolle.
12. Incubare i campioni per 10 minuti in un bagno d'acqua a 37 ºC; capovolgere le provette più volte ogni 5 minuti per risospendere le cellule depositate.
13. Applicare la sospensione unicellulare a un ceppo cellulare da 80 micron posizionato sopra una provetta di falco da 15 ml per rimuovere eventuali detriti di grandi dimensioni e lavare il filtro e le cellule con 10 ml di HBSS (con Ca²⁺ e Mg²⁺) per arrestare le reazioni enzimatiche. Ripetere l'operazione fino a quando ogni campione non viene trasferito in una provetta con falco da 15 ml pulita.
14. Centrifugare i campioni a 300 x g per 10 minuti a RT e aspirare il surnatante.

5. Deplezione della mielina (45 min)

1. Risospendere accuratamente il pellet di cellule con 400 μl di tampone di rimozione della mielina.
2. Aggiungere la quantità specificata di perle per la rimozione della mielina e pipettare su e giù per mescolare accuratamente.
   NOTA: Il volume delle perle per la rimozione della mielina utilizzate dipenderà dalle dimensioni del tessuto, dall'età dell'animale e dalla quantità di mielina prevista in quella particolare regione del cervello. Ad esempio, per un campione di ippocampo di ratto adulto (circa 300 mg), incubare il campione con 100 μl di perle per la rimozione della mielina.
3. Incubare per 15 minuti in frigorifero a 4 ºC.
4. Lavare ogni campione con 5 ml di tampone per la rimozione della mielina.
5. Centrifugare i campioni a 300 x g per 10 minuti a RT.
6. Durante la centrifugazione dei campioni, posizionare 1 colonna per ogni campione nel campo magnetico del selezionatore magnetico e posizionare un filtro pulito da 80 micron sopra ogni colonna.
7. Preparare le colonne e filtrare risciacquando ogni colonna con 1 ml di tampone per la rimozione della mielina, 3 volte (3 ml in totale). Raccogliere tutto il flusso in un contenitore per rifiuti, come il fondo di una scatola di puntali vuota.
8. Posizionare una provetta a fondo tondo in polistirene da 5 ml direttamente sotto ciascuna colonna in preparazione della raccolta del campione.
9. Al termine della centrifugazione delle cellule, aspirare il surnatante e risospendere accuratamente in 500 μl di tampone per la rimozione della mielina. Applicare immediatamente la sospensione cellulare alla colonna e raccogliere le cellule nella provetta sottostante.
10. Lavare il filtro e la colonna con 1 ml di tampone per la rimozione della mielina, 4 volte (4 ml in totale).
11. Centrifugare la raccolta cellulare a 300 x g per 10 minuti a RT.
12. Aspirare il surnatante e le cellule sono ora pronte per la colorazione.

6. Colorazione di cellule vive per FACS (1 ora per la colorazione)

1. Agitare brevemente (2 sec) le cellule per separare il pellet e aggiungere immediatamente 5 μl di blocco Fc (anti-cluster di differenziazione 32, CD32), agitare nuovamente e incubare in frigorifero a 4 ºC per 5 min.
2. Nel frattempo, preparare la miscela di anticorpi primari aggiungendo i tre anticorpi primari nel tampone di lavaggio come segue: 0,125 μl di anticorpo CD11b coniugato con alloficocianina (APC) (1:800), 1 μl di anticorpo anti-GLT1 (1:100) e 0,4 μl di isotiocianato di fluoresceina (FITC) – anticorpo Thy1 coniugato (1:250) per ogni 100 μl di tampone di lavaggio. Ogni campione riceverà 100 μl di miscela di anticorpi primari per l'incubazione; Tuttavia, se il campione è molto più grande di 400 mg di tessuto, si consiglia di aumentare di conseguenza il volume della miscela di anticorpi primari
3. Preparare le provette per i controlli di colorazione singola rimuovendo solo 2 μl di cellule da ciascuna provetta del campione e aggiungendole a ciascuna provetta di controllo della colorazione. I controlli "a colorazione singola" includono: solo APC-CD11b, solo GLT1, solo FITC-Thy1, solo anticorpi secondari PE e il controllo "bianco" o non colorato.
   NOTA: Tutti i campioni devono essere rappresentati in tutti i controlli di colorazione, quindi 2 μl di cellule di ciascun campione devono essere aggiunti a ciascuna provetta di controllo della colorazione.
4. Agitare brevemente le provette (2 sec) e aggiungere 100 μl di miscela di anticorpi primari a ciascuna provetta campione e 100 μl di anticorpo primario appropriato a ciascuna provetta di controllo della colorazione, agitare nuovamente le provette, coprire le provette con un foglio di alluminio per proteggere gli anticorpi fluorescenti dalla luce e incubare le provette in frigorifero a 4 ºC per 20 minuti. I campioni devono essere mantenuti freschi (a 4 ºC) per il resto della procedura per mantenere l'integrità dei campioni e degli anticorpi.
5. Agitare brevemente le provette e aggiungere 2 ml di tampone di lavaggio a ciascuna provetta.
6. Provette da centrifuga a 350 x g per 5 min a 4 ºC.
7. Nel frattempo, preparare la miscela di anticorpi secondari aggiungendo 0,2 μl di anticorpo secondario anti-coniglio coniugato con PE per ogni 100 μl di tampone di lavaggio. Ogni campione riceverà 100 μl di miscela di anticorpi secondari; Tuttavia, se il campione è molto più grande di 400 mg di tessuto, si consiglia di prendere in considerazione l'idea di aumentare di conseguenza il volume della miscela di anticorpi primari.
8. Al termine della centrifugazione, versare il surnatante di ciascun campione nel lavandino e tamponare le provette capovolte su un tovagliolo di carta.
9. Agitare brevemente le provette e aggiungere 100 μl di miscela di anticorpi secondari a ciascuna provetta campione e l'anticorpo secondario appropriato a ciascun controllo di colorazione, agitare nuovamente le provette, coprire le provette con un foglio di alluminio e incubare le provette in frigorifero a 4 ºC per 15 min.
   NOTA: La provetta di controllo della colorazione solo GLT1 dovrebbe ricevere la miscela di anticorpi secondari.
10. Dopo l'incubazione, agitare brevemente le provette e aggiungere 2 ml di tampone di lavaggio a ciascuna provetta.
11. Centrifugare le provette a 350 x g per 5 minuti a 4 ºC.
12. Al termine della centrifugazione, versare il surnatante di ciascun campione nel lavandino e tamponare le provette capovolte su un tovagliolo di carta.
13. Agitare le provette e aggiungere 0,25 ml di PBS sterile a ciascuna provetta. I campioni sono pronti per lo smistamento.
    NOTA: Più cellule possono richiedere 0,5 ml di PBS sterile; Tuttavia, è meglio iniziare con un volume inferiore, poiché il campione può sempre essere diluito se è troppo concentrato con le cellule.
    NOTA: Opzionalmente aggiungere DNasi alla provetta per evitare l'aggregazione delle cellule e quindi l'intasamento della selezionatrice. I campioni possono anche essere filtrati utilizzando un filtro sterile da 80 micron appena prima dello smistamento per evitare l'intasamento dello smistatore.
14. Portare le celle allo smistatore con ghiaccio. Raccogliere le popolazioni cellulari in provette da centrifuga da 2 ml prive di nucleasi con 0,5 ml di PBS sterile in ciascuna provetta.
15. Dopo la selezione, centrifugare le cellule a 300 x g per 2 minuti a 4 ºC. Aspirare la maggior parte del PBS e congelare le cellule nel congelatore a -80 ºC fino a un'ulteriore elaborazione per l'estrazione dell'RNA (vedere 1 per ulteriori dettagli sul protocollo), l'estrazione del DNA (vedere 2 per ulteriori dettagli sul protocollo) o la lisi cellulare per l'analisi delle proteine.

Results

L'importanza della deplezione della mielina e della perfusione tissutale

La Figura 1 illustra l'importanza della deplezione della mielina. La deplezione della mielina (passaggi da 5.1 a 5.12 del protocollo precedente) si verifica quando la sospensione a singola cellula viene incubata nelle perle di rimozione della mielina, lavata e successivamente passata attraverso la colonna sul selezionatore magnetico. Lo scopo di questi passaggi è ridurre la quantità di detriti cellulari p...

Discussion

Simile a molti altri tessuti e sistemi, il cervello è composto da una popolazione cellulare eterogenea che funziona insieme per influenzare il comportamento. L'analisi dell'espressione genica, dell'espressione proteica o delle modificazioni epigenetiche di singole cellule all'interno di quella popolazione eterogenea ha il potenziale di rivelare informazioni sulla funzione del sistema nel suo complesso, di identificare i processi cellulari che regolano sia il comportamento normale che i processi patologici e di fornire be...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit di dissociazione neurale (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
Perle di rimozione della mielina II	Miltenyi Biotec	130-096-733
Colonne LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
Separatore QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Foglio di rete di nylon	Amazon	CMN-0074-10YD	40 pollici di larghezza, 80 micron di maglia
Blocco Fc / anti-CD32	BD Biosciences	BDB550270	reattività per il ratto
APC-coniugato CD11b anticorpo	Biolegend	201809	reattività per ratto
Coniglio anti-GLT1	Novus Biologicals	NBP1-20136	reattività per ratto o
umano PE-coniugato anti-coniglio anticorpo secondario	eBioscience	1037259	anticorpo secondario anti-GLT1
FITC-coniugato anti-ratto CD90 (Thy1) anticorpo di topo	Biolegend	202504	reattività per il ratto