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Articolo metodologico

Oro nanorod-assistito stimolazione ottica di cellule neuronali

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DOI:

10.3791/52566

⸱

27 aprile 2015

 ,  , 
1Biotactical Engineering, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo delinea come utilizzare il riscaldamento transitorio associato all'assorbimento ottico delle nanobarre d'oro per stimolare la differenziazione e l'attività intracellulare del calcio nelle cellule neuronali. Questi risultati aprono potenzialmente nuove applicazioni nelle protesi neurali e negli studi fondamentali nelle neuroscienze.

Abstract

Studi recenti hanno dimostrato che i nervi possono essere stimolati in vari modi dal riscaldamento transitorio associato all'assorbimento della luce infrarossa da parte dell'acqua nel tessuto neuronale. Questa tecnica ha un grande potenziale per sostituire o integrare le tecniche di stimolazione standard, a causa del potenziale di una maggiore localizzazione dello stimolo e della minimizzazione del contatto meccanico con il tessuto. Tuttavia, gli approcci ottici sono limitati dall'incapacità della luce visibile di penetrare in profondità nei tessuti. Inoltre, la modellazione termica suggerisce che gli effetti cumulativi del riscaldamento potrebbero essere potenzialmente pericolosi quando vengono utilizzati più siti di stimolo o alti tassi di ripetizione laser. Il protocollo descritto di seguito descrive un approccio avanzato alla stimolazione infrarossa delle cellule neuronali. Il meccanismo sottostante si basa sul riscaldamento transitorio associato all'assorbimento ottico delle nanobarre d'oro, che può causare l'innesco della differenziazione delle cellule neuronali e l'aumento dei livelli di attività intracellulare del calcio. Questi risultati dimostrano che gli assorbitori di nanoparticelle possono migliorare e/o sostituire il processo di stimolazione neurale a infrarossi basato sull'assorbimento d'acqua, con un potenziale per future applicazioni nelle protesi neurali e nelle terapie cellulari.

Introduzione

Recenti studi hanno dimostrato che il riscaldamento transitoria associata con l'assorbimento di luce infrarossa da acqua (lunghezza d'onda> 1.400 nm) può essere utilizzato per indurre potenziali di azione nel tessuto nervoso 1 e transienti di calcio intracellulare in cardiomiociti 2. L'uso di luce infrarossa ha suscitato notevole interesse per applicazioni in protesi neurali, a causa della potenziale risoluzione spaziale più fine, di un contatto diretto con il tessuto, la minimizzazione degli artefatti di stimolazione, e la rimozione della necessità di modificare geneticamente le cellule prima della stimolazione ( come richiesto in optogenetics) 1. Nonostante tutti questi vantaggi, modelli termici recentemente sviluppati suggerito che i destinatari dei tessuti / cellule possono essere influenzati da effetti di riscaldamento cumulativi, quando più siti di stimolo e / o alti tassi di ripetizione sono utilizzati 3,4.

In risposta a queste sfide, i ricercatori hanno riconosciuto il potenziale di utilizzare absor estrinsecabri per la stimolazione del nervo a produrre effetti di riscaldamento più localizzati nel tessuto. Huang et al. Ha dimostrato questo principio usando nanoparticelle di ferrite superparamagnetiche per attivare da remoto i canali TRPV1 sensibili alla temperatura in HEK 293 cellule con una radio-frequenza di campo magnetico 5. Sebbene questa tecnica può consentire una penetrazione più profonda (campi magnetici relativamente interagiscono debolmente con tessuto), le risposte sono state registrate solo su periodi di secondi, piuttosto che le durate di millisecondi richiesti dispositivi bionici 5. Allo stesso modo, Farah et al. Stimolazione elettrica dimostrato di neuroni corticali di ratto con neri micro particelle in vitro. Hanno mostrato di precisione a livello di cella nella stimolazione con durate di impulso dell'ordine di centinaia di ms ed energie nella gamma di μJ, potenzialmente permette tassi di ripetizione più veloce 6.

L'uso di assorbitori estrinseci è stata applicata anche per indurrecambiamenti morfologici in vitro. Ciofani et al. Hanno evidenziato un aumento del ~ 40% nella crescita neuronale utilizzando piezoelettrici boro nitruro nanotubi eccitato da ultrasuoni 7. Analogamente, ferro endocitosi nanoparticelle di ossido in cellule PC12 sono stati riportati per migliorare la differenziazione dei neuriti in modo dose-dipendente, causa l'attivazione di molecole di adesione delle cellule con l'ossido di ferro 8.

Recentemente, l'interesse assorbitori estrinseci per assistere stimolazione neurale è anche concentrato sull'uso di nanoparticelle di oro (Au NP). Au NP hanno la capacità di assorbire efficacemente luce laser al picco plasmonica e dissiparlo nell'ambiente circostante nella forma di calore 9. Tra tutte le forme di particelle disponibili, l'assorbimento ottico di nanotubi d'oro (Au NR) corrisponde comodamente la finestra terapeutica di tessuti biologici (vicino infrarosso - NIR, lunghezza d'onda tra 750-1,400 nm) 10. Inoltre, nel context di stimolazione neurale, l'uso di Au NR offre biocompatibilità relativamente favorevole e una vasta gamma di opzioni di funzionalizzazione superficiale 11. Recenti studi hanno dimostrato che un effetto stimolante sulla differenziazione può essere indotta dopo esposizione laser continue di Au NR in NG108-15 cellule neuronali 12. Allo stesso modo, transienti intracellulari di calcio sono stati registrati in cellule neuronali coltivate con Au NRs dopo irradiazione laser modulato con frequenze variabili e lunghezze di impulso 13. Membrana cellulare depolarizzazione si è registrato anche dopo l'illuminazione laser NIR di Au NRs in colture primarie di neuroni gangliari spirale 14. La prima applicazione in vivo con irradiato Au NR è stata dimostrata solo di recente. EOM e collaboratori esposti Au NRs al loro picco plasmonica e hanno registrato un aumento di sei volte in ampiezza dei potenziali d'azione del nervo composto (CNaPS) e una diminuzione di tre volte nella soglia di stimolazione in ratti nervi sciatico. L'enrisposta ampliate è stato attribuito a effetti di riscaldamento locali derivanti dalla eccitazione del NR picco plasmonica 15.

Nel presente lavoro, vengono specificati protocolli per studiare gli effetti della stimolazione laser a NG108-15 cellule neuronali coltivate con Au NR. Questi metodi forniscono una semplice, ma potente, modo di irradiare popolazioni cellulari in vitro usando tecniche biologiche standard e materiali. Il protocollo si basa su un diodo laser accoppiato in fibra (LD) che permette un funzionamento sicuro e ripetibile allineamento. La preparazione del campione e laser metodi di irraggiamento Au NR possono essere ulteriormente estesi a diverse forme di particelle e colture cellulari neuronali, a condizione che si conoscono, rispettivamente, i protocolli di sintesi e di cultura specifica.

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Protocollo

1. Au NR Preparazione

Nota: Au NR può essere sintetizzato da un numero di ricette 16, o acquistati da fornitori commerciali.

  1. Misurare la densità ottica iniziale (OD) della soluzione Au NR tramite spettroscopia UV-Vis, registrando i valori di assorbimento da 300 nm a 1000 nm con una risoluzione di 0,5-2 nm. Variare il volume della soluzione da usare con la cuvetta disponibili.
  2. Valutare la concentrazione iniziale NP molare con una tecnica 17 Ideale (ad esempio la spettroscopia UV-Vis, singola particella ICP-MS, microscopia elettronica a trasmissione) o utilizzare i valori di concentrazione forniti dal venditore.
  3. Preparare una soluzione madre 5 ml diluendo il campione iniziale Au NR raggiungere un OD = 1. Per una migliore ripetibilità, mantenere costante OD per tutti i campioni testati. Seguire protocollo del fornitore commerciale per la composizione del solvente di diluizione. Se non sei sicuro, Usare acqua deionizzata.
  4. Centrifugare 1 ml della soluzione Au NR due volte per 15 minuti a 7800 xg per rimuovere qualsiasi eccesso chimico dalla soluzione. Cicli di centrifugazione può variare in vigore e nel tempo (ad esempio, 20 min a 5.600 × g) 18.
  5. Rimuovere il surnatante e risospendere le NRs in acqua deionizzata. Come particelle risospeso potrebbero formare aggregati in soluzione, prepararli giorno per avere i migliori risultati. In alternativa, conservare in frigorifero per non più di 1 settimana. Non congelare.
  6. Prima di utilizzare in condizioni di coltura cellulare, sonicare la soluzione Au NR per 5 minuti e poi sterilizzare con la luce UV per 30 minuti (intensità di radiazione UV non meno di 400 mW ∙ m -2 a 254 nm).

2. NG108-15 cellule neuronali Linea Cultura e differenziazione

  1. Per mezzo di coltura cellulare, preparare 500 ml di mezzo sterile modificato di Dulbecco Eagle (DMEM) contenente 10% (w / v) di siero fetale bovino (FCS), 1% (w / v) L-glutammina, 1%(W / v) di penicillina / streptomicina e 0,5% (w / v) anfotericina B.
    Nota: Gli integratori possono essere aliquotati, conservati a -20 ° C e aggiunti ai media il giorno desiderato. Mezzo di coltura cellulare può essere refrigerato in condizioni sterili per un massimo di 1 mese.
  2. Per il mezzo differenziazione cellulare, preparare 50 ml di DMEM sterile contenente 1% (w / v) L-glutammina, 1% (w / v) di penicillina / streptomicina e 0,5% (w / v) anfotericina B.
  3. Grow NG108-15 cellule neuronali in 10 ml di mezzo di coltura cellulare in fiasche T75 in polistirolo in un incubatore con un'atmosfera umidificata (5% CO 2 a 37 ° C). Normalmente, sementi 1,5-2 x 10 5 cellule in ogni contenitore per essere pronto in 3-4 giorni. Cambiare mezzo di coltura cellulare ogni due giorni.
    Nota: per evitare derive genetiche o di variazione, non usare le cellule di età superiore a 21 passaggio per gli esperimenti.
  4. Quando 70-80% confluenti nella cultura, cambia il mezzo con mezzo di caldo coltura cellulare fresca. Meccanicamente staccare le cellule delicatamente Knocre il fondo del pallone confluenti. Non usare tripsina.
  5. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 600 xg e risospendere il pellet cellulare in 2 ml di mezzo caldo differenziazione cellulare.
  6. Seed 2 × 10 4 cellule / cm 2 in una piastra di coltura tissutale polistirene ben 96 con 200 ml di terreno di differenziamento cellulare. Incubare l'esperimento per 1 giorno al 5% di CO 2/37 ° C.
  7. Aggiungi tra 3,2 × 10 9 -4.2 × 1 0 10 particelle / ml di soluzione Au NR il giorno 2 ed incubare per ulteriori 24 ore. Non aggiungere le particelle per gli esperimenti di controllo.
    Nota: Come controllo alternativo, Au NP con un picco d'onda di assorbimento ben differenziati possono essere utilizzati ai fini del confronto 14. Per un comportamento cellulare più coerente, mantenere la densità costante di cella e non modificare la superficie ben prima della semina delle cellule.

3. crescita dei neuriti Enhancement

  1. Coppiail laser con una fibra ottica monomodale (apertura numerica = 0.13) e terminare con un connettore in fibra (connettori FC sono convenienti e comunemente disponibili). Misurare la potenza del laser di uscita con un misuratore di potenza standard. Per ottenere risultati ottimali, abbinare il picco di lunghezza d'onda del laser al picco di risonanza plasmonica di NR.
  2. Il giorno 3 dopo incubazione NR, fissare il connettore FC al pozzo. Irradiare campioni ed i controlli a temperatura ambiente per 1 minuto in onda continua, per le diverse potenze laser. Lasciare che la cultura di procedere per 3 giorni aggiuntivi in 5% CO 2/37 ° C. Ripetere la radiazione laser per un minimo di 3 misurazioni indipendenti.
    Nota: differenti tempi di irradiazione e possono essere selezionati frequenze impulsi, a seconda dell'applicazione.
  3. Caratterizzano il laser in termini di diametro del raggio e di irraggiamento laser (W ∙ cm -2).
    1. Per una singola fibra modalità standard, utilizzare NA = n ∙ sin θ,dove n è l'indice di rifrazione del mezzo in uso e θ è la metà-angolo del cono di luce uscenti dalla fibra (vedere Figura 1A). Da trigonometria, r = tan θ ∙ d, dove r è il raggio del fascio e d è la distanza tra la fibra e il campione. Il connettore FC corrisponde al diametro del pozzo, quindi illuminando il campione ad una distanza d = 2,70 ± 0,20 mm. Luce esce la fibra in acqua (n = 1.33), dando r = tan (sin-1 (NA / n)) ∙ d.
    2. Utilizzando quest'ultima equazione, calcolare il raggio del fascio laser, l'area corrispondente trave e l'irradianza media del laser (potenza del laser divisa per l'area del fascio) sul bersaglio (si veda il grafico esempio nella Figura 1B). Questi valori rappresentano l'irraggiamento medio sopra l'area illuminata.
    3. Valutare gli errori per le misure con la teoria generale di propagazione degli errori.
      Nota: La distanza bra il connettore FC e il campione possono essere misurati con fotografie del dispositivo sperimentale e post-elaborazione delle immagini utilizzando il software appropriato (per esempio ImageJ).
  4. Al giorno 5, rimuovere terreno di differenziamento cellulare dagli esperimenti e fissare i campioni con 3,7% (v / v) di formaldeide per 10 minuti, poi permeabilize le cellule con 0,1% (v / v) Triton X-100 per 20 min.
  5. Aggiungere 3% (w / v) di albumina di siero bovino (BSA) per i campioni per 60 min per bloccare siti di legame della proteina non reagito. Etichettare i campioni per il pernottamento anti-βIII-tubulina (5 mg / ml in PBS integrato con 1% di BSA) a 4 ° C.
  6. Incubare le cellule per 90 minuti al buio con un anticorpo secondario appropriato (topo anti-anticorpo es TRITC-coniugato IgG) utilizzando una concentrazione di 0,4-2 mg / ml in 1% BSA in PBS. Etichettare i nuclei delle cellule con DAPI (0,1 mg / ml in acqua deionizzata) per 10 minuti.
    Nota: coniugazione di anticorpi e concentrazione migHT variano secondo il protocollo aziendale. Lavare i campioni con PBS due volte per 5 minuti dopo ogni fase di colorazione.
    figure-protocol-1
  7. Campioni Immagine di epifluorescenza o microscopia confocale utilizzando almeno un 20 × obiettivo. Scegli il microscopio filtri di conseguenza per l'anticorpo secondario. Selezionare un filtro DAPI (λ = 358 nm EX; λ = EM 488 nm) per visualizzare i nuclei delle cellule.
  8. Analizzare le immagini valutando: i) la lunghezza massima dei neuriti (registrare la lunghezza dalla punta del neurite all'inizio del corpo cellulare), ii) il numero di neuriti per cellula neuronale (riassumere tutti i neuriti per cella) e iii) la percentuale di cellule con neuriti (dividere il numero totale di cellule che esprimono βIII-tubulina per il numero totale di cellule con un nucleo tinto positivamente) 19.

4. laser-indotta intracellulare Ca 2+ Imaging

  1. Preparare un 20% (w / v) di soluzione stock di Pluronic F-127 sciogliendo 2 g di soluto in 10 ml di dimetilsolfossido anidro (DMSO). Riscaldare la soluzione di Pluronic F-127 a 40 ° C per circa 20 minuti per aumentare la solubilità. Preparare in anticipo se conservato a temperatura ambiente.
  2. Il giorno 3 dopo NR incubazione, preparare una soluzione salina bilanciata (BSS; 135 mM NaCl, 4,5 mM KCl, CaCl 1,5 mm 2, MgCl 0,5 mm 2, 5.6 mM glucosio, e HEPES 10 mM, pH 7.4) e integrato con 5 pM di Fluo-4 sono nella DMSO e 0,1% (w / v) di soluzione Pluronic F-127.
    Nota: soluzione BSS può essere preparata in anticipo e refrigerato per un massimo di 1 mese. Aggiungere i supplementi (Fluo-4 AM ed Pluronic F-127), il giorno dell'esperimento.
  3. Rimuovere terreno di differenziamento cellulare e sostituirlo con la soluzione BSS integrata. Per ottenere i migliori risultati con un microscopio confocale invertito, incubare le cellule in un micro-pozzetto.
  4. Carica NG108-15 cellule con Fluo-04:00per 30 minuti al buio a 5% di CO 2/37 ° C. Dopo il tempo di incubazione, lavare campioni due volte con BSS per rimuovere eventuali fluoroforo scarico extracellulare.
  5. Coppia il laser con una fibra ottica monomodale e fende la punta utilizzando tecniche standard. Osservare la punta risultante sotto un microscopio ottico, per assicurare una superficie di alta qualità (cioè la punta deve essere perpendicolare all'asse della fibra e piatto su controllo microscopia).
    1. Misurare la potenza del laser di uscita con un misuratore di potenza standard. Inserire la fibra di consegna luce in un supporto in fibra ottica e applicarla ad un micropositioner. Fare riferimento a Brown et al. 20 per maggiori dettagli sulla preparazione fibra ottica e il posizionamento.
      Attenzione: Seguire le regole generali per la sicurezza laser durante la misurazione della potenza del laser (per esempio non guardare direttamente il raggio laser, indossare occhiali di sicurezza laser durante la manipolazione, evitare l'esposizione alla luce diffusa ad altri utenti del laboratorio) <./ Li>
  6. Collegare un oscilloscopio per il laser portatile per monitorare la modulazione ottica. Utilizzare un segnale binario con frequenze variabili (0,5-2 Hz) e lunghezze di impulso (20-100 msec). Collegare il laser utilizzando il segnale di modulazione come logica transistor-transistor (TTL) ingresso per microscopio, in seguito alla configurazione mostrata in Paviolo et al. 13.
    1. Collocare le cellule con un microscopio confocale invertito e posizionare la fibra consegna luce 250 ± 50 micron dalla cellula bersaglio in modalità di trasmissione di illuminazione. A questa distanza, utilizzare le equazioni presentati in 3.3.1 per calcolare il raggio del fascio sul bersaglio.
  7. Utilizzare un laser ad argon-ion (488 nm) per eccitare l'interiorizzato Fluo-04:00 dye (λ = 494 nm EX; λ PN = 516 nm) e la LD sincronizzato per l'eccitazione delle NRs endocitosi. Eseguire la immagini a RT di campioni e controlli utilizzando almeno un obiettivo 40 × raccogliendo scansioni time-seriescon 256 × 256 pixel / risoluzione fotogramma in modalità di andata e ritorno con una frequenza di almeno 4 Hz. Eseguire una registrazione senza alcuna eccitazione LD per identificare qualsiasi interferenza laser argon-ion (rumore di fondo).
  8. Rimuovere lo sfondo dei dati utilizzando adattivo ponderati penalizzati minimi quadrati algoritmi 21. Tracciare le indotte Ca 2+ variazioni in funzione del tempo. Analizzare i picchi transitori di intensità di fluorescenza utilizzando immagine software di post-elaborazione per soglia ad un livello tre volte la deviazione standard del rumore di fondo (3σ).

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Risultati

Utilizzando protocolli 1, 2, e 3 qui descritte, un effetto stimolante sulla differenziazione è stata osservata in NG108-15 cellule neuronali coltivate con NP Au (Au NR, poli (styrenesulfonate) Rivestiti Au NRs e silice rivestite Au NR) dopo laser esposizioni tra 1,25 e 7,5 W · cm -2. Immagini confocale di rhodamineB marcato Au NRs dimostrato che le particelle sono stati internalizzati dal giorno 1 di incubazione 12. La localizzazione è stata osservata prevalentemente nel citoplasma cellulare, indic...

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Discussione

I protocolli descritti in questa presentazione descrivono come la cultura, differenziare e otticamente stimolare le cellule neuronali utilizzando assorbitori estrinseci. Le caratteristiche NR (ad esempio le dimensioni, la forma, risonanza plasmonica di lunghezza d'onda e chimica di superficie) ei parametri di stimolazione laser (come la lunghezza d'onda, la lunghezza di impulso, frequenza di ripetizione, ecc) possono essere variate per soddisfare diverse esigenze sperimentali. Gli effetti sul c...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi concorrenti da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori vorrebbero riconoscere NanoVentures Australia per sostegno finanziario di viaggio e il Prof. John Haycock per aver ospitato in parte questa ricerca presso l'Università di Sheffield e la signora Jaimee Mayne per il suo aiuto durante le riprese.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Au NRSigma Aldrich 716812
NG108-15Sigma Aldrich8811230
DMEMSigma AldrichD6546
FCSLife Technologies10100147
L-glutamminaSigma AldrichG7513
Penicillina/streptomicinaLife Technologies15140122
Amfotericina BLife Technologies15290018
FormaldeideSigmaAldrich F8775
Triton X-100BDHT8532
BSASigma AldrichA2058
Anti-β III-tubulinaPromegaG7121
TRITC-conjugated anti-mouse IgG anticorpoSigma AldrichT5393
DAPIInvitrogenD1306
Fluo-4 AMInvitrogenF14201
DMSOSigma Aldrich472301
Pluronic F-127InvitrogenP6867
UV-Vis spettrometroVarian Medical Systems Inc.Centrifuga Cary 50 Bio
MiniEppendorfMini Spin
SonicUnisonics AustraliaFPX 10D
Incubatore per colture cellulariKendroHera Cell 150
Centrifuga per colture cellulariHettichRotofix 32A
Diodo laserOptotech780 nm fibra monomodale - accoppiato LD
Fibra otticaThorlabs780 HP
Misuratore di potenzaLaser coerente Check ImageJ
http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
Microscopio epifluorescenteAxon InstrumentsImageX-press 5000A
μ-slide wellIbidi80826
Microscopio confocale invertitoCarl Zeiss Microscopy Ltd.Microscopio meta-confocale
OscilloscopioTektronixTDS210
LSM 510

Riferimenti

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