Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dinamica a cono fotorecettore Axon Terminali della retina di topo

Sommario

Descriviamo un protocollo per il monitoraggio Ca ²⁺ dinamiche nei terminali degli assoni dei fotorecettori cono con un ex-vivo la preparazione fetta della retina del mouse. Questo protocollo permette studi completi di cono Ca ^{2 +} Segnalazione di un importante sistema modello mammiferi, il mouse.

Abstract

Fotorecettori cono della retina (coni) servono visione diurna e sono alla base della discriminazione dei colori. Le tariffe sono soggette alla degenerazione, spesso porta alla cecità in molte malattie della retina. Il calcio (Ca ^2+), una chiave secondo messaggero nella segnalazione fotorecettori e il metabolismo, è stato proposto di essere indirettamente collegata con fotorecettori degenerazione in vari modelli animali. Sistematicamente studiare questi aspetti del cono fisiologia e fisiopatologia è stata ostacolata dalla difficoltà di registrazione elettricamente da queste piccole cellule, in particolare nel topo in cui la retina è dominato da bastoncelli. Per aggirare questo problema, abbiamo stabilito un Ca ^{2 +} protocollo di imaging a due fotoni con una linea di topo transgenico che esprime il geneticamente codificato Ca ²⁺ biosensore TN-XL esclusivamente in coni e possono essere incrociati con modelli murini per fotorecettori degenerazione. Il protocollo qui descritto prevede la preparazione di sezioni verticali (R20; fette ") di retine di topi e imaging ottico dei cambiamenti di stimolo-evocati leggeri nel cono Ca ²⁺ livello. Il protocollo consente inoltre "misurare nel fetta" di assoluto Ca ^{2 +} concentrazioni; come le registrazioni possono essere seguiti mediante calibrazione. Questo protocollo consente studi in proprietà cono funzionali e dovrebbe contribuire alla comprensione del cono Ca ²⁺ segnalazione nonché il potenziale coinvolgimento di Ca ²⁺ in fotorecettori morte e degenerazione retinica.

Introduzione

Vision inizia con l'attivazione-indotta luce della cascata fototrasduzione nei fotorecettori retinici. Bastoncelli consentono la visione a bassi livelli di luce, mentre fotorecettori cono mediano a colori e ad alta risoluzione visione diurna. Molti geni specifici fotorecettori sono suscettibili di mutazioni che portano alla degenerazione di queste cellule. Un certo numero di marcatori molecolari associati alla perdita dei fotorecettori sono stati identificati ^1, ma finora i meccanismi molecolari dettagliate e la sequenza degli eventi rimangono poco chiari. Altered Ca ²⁺ omeostasi stato ipotizzato essere un trigger di morte cellulare dei fotorecettori, ipotesi sostenuta dalla up-regolazione dell'attività di Ca ²⁺ -dipendente proteasi calpaina tipo durante il processo di degenerazione ^2,3. Tuttavia, ad oggi, questa ipotesi non è sostenuta da misure fisiologiche di Ca ^2+. Incongruenze in diversi studi sugli effetti di Ca ²⁺ bloccanti dei canali in remalattie fonodale sfidato ulteriormente il coinvolgimento di Ca ²⁺ nella morte cellulare ^4-6, chiedendo metodi per valutare direttamente Ca ²⁺ nei fotorecettori cono mammiferi.

In precedenza, la maggior parte registrazione elettrica e studi di imaging Ca ²⁺ sono stati condotti in modelli di anfibi e rettili a causa del più facile accesso ai coni ^7-9. Tuttavia, mammiferi fotorecettori fisiologia può essere diversa da quella dei non mammiferi ¹⁰ e in particolare, nel contesto di degenerazione retinica ereditaria umana, una migliore comprensione della fisiologia dei mammiferi fotorecettore è una chiave per lo sviluppo di terapie innovative. Molti modelli murini che mimano malattie retiniche umane sono disponibili, ma poco si sa su Ca ²⁺ dinamiche nei coni di topo ^11. Tecniche elettrici non sono adatti per le registrazioni ad alto rendimento da coni, in particolare, non nei topi, dove aste (~ 97%) superano significativamente coni (~ 3%) ¹² . Inoltre, tecniche elettrofisiologiche sensibili come whole-cell patch-clamp disturbano l'ambiente intracellulare e di fornire i dati relativi Ca ²⁺ correnti, ma non in assoluto intracellulare Ca ^{2 +} concentrazioni. Quindi, nonostante la risoluzione temporale inferiore, l'imaging è il metodo di scelta nel trattamento delle problematiche circa cono Ca ²⁺ dinamiche. La questione chiave con imaging è come etichettare in modo selettivo i coni con un Ca ²⁺ colorante indicatore fluorescente. Compartimentazione corretta e la specificità delle cellule è difficile da raggiungere entro il "bulk-loading" sintetico Ca ²⁺ indicatore coloranti nel tessuto. Di conseguenza, coni etichettati, aste ^13,14, e le cellule gliali Müller non possono essere distinti in modo affidabile. Inoltre, coloranti sintetici tendono a fuoriuscire delle cellule, impedendo registrazioni prolungato in condizioni costanti. Inoltre, il caricamento sintetiche Ca ²⁺ indicatori nella loro forma AM-estere è problematico, in quanto richiede detergents (ad esempio, DMSO) e genera formaldeide ^15. Per assoluti Ca ²⁺ misurazioni, indicatori raziometrico sono obbligatori. Tuttavia, il miglior indicatore raziometrica sintetico disponibile Fura-2 richiede luce di eccitazione nell'intervallo da 700 a 760 nm (per eccitazione a due fotoni), che, a seconda della sua intensità, può di per sé stimolare i coni, e quindi impediscono studi cono di Ca ²⁺ dinamica in condizioni di illuminazione fisiologiche.

A differenza di coloranti sintetici, geneticamente codificati Ca ²⁺ indicatori possono essere espressi in un tipo selettivo cellule maniera. Essi non fuoriuscire di cellule, e quindi, se si evita candeggio, misurazioni raziometrico prolungate e affidabili sono possibili. Tipo selettivo cellulare espressione di Ca ²⁺ biosensori, in combinazione con la microscopia a due fotoni, rappresenta un potente strumento per valutare e studiare subcellulare Ca ²⁺ in condizioni in gran parte fisiologiche ^13,16,17 . Qui, descriviamo un protocollo per studiare la luce stimolo-evocato cono di Ca ²⁺ dinamiche in un transgenico Ca ²⁺ topo biosensore linea (HR2.1: TN-XL), che esprime la base FRET-Ca ²⁺ biosensore TN-XL ¹⁸ selettivamente in coni, sotto l'umano opsina rosso promotore HR2.1 ^19. Per accedere ai morsetti del cono, una preparazione fetta ex-vivo ²⁰ è stato impiegato. Il protocollo è stato già utilizzato con successo in tre studi sulla funzione cono in topi sani ^10,21,22. Inoltre, il protocollo consente di studiare cono Ca ^{2 + Segnalazione} di condizioni genetiche specifiche, ad esempio, incrociando modelli murini di degenerazione retinica ereditaria con HR2.1: topi TN-XL.

Protocollo

Tutte le procedure di animali sono state effettuate rispettando le linee guida e le leggi per la protezione degli animali determinate dal governo federale tedesco e approvato dal comitato istituzionale il benessere degli animali dell'Università di Tubinga.

1. Modelli animali

1. HR2.1: TN-XL Ca ²⁺ topo biosensore
   1. Utilizzare il HR2.1 transgenico: linea di topi TN-XL che esprime il Ca ²⁺ biosensore TN-XL selettivamente nei fotorecettori cono ^10. Utilizzare 3-6 settimane i topi di entrambi i sessi in rilievo con una 12 ore giorno / notte di ritmo normale.

2. retina Dissection

1. Soluzione fisiologica
   1. Preparare freschi 2 L di soluzione extracellulare, contenente 125 mM NaCl, KCl 2,5 mm, 1 mM MgCl _2, da 1,25 mm NaH ₂ PO _4, NaHCO 26 mm _3, 0,5 mM L-glutammina, e 20 mm (+) glucosio. Mescolare fino a quando tutti gli ingredienti si dissolvono.
   2. Soluzione extracellulare "Bubble"con carboxygen (95% O _2, 5% di CO ₂₎ per 5 - 10 minuti. Aggiungere CaCl ₂ per raggiungere una concentrazione di 2 mM.
   3. Dopo gorgogliare la soluzione extracellulare, misurare il pH. Il pH deve essere 7,4, altrimenti è probabile che gli errori sono stati fatti durante la preparazione della soluzione. Mantenere spumeggiante votare e soluzione temperatura costante per tutto esperimento per garantire costante il pH.
   4. Separare il brodo in 2 palloni, uno per la dissezione retina e uno per la messa a punto di registrazione (perfusione).
2. Enucleazione dell'occhio e l'isolamento di retina (5 - 10 min)
   1. Mantenere una illuminazione rossa fioca nell'area di lavoro per l'enucleazione. Utilizzare LED con una lunghezza d'onda di picco di 650 nm (o più) per evitare sbiancamento dei coni durante la dissezione.
   2. Dark-adattare il mouse per 2 ore, mettendo la sua gabbia in un ben ventilata, scatola a tenuta di luce per garantire che i coni siano completamente sensibilizzati al momento della registrazione.
   3. Anestetizzare il topo sotto un laboratocappa ry con isoflurano (5%) usando un vaporizzatore e un contenitore a tenuta di gas che contiene una gabbia mouse standard. Seguire attentamente le istruzioni del fabbricante quando si maneggia il vaporizzatore. Utilizzare guanti e maschera di protezione per ridurre l'esposizione agli allergeni.
   4. Utilizzare un microscopio binoculare con un 10 - ingrandimenti 40X per la dissezione.
   5. Sacrifica il mouse anestetizzata per decapitazione.
   6. Per l'orientamento, segnare la parte superiore di ogni occhio (= dorsale) con una penna impermeabile. Tieni traccia di se con l'occhio a sinistra oa destra.
   7. Rimuovere l'occhio con attenzione forbici curve tagliando il nervo ottico dietro il bulbo oculare. Per la dissezione, trasferire il bulbo oculare di una capsula di Petri contenente soluzione extracellulare appena carboxygenated. Per il trasferimento del bulbo oculare, tenerlo dal moncone del nervo ottico.
   8. Perforare dell'occhio in qualsiasi punto lungo il confine tra la cornea e la sclera (cioè, al serrata) con un ago per iniezione tagliente.
   9. Tenere la postavoi alla sclera con un paio di pinze e delicatamente inserire uno Forbici nel foro praticato nel passaggio precedente. Tagliare lungo serrata per separare la parte anteriore dell'occhio (cornea, cristallino, vitreo) dalla parte posteriore (oculare). Tagliare l'oculare radialmente (verso il disco ottico) nella posizione del marchio penna per indicare la posizione supina sulla retina.
      Nota: Preparato in questo modo, le conchiglie oculari possono essere tenuti in soluzione continua carboxygenated per un uso successivo.
   10. Girare l'oculare nella scatola di Petri in modo tale che la dorsale tagliato punti di distanza da se stessi. Afferra la sclera sul lato destro della conchiglia oculare con un paio di pinze ogni sinistra e inserendo le punte pinze tra retina e sclera.
   11. Staccare la retina invertendo delicatamente la parte sclerale della conchiglia oculare. Infine, tagliare il nervo ottico utilizzando micro sezionare forbici per liberare la retina dalla sclera.
       Nota: Questo è un passo fondamentale. Evitare danni alla retina (ad esempio,toccante e stringendolo con una pinza).
   12. Tenere uno dei bordi della retina con un paio di pinze e delicatamente rimuovere i detriti e corpo vitreo dalla superficie retinica utilizzando un secondo paio di pinze. Quando la superficie della retina è pulita, utilizzare micro dissezione forbici per fare altre tre brevi, tagli radiali (circa ogni 90 °). Questi tagli permettono di appiattire accuratamente la retina con il lato rivolto verso il basso fotorecettori nella scatola di Petri (Figura 1A).
3. Preparazione Slice (10 - 15 min)
   1. Preparare membrane filtranti di nitrocellulosa in anticipo per la retina di affettamento e vetro coperture scivola per il montaggio fette e trasferirli alla camera di registrazione. Tagliare membrana filtrante di nitrocellulosa in circa 10 x 5 millimetri di dimensioni pezzi rettangolari con le forbici. Tagliare coprioggetto in pezzi rettangolari di circa 10 x 5 mm di dimensioni con un tagliavetro.
   2. Lentamente immergere un vetrino nella soluzione extracellulare vicino atissue. Delicatamente, tirare la retina sul vetrino con il lato di cellule gangliari da afferrandolo al limite con un paio di pinze. Questo processo riduce danni meccanici e la piegatura del tessuto.
   3. Scegli la regione della retina che è legato alla rispettiva domanda di ricerca (si veda anche la discussione). Ricordate, il lungo taglio fatto nella fase 2.2.9 segna la metà della retina dorsale (Figura 1A). Tagliare a, circa 1 x 2 mm pezzo rettangolare di dimensioni fuori della regione retinica selezionato utilizzando un bisturi curvo. Rimuovere la soluzione in eccesso intorno al tessuto.
   4. Posizionare la membrana del filtro sulla parte superiore del pezzo di retina tale che il lato cellule gangliari aderisce alla membrana. Immediatamente, aggiungere una goccia di mezzo extracellulare sulla membrana per fissare saldamente il tessuto alla membrana.
   5. Trasferire il tessuto retinico montato membrana alla camera affettatura contenente soluzione fresca extracellulare.
   6. Tagliate a fette retina verticali di 200 micronspessore (Figura 1B) usando una lama di rasoio fresco attaccato ad un chopper tessuti ^23. Cambia lama per ogni pezzo della retina.
      Nota: La lama di rasoio deve essere perfettamente allineata con la superficie del fondo della camera di affettatura tale che tutta la membrana divide simultaneamente, come indicato da un "clic" suono durante il taglio - altrimenti la lama può piegare e danneggiare la fetta.
   7. Incollare una sola fetta montato a membrana su un vetro di copertura antiscivolo applicando grasso alto vuoto alla membrana termina solo (Figura 1C). Mantenere la superficie del vetro sotto la retina privo di grasso.
   8. Mantenere fette montato coprioggetto rivestiti da una goccia di soluzione extracellulare nella camera di tenuta - un contenitore chiuso a tenuta di luce e, ad esempio, una piastra di Petri con coperchio coperto con un foglio di alluminio - in atmosfera carboxygen a RT. Introdurre carboxygen facendo gorgogliare un piccolo serbatoio d'acqua per mantenere l'atmosfera nell'aziendacamera umidificata; questo impedisce le fette si secchi.
   9. Lasciare fette di riposare nella camera di tenuta per 10 - 15 minuti prima di loro (uno per uno) di passare alla camera di registrazione. Fette possono essere mantenuti fino a 4-5 ore in possesso camera alla RT (~ 21 ° C).

3. a due fotoni Ca ²⁺ Imaging

1. Microscopia a due fotoni
   1. Utilizzare un microscopio obiettivo mobile (MOM) tipo microscopio a due fotoni. Sono stati descritti sia nel design che di imaging procedure MOM in precedenza ^24, per i dettagli vedere anche ^10,21,25 (per le fonti e le imprese, vedi tabella ^1).
      Nota: Ogni montante microscopio a due fotoni che soddisfi i seguenti requisiti minimi possono essere utilizzati: Deve essere dotato di (a) un laser pulsato sintonizzabile a ~ 860 nm, (b) almeno due canali di fluorescenza acquisiti contemporaneamente, (c ) Filtri per ECFP e citrino fluorescenza, (d)uno stimolatore di luce (per eventuali disegni, vedi ^24,26), e (e) un software che consente di registrare le sequenze di immagini in tempo trascorso in un frame rate sufficiente a risolvere il Ca ^{2 +} segnali di interesse.
   2. Avviare il sistema di imaging due fotoni come indicato dal produttore. Rigorosamente seguire le linee guida di sicurezza del laser della struttura. Avviare il laser e sintonizzare a ~ 860 nm.
   3. Trasferire una fetta da camera di tenuta alla camera di registrazione e iniziare immediatamente perfusione con soluzione extracellulare carboxygenated. Mantenere un flusso di perfusione di 2 ml / min e una temperatura di 37 ° C nella camera di registrazione.
   4. Utilizzare un NA obiettivo 20X 0,95 immersione in acqua. Se disponibile, utilizzare una telecamera CCD in combinazione con un infrarossi LED sotto camera di registrazione per localizzare la fetta della retina (Figura 2). In caso contrario, individuare fetta con due fotoni di imaging (vedi 3.1.5).
   5. Passare a due fotoni di imaging per visualizzare espressione biosensore. Accendii due canali di rilevazione per imaging di fluorescenza di ECFP e citrino.
   6. Utilizzare il software di acquisizione di immagini che controlla il microscopio a due fotoni per la scansione e selezionare una riga di terminali conici per la registrazione (Figura 3A). Impostare l'acquisizione di immagini a 128 x 16 pixel immagini (31.25 Hz) o una configurazione simile. Restringere area acquisita ai terminali conici per evitare lo sbiancamento di fotopigmenti in segmenti esterni.
      Nota: Per il sensore TN-XL calcio (τ = ~ 0,6 sec per Ca ²⁺ vincolante, τ = ~ 0,2 sec per Ca ²⁺ non vincolante; vedi ¹⁶⁾ un frame rate minimo di ~ 8 Hz è raccomandato.
2. Stimolazione della luce e la registrazione
   1. Utilizzare un sub-stage full-campo di luce stimolatore come descritto altrove ^10,21,26 per eseguire le seguenti operazioni.
      Nota: una soluzione semplice per uno stimolatore di luce a tutto campo è quello di utilizzare due LED passa-banda-filtrati (per esempio, "blu": 360 BP 12, "verde": 578 BP 10)che corrispondono alle sensibilità di lunghezza d'onda di coni di topo, ma allo stesso tempo non si sovrappongono con i filtri utilizzati per il rilevamento della fluorescenza (cfr. 3.2.4). La luce dei LED è focalizzata dal condensatore attraverso il fondo della camera di registrazione (Figura 2). Per i dettagli su questo disegno stimolatore, la taratura, le intensità di luce utilizzate e le tariffe cono foto-isomerizzazione evocati, vedere ^10,21,26.
   2. Accendere il laser e permettono coni di adattarsi al scansione laser e la luce dello stimolo di fondo (20 - 30 secondi, puoi anche potenziali insidie) prima di presentare stimoli luminosi (vedi 3.2.3) o l'applicazione di agenti farmacologici.
   3. Inizia presentazione di stimoli arbitrarie (es lampi di luce, come mostrato nella Figura 3B, C). Nel caso dello stimolatore descritto nel passaggio 3.2.1, generare gli stimoli modulando l'intensità dei due LED nel tempo utilizzando una scheda a microprocessore controllato da software personalizzato (perdettagli, vedere ^10,21,26).
   4. Avviare la registrazione dei due canali di fluorescenza (ad esempio, a 483 nm per "blue" FRET-donatore ECFP e a 535 nm per "giallo" FRET-accettore,. Per specifiche vedi Tabella 1) contemporaneamente utilizzando il relativo software di acquisizione di immagini (vedi anche 3.1 .6). Ad esempio, nel caso di lampi di luce (Figura 3B, C), registrare almeno 8 - 10 presentazioni stimolo (prove).
3. Ca ²⁺ calibrazione "In-slice"
   1. Record di Ca ²⁺ segnali nei terminali a cono (come descritto in 3.1.6 e 3.2.4) ed estrarre la linea di base Ca ²⁺ livello in una serie di coni (come descritto in 3.4).
   2. Passare a "Ca ²⁺ libero" mezzo extracellulare con 5 micron ionomicina (sciolto in DMSO) e 10 mM EGTA (o, in alternativa, BAPTA) ha aggiunto. Terminali Record cono di nuovo ogni 5 minuti per determinare il rapporto di fluorescenza minima (R _min), cioè, il rapporto in (vicino) assenza di Ca2 ⁺ intracellulare. Questo può richiedere tra i 15 - 30 min.
      Nota: un sistema di perfusione è richiesto che consente il passaggio tra i diversi serbatoi.
   3. Passare a mezzo extracellulare con 5 micron ionomicina (sciolto in DMSO) e Ca 2,5 mm ^{2 +.} Dopo un tempo di incubazione di 5 minuti, coni registrare nuovamente ogni 5 min per misurare il rapporto di fluorescenza massima (R _max), cioè il rapporto in presenza di saturare concentrazioni di Ca2 ⁺ intracellulare. Dopo l'applicazione ionomicina, si può prendere tra 3-15 min per il rapporto Ca ²⁺ a diventare stabile.
      Nota: Esponendo le fette di alta Ca ²⁺ e ionomicina per un periodo più lungo finirà per danneggiare le cellule. Includere solo le cellule per l'analisi che mantengono la loro morfologia normale. Concentrazioni (cioè, EGTA, ionomicina) potrebbero dover essere adattati. Per maggiori dettagli sulla calibrazione Ca ²⁺protocollo, vedere ^13,17.
4. Analisi dei dati
   Nota: utilizzare un software di elaborazione delle immagini e l'analisi dei dati compatibile con il rispettivo software microscopio e in grado di eseguire script di analisi personalizzate.
   1. Caricare un file di dati di imaging e disegnare regioni di interesse (ROI) intorno ad ogni terminale cono (Figura 3A). Per ogni frame, intensità media di fluorescenza ai ROI e sottrarre fluorescenza di fondo, prima di calcolare il rapporto (R) tra FRET-accettore (citrino) e donatore (ECFP) fluorescenza (R = F _A / F _D; la figura 3B, C). Questo rapporto viene in genere utilizzato come proxy per il parente concentrazione intracellulare di Ca ^2+, ma dopo la calibrazione (vedi 3.3), anche le concentrazioni assolute può essere stimato (vedi 3.4.3).
      Nota: I peduncoli sono riconoscibili dalla loro posizione nello strato plessiforme esterno e la loro morfologia (un po 'appiattito "blob" più piccolo rispetto al conosomata, situato all'estremità dell'assone cono).
   2. Prove di stimolo medio (Figura 4A). Estrarre parametri di risposta da tracce medi (Figura 4B), come Ca ²⁺ livello di base _(base R) prima stimolazione luminosa, ampiezza di picco (R _amp), e l'area sotto la curva (R _A) le misure per la taglia risposta. Inoltre, estrarre la cinetica di reazione da tracce mediate, come aumento di risposta (t _aumento) e tempo di decadimento (t _decadimento) (= rispettivi intervalli di tempo tra il 20% e il 80% di R _amp; vedi illustrazione nella Figura 4B). Per maggiori dettagli su come determinare questi parametri, vedere ^10.
   3. Calcola una stima del cono assoluto Ca ²⁺ concentrazione sulla base delle misurazioni da passaggi 3.3.1-3.3.3. Utilizzare i rapporti di minima e massima concentrazione Ca ^2+, R e R _{max min,} rispettivamente, la fluorescenza del donatore nel Ca ²⁺ -bound (F _{D, Ca-bound)} e -unbound (F _{D, Ca-libera)} dello stato, nonché l'in-vivo costante di dissociazione (K _d = 0,77, vedere ¹⁶⁾ per TN-XL con il seguente equazione (da analogico a ^27):

Risultati

Combinando fette verticali (Figura 1) preparato da HR2.1: TN-XL retina di topo con due fotoni di imaging (figura 2), siamo stati in grado di effettuare misurazioni raziometriche di luce Ca ²⁺ segnali di stimolo-evocati in terminali degli assoni cono fotorecettori . Questo approccio rappresenta un significativo miglioramento per l'accesso e la visualizzazione di coni del mouse rispetto ai metodi di imaging ottico preesistenti con sintetici di Ca ²⁺ indicatori. Per esempio, l'espressione specifica cono del Ca raziometrico geneticamente codificato ²⁺ biosensore TN-XL notevolmente facilitato l'individuazione dei terminali cono assoni (vedi ROI in Figura 3A). Pertanto, il nostro protocollo elimina il rischio di segnali di registrazione di origine poco chiara, come ad esempio segnali "misti" con il contributo di entrambi i terminali di cono e rod assoni.

Il nostro approccio permette risolvere risposte singola prova a livello della indiviterminali di doppio cono assoni. Light-evocato estrusione di Ca ²⁺ dal terminale cono è caratterizzato da un aumento e una diminuzione del donatore e accettore di fluorescenza, rispettivamente (Figura 3B). Diminuzione rapporto di fluorescenza (R) corrisponde alla estrusione di Ca ²⁺ dal terminale cono (Figura 3C), causata dalla iperpolarizzazione indotta dalla luce del cono e successiva chiusura di Ca ²⁺ canali voltaggio-dipendenti. Poiché diversi terminali cono assoni possono essere monitorati contemporaneamente (figura 3A), l'acquisizione dei dati è molto efficiente e centinaia di cono Ca ²⁺ risposte possono essere raccolte in un singolo esperimento. Valutando queste risposte quantitativamente (figura 4), ​​cono Ca ^{2 +} segnali possono essere confrontati e valutati in una serie di condizioni (vedi la discussione).

Spesso è sufficiente utilizzare il rapporto tra FRET-accettore (citrino) e -donor (ECFP) fluorescenza(F _A / F _D; per i dettagli, vedi 3.4) come una misura relativa della intracellulare Ca ^{2 +} livello. Tuttavia, se necessario, il rapporto può essere calibrato per ottenere assoluti intracellulare Ca ²⁺ concentrazioni ([Ca ^2+]) (Figura 5). Al retroilluminazione utilizzata in questo protocollo (per i dettagli, vedere la ¹⁰ e la figura 3 leggenda), calibrazione ha prodotto una stima di assoluto riposo [Ca ^2+] nel "wild-type" HR2.1: TN-XL terminali cono del mouse su 243 ± 159 nM (media ± SD), che è entro il range riportato per topi in letteratura ^11.

Figura 1. Preparazione di fette retina verticali. (A) isolato e appiattito retina preparato per affettare. (B) pezzo rettangolare di retina (see riquadro rosso in A) montato su membrana di carta da filtro (grigio scuro) dopo il taglio. (C) Vista dall'alto della fetta della retina montato membrana fissato su un vetrino di vetro con grasso. (D) Schema di una parte di una fetta della retina (vedi riquadro rosso in C). Fotorecettori cono sono indicate in verde. V, ventrale; D, dorsale; N, nasale; T, temporali; OS, segmento esterno; ONL, strato nucleare esterno; OPL strato plessiforme esterno; INL, strato nucleare interno; IPL, strato plessiforme interno; GCL, strato di cellule gangliari. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. due fotoni di imaging di fette della retina: Illustrazione della configurazione di registrazione Top:. L'acqua-immersion lente dell'obiettivo focalizzando l'esseream del laser a scansione (freccia rossa verso il basso) nella retina, e raccogliendo la fluorescenza emessa (frecce verso l'alto). L'obiettivo raccoglie anche trasmessa luce infrarossa da un LED di illuminazione montato sotto il condensatore quando l'imaging la fetta con una camera CCD Center.. Fetta della retina montato nella camera di registrazione e perfusi con soluzione extracellulare basso: condensatore ottico focalizzare la luce dei LED di stimolazione (e il LED a infrarossi per l'imaging CCD) attraverso il fondo trasparente della camera di registrazione nel tessuto retinico. IR LED, infrarossi diodi emettitori di luce; CCD, dispositivo ad accoppiamento di carica; BP, passa-banda. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Light-EVOKEd Ca ²⁺ risposte in terminali degli assoni dei fotorecettori cono del mouse. (A) a sinistra: Recordings focalizzata sui terminali sinaptici (box rosso) di fotorecettori cono (verde) in fettine di retina. A destra: Esempio per una regione registrato con 7 terminali individuali. La fluorescenza è stato registrato utilizzando due canali:. Uno per il citrino FRET-accettore (top; 535 BP 50) e una per il FRET-donatore ECFP (in basso; 480 BP 32) (B) cambiamenti luminosi evocati in citrino (F _A) e ECFP (F _D) fluorescenza registrata in un unico ROI. (C) Ca ²⁺ risposte (come rapporto F _A / F _D) di un terminale cono ad una serie di 1 sec brillanti lampi di luce in intervalli di 5 sec. ROI, regione di interesse; BP, filtro passa-banda; F, intensità di fluorescenza; au, unità arbitrarie; FRET, Förster trasferimento di energia di risonanza; ECFP, migliorato proteina fluorescente ciano. Intensità dello stimolo (come ptasso hoto-isomerizzazione in 10 ³ · P · s ^-1 per cono):. 13.0 e 12.8 per M- e S-opsine, rispettivamente, aggiungendo su un livello di fondo (= LED spenti, scansione laser eccitazione) di ~ 10 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Esempi analisi quantitativa del cono di luce evocata Ca ²⁺ risposte (A) Luce-evocato Ca ²⁺ risposte (come ΔR) da un unico terminale cono (prove singole: tracce grigie, n = 16; media:. Traccia nera ) (b) i parametri stabiliti per la media di Ca ²⁺ risposta:. riposo Ca ²⁺ livello _(base R), che rappresenta la linea di base prima di stimolazione luminosa, dimensioni della risposta come area-under-the-curva (R _A) e ampiezza di picco (R _amp), cinetica della risposta insorgenza (t _luogo, intervallo di tempo dal 20% al 80% di R _amp) e offset (t _decadimento, l'intervallo di tempo da 80% al 20% di R _amp). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Stima assoluta concentrazione di Ca ^2+. Riposo Ca ²⁺ concentrazione ([Ca ^2+], come rapporto F _A / F _D) registrato nel terminali degli assoni 8 cono in un mouse TN-XL (cerchi, con media ± DS) per diverse soluzioni extracellulari: due volte in mezzo extracellulare normale (Ctrl 1 e 2), quindi con il minimo ("zero") [Ca ^2+] (EGTA 10 mM) und con alta [Ca ^2+] (2,5 mm), le ultime due condizioni in presenza di 5 micron ionomicina per equilibrare extracellulare e intracellulare di Ca ^2+. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Protocolli pre-esistenti utilizzando registrazioni unicellulari elettrofisiologiche o Ca ²⁺ immagini con indicatori fluorescenti sintetici lottano per registrare i Ca ²⁺ dinamiche in fotorecettori coni del mouse per una serie di ragioni tecniche (vedi introduzione). Il protocollo qui descritto consente la misurazione di Ca ²⁺ segnali e persino assoluti Ca ²⁺ nei singoli livelli, terminali cono topo individuate in modo efficiente e relativamente semplice.

Questo protocollo è già stato utilizzato con successo in tre studi affrontando diversi aspetti della funzione cono nel sano retina di topo. Nel primo studio ^10, la HR2.1: Mouse TN-XL è stato caratterizzato con immunoistochimica, registrazioni ERG, a due fotoni Ca ²⁺ di imaging, e farmacologia, mostrando che la specifica espressione-cono del Ca ²⁺ biosensore non ostacola cono anatomia e la funzione. Nel secondo studio ^21, cromaticae proprietà di risposta acromatici di coni di topo sono state mappate in tutta la retina, dimostrando notevoli differenze nella funzione cono tra dorsale opsina dominato "verde" e il "blu" ventrale del mouse retina opsina-dominato. Queste differenze regionali nelle proprietà cono abbinati alla distribuzione di contrasto differenziale in ambiente naturale (ad esempio, cielo contro terra), il che suggerisce che i diversi tipi spettrali di coni di topo prevedono (vicino) campionamento ottimale di contrasti acromatici e, quindi, può offrire un vantaggio evolutivo. Nel terzo studio ²² le valutazioni reciproche che i terminali cono assoni ricevono dalle cellule orizzontali è stata studiata. Come tutti i meccanismi di feedback cellula orizzontale proposte agiscono sul voltaggio-dipendenti Ca ²⁺ canali nei terminali cono assoni ^28, terminale cono Ca ²⁺ può servire come un proxy per le interazioni orizzontali cellula-cono. Lo studio di Kemmler e collaboratori ²² supportil'idea che cellule orizzontali utilizzano un sistema di feedback complesso composto da diversi meccanismi per controllare il rilascio di glutammato fotorecettori.

Questi studi dimostrano la versatilità del protocollo descritto e mostrano che può essere adattato ad una vasta gamma di questioni relative al funzionamento cono e suoi circuiti sinaptici. Inoltre, il protocollo consente studiare locale Ca ²⁺ segnalazione nei vari compartimenti cono, ad una migliore comprensione della fisiologia cono. Tale conoscenza è importante per comprendere i processi fisiopatologici in coni degenerazione, per consentire eventualmente per lo sviluppo razionale di potenziali approcci terapeutici, in particolare per le malattie degenerative che colpiscono i coni.

Nella HR2.1: linea di topi TN-XL, il Ca ²⁺ biosensore è espresso tutto il cono, con l'eccezione del segmento esterno. Questo offre l'opportunità per una valutazione diretta e raziometrica di Ca ²⁺ dinamicos in diversi scomparti cono. Poiché l'evoluzione Ca ²⁺ correnti nel segmento esterno si riflettono in terminali con il potenziale di membrana e l'attivazione risultante di Ca ²⁺ canali voltaggio-dipendenti, processi nel segmento esterno possono essere osservati indirettamente.

Potenziali insidie:

La dissezione della retina è un passaggio fondamentale: Nel topo, la retina si separa dalla oculare di solito tra i segmenti esterni dei fotorecettori e dell'epitelio pigmentato. Pertanto, i segmenti esterni fotorecettori fotosensibile della retina isolata sono esposti ed estremamente resistenti ai danni meccanici. Grande attenzione deve essere presa non danneggiare toccando il lato fotorecettore con strumenti o spostando il tessuto lateralmente su una superficie adesiva (ad esempio, una membrana filtro).

Fette retina di alta qualità può essere riconosciuto al microscopio per la loro superficie di taglio pulito eda uno strato fotorecettore ben organizzata con segmenti esterni chiaramente definiti. Valutazione funzionale di qualità fetta può essere rapidamente fatto lampeggiare stimoli luminosi luminosi e la determinazione della percentuale di coni sensibili (ad esempio, in un campo visivo con 10-20 coni). Qui, la qualità risposta dovrebbe essere valutata calcolando il rapporto segnale-rumore (S / N) (ampiezza del rumore di fondo prima della luce stimolo vs. ampiezza della risposta luce); un S / N di 2 - 3 dovrebbe essere considerato come la soglia minima. Tipicamente, scartiamo fette con meno del 50% coni sensibili. Seziona Anche con i coni che mostrano eccessivo comportamento chiodare spontanea (si veda la Figura 4 a ¹⁰⁾ deve essere eliminata.

Fette nella camera di registrazione che soddisfano i criteri anatomici e funzionali di cui sopra mostrano risposte coerenti per 1-2 ore (per i dettagli su consistenza di risposta, vedi ^10). Perché fette sopravvivere per orela nostra in camera di tenuta, un esperimento riuscito può durare fino a 6 ore. È interessante notare che ci sono alcune restrizioni rispetto al studiando a lungo vanno interazioni spaziali tra coni e cellule orizzontali, come affettare separa inevitabilmente connessioni laterali nelle reti della retina. Tuttavia, aumentando lo spessore delle fette retina a 300 micron migliora questo problema ^22.

L'uso di sezioni retiniche verticali evita la scansione di segmenti esterni cono fotosensibile dal laser di eccitazione e, pertanto, impedisce sostanzialmente opsin sbianca (per un'ampia discussione, vedi ^10,21). Tuttavia, le registrate Ca ²⁺ segnali non dipendono solo stimoli luminosi, ma anche ottenere colpite da un componente di illuminazione di fondo generato dal laser a scansione di eccitazione. Infatti, l'efficace retroilluminazione in tali esperimenti di imaging a due fotoni è una combinazione di luce laser diffusa, luce fluorescente emessa dal ce registratalls, e qualsiasi componente di fondo stimolo LED. Pertanto, coni dovrebbero poter adattare per almeno 20 - 30 s a scansione laser (con la componente dello stimolo luce di sfondo accesa) prima della registrazione.

Vantaggi e applicazioni:

Mentre alcune applicazioni per questo cono Ca ²⁺ protocollo -Imaging sono state descritte in precedenza ^10,21,22, altre applicazioni possono essere immaginato: Studi farmacologici in combinazione con cono Ca ²⁺ immagini possono convalidare Ca ²⁺ segnalazione percorsi in coni e potrebbe essere usato per testare l'efficacia e la potenza di farmaci destinati diversi giocatori Ca ²⁺ -Segnalazione ^10. Tuttavia, un'applicazione chiave potrebbe essere quella di studiare le malattie che colpiscono la funzione cono. Molti modelli murini di degenerazione retinica che mimano malattie umane sono disponibili. Per esempio, la perdita di cono fotorecettore 1 (CPFL 1) mouse è un cono primario modello di degenerazione sofferenzada una mutazione Pde6c ^29. Viceversa, l'asta degenerazione 1 (rd 1) topo affetto da una mutazione Pde6b. Anche se questo fa sì che l'asta principale fotorecettori degenerazione ^30, una volta rd 1 sconfitta asta è completato, secondarie set cono degenerazione in ^1. Incroci questi animali con la HR2.1: Linea TN-XL permetterà lo studio e il confronto Ca ²⁺ dinamica sia degenerazione cono primaria e secondaria e rischia di fornire preziose informazioni sul ruolo di Ca ²⁺ durante la morte delle cellule cono. Inoltre, farmacologicamente indotto cone degenerazione - ad esempio con gli inibitori selettivi della PDE6 - può servire a identificare i meccanismi a valle di cono degenerazione ^10,29,31.

In sintesi, il protocollo qui descritto permette di misurare Ca ²⁺ in compartimenti subcellulari di fotorecettori coni mouse e presenta grandi opportunità per scoprire cono fisiologia in una vasta gammadelle condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per lo screening di agenti farmacologici volti a interferire con il cono di Ca ²⁺ -Segnalazione e quindi aiutare a stabilire nuove terapie per le malattie del cono.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Grasso per alto vuoto	Dow Corning	1018817	http://www.dowcorning.com
Vetrini di copertura	R. Langenbrinck		24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com
Vetrini	R. Langenbrinck		76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com
Lame per tritatutto	MARTOR KG	ARGENTAX No. 1044	0.25 mm; http://www.martor.de
Tritatutto	Costruito		su misura Basato su un progetto di F. Werblin23, adattato da T. Schubert
Membrana filtrante in nitrocellulosa grigliata	Merck Millipore	AABG01300	Tipo di filtro: 0.8 &; micro; m; http://www.emdmillipore.com
Isoflurane CP	CP pharma	AP/DRUGS/220/96	http://www.cp-pharma.de
UV/green Stimolatore a campo intero basato su LED	Custom-build		per i dettagli, vedi10
Scheda microprocessore open source	Arduino		http://www.arduino.cc
Software di imaging CfNT	Scritto		sviluppato da Michael Mü ller, MPI per la ricerca medica, Heidelberg, Germania
IgorPro	Wavemetrics		http://www.wavemetrics.com
VC3-4 Sistema di perfusione focale	Sistema ALA Scientific Instrument		con 100 μ collettore di punta con diametro m; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)	Newport Spectra-Physics		http://www.spectra-physics.com
Microscopio a obiettivo mobile (MOM), Progettato da W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germania	Sutter Instruments		http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
[header]
XLUMPlanFL 20X/0.95w obiettivo	Olympus		http://www.olympusamerica.com
Vaporizzatore serie 100	Surgivet		http://www.surgivet.com
Ionomicina, sale di calcio	Life technologies	I24222	http://www.lifetechnologies.com
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	https://www.sigmaaldrich.com
Dimetilsolfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	101191250	http://www.sigmaaldrich.com
Leica MZ95	leica microsystems		http://www.leica-microsystems.com/