Articolo metodologico

Derivazione di Cardiomyocytes altamente purificato da cellule staminali umane pluripotenti indotte utilizzando piccoli Differenziazione Molecola-modulato e successiva glucosio Starvation

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DOI:

10.3791/52628

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18 marzo 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Institute of Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Cardiovascular Medicine Division, Department of Medicine, Child Health Research Institute, Stanford University School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo un robusto protocollo per la derivazione di cardiomiociti umani che combina la differenziazione cardiaca modulata da piccole molecole e la purificazione dei cardiomiociti mediata dalla privazione di glucosio, consentendo la produzione di cardiomiociti purificati ai fini della modellazione delle malattie cardiovascolari e dello screening dei farmaci.

Abstract

Umane staminali pluripotenti indotte cellule derivate cardiomiociti (hiPSC-CMS) sono diventati una fonte di cellule importante per ovviare alla mancanza di cardiomiociti primari disponibili per applicazioni di ricerca e traslazionale di base. Per differenziare hiPSCs in cardiomiociti, sono stati sviluppati diversi protocolli tra cui corpo embrioide (EB) differenziazione basata e induzione fattore di crescita. Tuttavia, questi protocolli sono inefficienti e altamente variabili nella loro capacità di generare cardiomiociti purificati. Recentemente, una piccola molecola di base protocollo utilizzando la modulazione di Wnt / β-catenina ha mostrato di promuovere la differenziazione cardiaca con alta efficienza. Con questo protocollo, superiore al 50% -60% delle cellule differenziate erano cardiomiociti troponina-positivi cardiaca sono stati costantemente osservati. Per aumentare ulteriormente la purezza dei cardiomiociti, cellule differenziate sono stati sottoposti al glucosio inedia eliminare specificamente non cardiomiociti basato sulla differenza metabolicas tra cardiomiociti e non cardiomiociti. Usando questa strategia di selezione, abbiamo costantemente ottenuto un aumento superiore al 30% del rapporto di cardiomiociti ai non cardiomiociti in una popolazione di cellule differenziate. Questi cardiomiociti altamente purificati dovrebbero migliorare l'affidabilità dei risultati di umana iPSC-based in studi di modellazione della malattia in vitro e test di screening di stupefacenti.

Introduzione

Cardiomiociti umani primari sono difficili da ottenere a causa della necessità di biopsie cardiache invasive, difficoltà di dissociare di singole cellule, ed a causa della scarsa sopravvivenza cellulare a lungo termine in cultura. Data questa mancanza di cardiomiociti umani primari, umano indotto staminali pluripotenti cardiomiociti derivato dalle cellule specifiche del paziente tecnologia (hiPSC-CM) è stata considerata come una potente fonte cardiomiociti alternativa per la ricerca di base e applicazioni cliniche e traslazionali come la modellazione della malattia e della droga discovery 1. I primi sforzi di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti in cardiomiociti impiegati protocolli di differenziamento utilizzando corpi embrionali (EBS), ma questo metodo è inefficiente in cardiomiociti producono perché spesso meno del 25% delle cellule in un EB sono battendo cardiomiociti 2,3. Comparativamente, un protocollo di differenziazione basata monostrato-utilizzando le citochine activina A e BMP4 visualizzato un rendimento superiore EBs, maquesto protocollo è ancora relativamente inefficiente, fattori di crescita richiede costosi, e funziona solo in un numero limitato di pluripotenti umana linee di cellule staminali 4. Recentemente, una, con sede a monostrato hiPSC protocollo di differenziazione dei cardiomiociti altamente efficiente è stato sviluppato attraverso la modulazione di segnalazione Wnt / β-catenina 5. Questi hiPSC-CM esprimere e alfa actinina due proteine ​​sarcomeriche che sono marcatori standard di cardiomiociti 6 troponina cardiaca T,. Il protocollo descrivere qui è un adattamento di questo piccolo basato molecola, alimentatore libera cellulare, differenziamento monostrato metodo 5,7. Siamo in grado di ottenere battendo cardiomiociti da hiPSCs dopo 7-10 giorni (Figura 1). Tuttavia, a seguito di una differenziazione cardiomiociti conseguente 50% battendo cellule, immunocolorazione costantemente dimostra l'esistenza di una popolazione di non-cardiomiociti che sono negativi per i marcatori specifici cardiomiociti come alfa-actinina e specifico cardiaco troponina-T. Per further purificare cardiomiociti ed eliminare non cardiomiociti, popolazioni eterogenee di cellule differenziate sono stati sottoposti al glucosio inedia trattandoli con un mezzo estremamente bassa coltura glucosio per più giorni (Figura 2). Questo trattamento elimina selettivamente non cardiomiociti dovuta alla capacità dei cardiomiociti, ma non non-cardiomiociti, a metabolizzare lattato come fonte di energia primaria per sopravvivere in un ambiente a bassa glucosio 8. Dopo questa fase di purificazione, un aumento del 40% del rapporto di cardiomiociti ai non cardiomiociti si osserva, (Figura 3, Figura 4) e queste cellule può essere utilizzato per downstream analisi di espressione genica, modelli di malattia, e saggi di screening di stupefacenti.

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Protocollo

NOTA: le informazioni del fornitore per tutti i reagenti utilizzati in questo protocollo è quotata nella tabella 1 e Elenco dei materiali. Tutte le soluzioni e le attrezzature che entrano in contatto con le cellule devono essere sterili, e la tecnica asettica devono essere utilizzati di conseguenza. Eseguire tutte le incubazioni cultura in un umidificata 37 ° C, 5% CO 2 incubatore se non diversamente specificato. In questo protocollo, tutti differenziazioni sono eseguite in 6 pozzetti, in cui i hiPSCs sono teste di serie. A seguito di differenziazione e di purificazione, le cellule possono essere dissociati e ripiastrate per uso a valle.

1. Media Preparazione

  1. Per il mezzo E8, ottenere una soluzione stock per ogni componente medio (NaHCO3, acido L-ascorbico 2-fosfato, sodio selenite, transferrina, insulina, FGF2, TGFB1) e memorizzare le soluzioni a -20 ° C. Aggiungere la quantità appropriata di soluzioni madre alla bottiglia di DMEM / F12 e filtrare per sterilizzare. La Conc soluzionezione e la configurazione di reazione per i componenti di magazzino e E8 medio si trovano nella tabella 1.
  2. Per la soluzione di matrice extracellulare, scongelare la matrice membrana basale (comunemente in dotazione a 10 mg / ml) a 4 ° CO / N. Matrigel è comunemente utilizzato per la coltura di cellule staminali pluripotenti in quanto le cellule staminali umane pluripotenti possono aderire bene a questo materiale con l'alfa-6-beta-1 integrina 9. Una volta scongelato, fanno 2,25 mg (250 ml) di aliquote sul ghiaccio con ghiaccio puntali freddo e tubi e memorizzare le aliquote a -80 ° C.
    1. Quando precoating piatti con ECMS, scongelare e aliquote della soluzione di matrice extracellulare (ECMS) su ghiaccio. Mescolare il ECMS e medio DMEM / F12 ghiacciata in un rapporto di 1: 200 in ghiaccio. Conservare in luogo fresco per evitare premature ECMS solidificazione.
  3. Per la RPMI / B27 senza prodotto insulina, aggiungere 10 ml di B27 Minus insulina in 500 ml di media RPMI.
  4. Per la RPMI / B27 (con insulina) medio, aggiungere 10 ml di B27 Supplement (con insulin) e 5 ml di antibiotico Pen-strep in 500 ml di mezzi RPMI.
  5. Per il medio di glucosio basso, aggiungere 10 ml di B27 supplemento e 5 ml di antibiotico Pen-strep in 500 ml di media RPMI senza glucosio.
  6. Per il medio / crioconservazione congelamento, miscela di siero fetale bovino con dimetilsolfossido (DMSO) in un rapporto di 9: 1. Il mezzo di congelamento può essere conservato fino a 1 mese a 4 ° C.
    NOTA: Tutti i supporti devono essere filtrati e conservati a 4 ° C ed utilizzati entro 2 settimane se non diversamente specificato. Tutti i volumi di reagente / soluzione utilizzata di seguito sono destinati ad un singolo bene in un 6-pozzetti, se non diversamente specificato.

2. Pre-rivestimento 6 pozzetti con ECMS

  1. Effettuare ECMS mescolando matrice della membrana basale (ad esempio, Matrigel) con ghiaccio freddo DMEM / F12 media in un rapporto di 1: 200, quindi applicare 2 ml di fresco ECMS a ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Ogni bene in un 6-pozzetti riceveranno circa 90 mg ECMS.
  2. Incubare la ECMS rivestito piastre per 1 ora a 37 ° C. Immediatamente prima placcatura cellule, aspirare DMEM soluzione / F12 da ciascun pozzetto. Le piastre saranno quindi pronto a ricevere cellule.

3. scongelamento le hiPSCs congelati

NOTA: Strettamente seguire questa procedura in quanto può portare a coltura ottimale e differenziazione a valle di hiPSCs in hiPSC-CM seguendo il ciclo di congelamento / scongelamento.

  1. Scongelare una fiala di hiPSCs per ogni pozzetto di un 6-pozzetti. Preparare un tubo da 15 ml con 9 ml di freddo media E8 con inibitore di ROCK (10 micron) per ogni flacone. Inibitore ROCK migliora hiPSCs sopravvivenza dopo crioconservazione 10. Tenere i flaconcini di 37 ° C a bagnomaria scongelare le cellule fino a un cristallo di ghiaccio del diametro di circa 5 mm è lasciato.
  2. Spruzzare l'esterno dei flaconcini con il 70% di etanolo. Pulire le fiale con la carta velina prima di passare alla cappa laminare sterile.
  3. Trasferire le cellule nel tubo conico preparato. Risciacquare tegli fiala una volta con 500 ml di E8 medio e trasferire il mezzo contenente le cellule scongelate allo stesso tubo conico. Centrifugare a RT per 4 min a 200 x g.
  4. Aspirare il surnatante dopo centrifugazione e risospendere delicatamente il pellet cellulare con 2 ml di E8 media con inibitore ROCK (10 micron). Trasferire le cellule risospese ad un pozzetto di un 6-pozzetti pre-rivestito con ECMS.
  5. Sostituire il mezzo con E8 medio senza inibitore ROCK dopo 24 ore di coltura. Le cellule dovrebbero hanno aderito entro tale data.

4. Passaging di hiPSCs

  1. Tipicamente, hiPSCs passaggio dopo aver raggiunto il 75% -80% di confluenza in un 6-pozzetti. Aspirare il terreno di coltura. Lavare rapidamente i pozzetti con 1 ml di sterile, RT PBS. Aspirare PBS.
    1. Aggiungere 500 ml di EDTA 0,5 mm o soluzione il distacco delle cellule 1x (ad esempio, Accutase) e incubare per 1-7 minuti a temperatura ambiente. Momento opportuno per EDTA incubazione varia con la linea hiPSC. Aspettiamo di vedere visibile il curling or ispessimento delle colonie intorno ai bordi, in modo da indicare che EDTA o distacco cellulare soluzione è pronto per essere rimosso.
  2. Aspirare il EDTA o la soluzione di distacco cellulare. Aggiungere 1 ml di E8 media integrato con inibitore ROCK 10 micron. Spostare colonie hiPSC nel pozzo ripetutamente pipettando su e giù e spruzzare colonie con una pipetta P1000. Le colonie dovrebbero essere suddivisi in 5-10 grumi di cellule dopo il completamento.
  3. Trasferire le colonie che sono sospesi in 1 ml di terreno con E8 inibitore ROCK in una provetta conica da 15 ml.
  4. Interrompere i grandi grumi di cellule in piccoli grumi nel medio E8. Aggiungere un volume appropriato di E8 media con inibitore alla sospensione cellulare per diluire le cellule. Il volume del supporto da aggiungere per diluizione dipende dalla densità delle cellule e il numero di pozzetti per essere seminati. Idealmente, una sola, l'80% confluenti e dei hiPSCs deve essere diluito 1:12.
    1. Aggiungere 11 ml E8 media con inibitore ROCK agli attuali 1 ml di cell soluzione citata in tubo da 15 ml per ottenere una diluizione 1:12.
  5. Inoltre triturare i grumi di cellule in frammenti a piccole cellule (circa 50-200 cellule in ogni frammento è meglio). Evitare over-triturazione in quanto riduce la sopravvivenza delle cellule.
  6. Aspirare ECMS dalle piastre pre-rivestito e aggiungere 2 ml di cellule risospese in ogni pozzetto. Circa 100.000 cellule per pozzetto di un 6-pozzetti è l'ideale. Obiettivo per erogare le celle uniformemente intorno bene evitare raggruppamento delle cellule al centro del pozzo.
  7. Dopo 24 ore di coltura, sostituire il supporto con E8 medio senza inibitore ROCK. Modificare il terreno di coltura ogni 24 ore fino a quando le cellule diventano 80% confluenti. Poi, le cellule sono ancora pronti per passaggio. Di solito ci vogliono 3-6 giorni tra i passaggi per raggiungere l'80% di confluenza.

5. hiPSCs congelamento

NOTA: seguire da vicino questa procedura in quanto può portare a coltura ottimale e differenziazione a valle di HIPSC in hiPSC-CM seguendo il ciclo di congelamento / scongelamento.

  1. Etichettare tubi criogenici con il nome di linea cellulare, tipo cellulare, il numero di passaggio, e la data di congelamento. Come regola generale, utilizzare un flacone per ogni pozzetto di un 6-pozzetti. Preparare un tubo da 15 ml riempita con 9 ml di E8 media con inibitore ROCK (10 micron). Preparare congelamento media con 90% FBS e 10% DMSO, e mantenere il mezzo a 4 ° C fino al momento dell'uso.
  2. Aspirare il terreno di coltura, aggiungere 500 ml di EDTA 0,5 mm o soluzione il distacco delle cellule 1x e incubare per 2-7 minuti a temperatura ambiente. La durata dell'esposizione EDTA o distacco cellulare soluzione varia da linea cellulare di linea cellulare.
  3. Aspirare EDTA o soluzione il distacco delle cellule. Aggiungere 1 ml di mezzo E8.
  4. Spostare colonie hiPSC nel bene pipettando su e giù e spruzzare colonie con una pipetta P1000. Le colonie non dovrebbero essere suddivisi in più piccola di 100 grumi di cellule. Trasferire le cellule in sospensione per il tubo conico preparato contenente E8. Centrifugare a RT per 4 min a 200 x g.
  5. Aspirare il surnatante e aggiungere 500 ml di medio congelamento freddo al pellet. Risospendere il pellet pipettando una o due volte. La sopravvivenza cellulare è migliorata mantenendo le cellule in grandi ciuffi.
  6. Trasferire le cellule risospese in una provetta criogenica etichetta. Spostare rapidamente le fiale in un contenitore congelamento contenente isopropanolo, che consentirà di raffreddamento graduale. Mantenere il contenitore con le cellule a -80 ° C per 24 ore, quindi trasferire le cellule in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

6. cardiaca Differenziazione delle iPSC umano

NOTA: Tutti i media dovrebbero essere almeno a RT quando aggiunto.

  1. Dopo dissociazione con la soluzione di distacco EDTA o 1x cella, circa 100.000 sementi iPSCs umani sulla ECMS rivestiti piastre di coltura 6 pozzetti per la differenziazione (stessa procedura procedure Passaging cellulare). Quando le cellule raggiungono l'85% di confluenza, cambiare il supporto di RPMI / B27 senza supporto di insulina con 6mcM inibitore GSK3-beta CHIR99021 (CHIR) e mantenere per 48 ore.
  2. Dopo 48 ore, sostituire il mezzo di coltura contenente CHIR con RPMI / B27 senza supporto di insulina e lasciano in pace per 24 ore (fino al giorno 3).
  3. Al giorno 3, cambiare il supporto di RPMI / B27 senza insulina con 5 micron Wnt inibitore IWR1 e mantenere per 48 ore (fino al giorno 5).
    NOTA: Wnt inibizione può anche essere condotta usando altri piccoli composti molecola, come descritto in studi precedenti 11. IWR1 stato selezionato sopra altri inibitori piccole molecole Wnt causa della maggiore gamma in cui è stato dimostrato per essere efficace nell'inibire Wnt segnalazione 11.
  4. Al giorno 5, cambiare il supporto posteriore per RPMI / B27 senza supporto di insulina e lasciar riposare per 48 ore (fino al giorno 7).
  5. Al giorno 7, sostituire il mezzo con RPMI / B27 medio (con insulina) e sostituire medio ogni 3 giorni dopo con lo stesso mezzo. Battito spontaneo dei cardiomiociti dovrebbe in primo luogo essere visibile a circa giorno 8 al giorno10.

7. Purificazione di cardiomiociti umani per fame di glucosio

  1. Al giorno 10 post-differenziazione, cambiare il mezzo in ciascun pozzetto della piastra da 6 pozzetti a 2 ml di mezzo glucosio basso e mantenere le cellule in questo mezzo per 3 giorni (fino al giorno 13).
  2. Al giorno 13, ritorno alle cellule di RPMI / B27 medio (con insulina).
  3. Facoltativamente, replate cardiomiociti prima della seconda tornata di fame di glucosio per contribuire ad allentare i non cardiomiociti dalla piastra di coltura, che facilitano la dissociazione dei non cardiomiociti durante il digiuno del glucosio.
    1. Al giorno 13, media aspirare, lavare una volta con PBS, e dissociare le cellule in cellule singole con 500 ml di dissociazione cellulare dell'enzima per 5 minuti a 37 ° C. In particolare, dopo 5 minuti di trattamento enzimatico, utilizzare una pipetta 1.000 microlitri dissociare manualmente cardiomiociti dal 6 pozzetti ripetutamente tirando l'enzima dissociazione cellulare e spruzzare contro il cardiomyocyte monostrato. Fino a 30 ripetizioni pipettaggio può essere richiesto di dissociare i cardiomiociti in singole cellule.
    2. Dopo che le cellule sono dissociate e sono in forma di singola cellula, raccogliere tutte le cellule in un tubo da 15 ml riempito con 5 ml di RPMI / B27 medio con insulina per diluire l'enzima dissociazione cellulare e centrifugare per 4 min a 200 x g. Aspirare e scartare il surnatante.
    3. Risospendere le cellule con 2 ml RPMI / B27 media e la piastra su un nuovo ECMS rivestita 6 pozzetti. In genere, maggiore confluenza di cardiomiociti aiuta con la sopravvivenza delle cellule durante replating. Obiettivo di replate 2 milioni di cellule per piatto nuovo 6-bene per la sopravvivenza ottimale durante replating.
  4. Al giorno 14, cambiare il supporto posteriore a 2 ml di terreno di glucosio basso per un secondo ciclo di deprivazione di glucosio. Coltivare le cellule in questo stato di glucosio basso per altri 3 giorni. La maggior parte dei non-cardiomiociti moriranno in questa condizione cultura low-glucosio.
  5. Al giorno 17, cambiare il supporto di 2 ml di RPMI / B27 media con insulina. Le cellule rimanenti saranno cardiomiociti altamente purificati. Questi cardiomiociti possono essere utilizzate per l'analisi di espressione genica, screening di farmaci, analisi metabolica, e vari altri saggi a valle.

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Risultati

I cambiamenti morfologici durante hiPSC differenziazione.

Il hiPSC coltivate in lastre senza alimentatore è cresciuto come piatti, colonie bidimensionali. Dopo aver raggiunto circa l'85% di confluenza, hiPSCs sono stati trattati con 6 micron CHIR per la differenziazione (Figura 1A). Notevoli quantità di morte cellulare, un fenomeno normale e comune, sono stati osservati dopo 24 ore di trattamento CHIR. Dopo due giorni di trattamento CHIR, i hiPSCs contin...

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Discussione

Ottenere una grande quantità di cardiomiociti hiPSC derivato altamente purificate è critica per la ricerca cardiaca base e applicazioni cliniche e traslazionali. Protocolli differenziazione cardiaca hanno subito enormi miglioramenti negli ultimi anni, la transizione dai metodi basati corpo embrioidi utilizzano fattori di crescita cardiogeno 2, alla matrice metodi a sandwich 12, e infine a piccole metodi basati monostrato molecola-modulato e 5. Tra i protocolli di cui sopra, il protocollo...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal NIH/NHBI (U01 HL099776-5), dal NIH Director's New Innovator Award (DP2 OD004411-2), dal California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), dall'American Heart Association (14GRNT18630016) e dall'Endowed Faculty Scholar Award della Lucile Packard Foundation for Children e dal Child Health Research Institute di Stanford (a SMW). Riconosciamo anche il sostegno finanziario dell'American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000 e del National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Matrigel (9-12 mg/ml)BD Biosciences354277
terreni RPMIInvitrogen11835055
Terreni RPMI senza glucosioInvitrogen11879-020
B27 Minus InsulinInvitrogenA1895601
B27 Supplement (con insulina)Invitrogen17504-044
Pen-strep antibioticoInvitrogen15140122
Siero fetale bovinoBenchMark100-106
DMSOSigmaD-2650
Inibitore ROCK Y-27632EMD Millipore688000
CHIR99021Thermo Fisher508306
IWR1SigmaI0161
EDTAInvitrogen15575-020
AccutaseMilliporeSCR005
Sollevatore cellulareFisher08-100-240
CryovialFisher (tubi NUNC)375418
TrypLE Select EnzymeInvitrogen12563-011

Riferimenti

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