Articolo metodologico

Sincronizzazione di Caulobacter crescentus Per Indagine del ciclo cellulare batterica

DOI:

10.3791/52633

⸱

8 aprile 2015

 , 
1Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La sincronizzazione delle cellule batteriche è essenziale per gli studi sul ciclo e lo sviluppo delle cellule batteriche. Il Caulobacter crescentus è sincronizzabile attraverso la centrifugazione per densità, consentendo uno strumento rapido e potente per lo studio del ciclo cellulare batterico. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la sincronizzazione delle cellule di Caulobacter.

Abstract

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Il ciclo cellulare è importante per la crescita, la replicazione del genoma e lo sviluppo in tutte le cellule. Nei batteri, gli studi sul ciclo cellulare si sono concentrati in gran parte su cellule non sincronizzate, rendendo difficile ordinare gli eventi temporali necessari per la progressione del ciclo cellulare, la replicazione del genoma e la divisione. Il Caulobacter crescentus fornisce un eccellente sistema modello per il ciclo cellulare batterico in base al quale le cellule possono essere rapidamente sincronizzate in uno stato G0 mediante centrifugazione per densità. Gli esperimenti di sincronizzazione del ciclo cellulare sono stati utilizzati per stabilire gli eventi molecolari che regolano la replicazione e la segregazione cromosomica, per mappare una rete di regolazione genetica che controlla la progressione del ciclo cellulare e per identificare la creazione di complessi di segnalazione polare necessari per la divisione cellulare asimmetrica. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la sincronizzazione rapida delle cellule di Caulobacter NA1000. La sincronizzazione può essere eseguita in un formato su larga scala per la profilazione dell'espressione genica e i saggi western blot, nonché in un formato su piccola scala per la microscopia o i saggi FACS. La rapida sincronizzabilità e l'elevata resa cellulare di Caulobacter rendono questo organismo un potente sistema modello per lo studio del ciclo cellulare batterico.

Introduzione

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Il ciclo cellulare batterica controlla sia la replicazione del genoma e la divisione di cellule figlie. È importante sottolineare che, come la resistenza agli antibiotici è una crescente minaccia per la salute pubblica, il ciclo cellulare batterica presenta un obiettivo non sfruttata per lo sviluppo di antibiotici.

In batterio Caulobacter crescentus, ogni ciclo cellulare porta ad una divisione asimmetrica, ottenendo due cellule figlie di sorti diverse (Figura 1A) 1,2. Una cellula figlia eredita un flagello ed è mobile, mentre l'altra figlia eredita un gambo ed è sessile. Un circuito genetico integrato controlla la progressione del ciclo cellulare e destino cellulare da regolazione trascrizionale, fosfo-segnalazione, e proteolisi regolata 3. Inoltre, la replicazione dei cromosomi e cellule figlie rendimento segregazione simultanee che contengono esattamente una copia del cromosoma 4. È importante sottolineare che questi due tipi di cellule possono essere rapidamente separati da colloIdal particella di silice centrifugazione densità nel ceppo sincronizzabile NA1000 5-7 consente l'isolamento delle cellule swarmer dal resto della popolazione con rese elevate (Figura 1B). Isolato swarmer cellule quindi procedere in modo sincrono attraverso la divisione cellulare asimmetrica. Qui, abbiamo dettaglio il protocollo usato per la sincronizzazione Caulobacter ceppo NA1000. Forniamo protocolli e risoluzione dei problemi comuni sia larga e piccola scala sincronizzazioni. Questa procedura sperimentale fornisce un potente strumento per interrogare il controllo spazio-temporale del ciclo cellulare Caulobacter e il destino delle cellule.

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Protocollo

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1. larga scala Synchrony - ottimale per Western Blot, Microarray / RNA-Seq, e altro materiale saggi Intensive

  1. Da uno stock congelatore o un piatto, crescere a 5 ml O / N cultura del ceppo NA1000 agitando a 28 ° C in PYE medio.
  2. Inoculare 0,5 ml delle cellule dal punto 1 in 25 ml di M2G (Tabelle 1-2) e agitare a 28 ° C fino alla cultura raggiunge un OD 600 tra 0,5 e 0,6.
  3. Inoculare le cellule in 1 L di M2G e agitare a 28 ° C.
  4. Una volta OD 600 raggiunge 0.5 a 0.6, confermare la presenza di swarmer cellule utilizzando liquido montato microscopio fase. Spot 1 ml di cellule su un vetrino, coprire con un vetrino, e l'immagine al microscopio fase. Confermare la presenza di cellule Swarmer visualizzando cellule in rapida nuoto nella popolazione.
  5. Spin cellule per 15 minuti a 7 kxg a 4 ° C in un rotore JA-10.
  6. Scartare il surnatante e aggiungere 180 ml di freddo M2 (Tabelle 1-2) e res delicatamenteuspend tutte le cellule utilizzando una pipetta sierologica. Eliminare le celle liberamente pellet; sono cellule predivisional e se ne andò.
  7. Aggiungere 60 ml di soluzione fredda di silice colloidale (assicuratevi di mescolare la sospensione di silice colloidale bene prima di aggiungere alle cellule) e mescolare bene la sospensione cellulare.
  8. Versare la sospensione cellulare in otto 30 ml provette e centrifugare per 30 minuti a 6,4 kxg a 4 ° C in un rotore JA-20.
    NOTA: Si dovrebbe vedere due bande distinte; la band Swarmer è la banda più bassa, mentre le cellule / predivisional stalking sono nella fascia superiore (Figura 1B).
  9. Aspirare accuratamente la banda superiore e rimuovere il liquido ~ 1 cm sopra la banda swarmer (la banda inferiore).
  10. (Critico) Usando una pipetta Pasteur, rimuovere con attenzione la band swarmer e posto in una provetta pulita. Per lavare via la silice colloidale, superiore al tubo via con freddo M2 e girare per 10 minuti a 6,4 kxg a 4 ° C in un JA-20 del rotore.
  11. Eliminare attentamente il surnatante e risospendere ilcellule in 20 ml di freddo M2 e centrifuga per 10 minuti a 6,4 kxg a 4 ° C in un rotore JA-20.
  12. Risospendere i pellet in 30 ml di freddo M2 e misurare la OD 600 utilizzando uno spettrofotometro e vuoto utilizzando freddo medio M2. Salva 1 ml per l'imaging di fase per verificare swarmer cellule; 90-95% delle cellule dovrebbe essere sciami.
  13. Centrifugare le cellule per 5 min a 6,4 kxg a 4 ° C in un rotore JA-20. Risospendere le cellule in 28 ° C M2G media in modo che la A 600 è ~ 0,3-0,4 e iniziare agitazione a 28 ° C.
    NOTA: i rendimenti tipici sono tra 30 e 60 ml di swarmer coltura cellulare da 1L di cellule non sincronizzate.
  14. Cominciare a prendere punti di tempo (la cultura di tipo selvatico richiede circa 135-140 minuti per dividere) 8,9. Ad ogni punto di tempo, misurare il diametro esterno 600. Controllare che la OD 600 dopo la divisione è pari a circa 2 volte l'OD iniziale 600.
  15. Per macchia o di espressione genica test occidentali, rimuovere 1 ml aliquote della culture nei punti di tempo desiderato, centrifugare a velocità massima in una centrifuga da tavolo per 30 sec, rapidamente decantare o aspirare il mezzo, e flash congelare il pellet cellulare in azoto liquido. Conservare le cellule a -80 ° C fino all'analisi valle.

2. piccola scala Synchrony - ottimale per Microscopia

  1. Da uno stock congelatore o un piatto, crescere un / cultura 5 ml O N agitazione a 28 ° C in M2G.
  2. Diluire in 15 ml di M2G (Tabelle 1-2) e crescere fino a metà-log (OD 600 = 0.5-0.6).
  3. Spin a 6.4 kxg per 10 minuti a 4 ° C in un JA-20 del rotore, e risospendere in 1 ml freddi M2 (Tabelle 1-2) e trasferimento in una provetta 2 ml.
  4. Spin a 15 kxg per 3 minuti in una provetta a pellet cellule, aspirare il surnatante, mettere il pellet sul ghiaccio, e risospendere in 900 ml di freddo M2.
  5. Aggiungere 900 ml di PVP freddo rivestiti di silice colloidale e girare per 20 minuti a 15 kxg a 4 ° C in un microfonotubo rocentrifuge.
  6. (Critico) Aspirare o pipettare dalla cima pedinato banda di cellule / predivisional e raccogliere il fondo swarmer banda in una nuova provetta.
  7. Lavare le cellule due volte swarmer in 1 ml di freddo M2 mentre centrifugazione a 15 kxg per 3 min.
  8. Prima della centrifuga finale, spostare le celle in un pre-raffreddata 1 ml provetta di vetro e misurare la OD 600 delle cellule rispetto ad un bianco di M2.
  9. Risospendere il pellet cellulare finale in 28 ° C M2G ad un OD tra 0,3-0,4 e scuotere cellule / rotolo a 28 ° C.
    NOTA: i rendimenti tipici sono tra 2 e 4 ml di coltura cellulare swarmer.
  10. Per gli esperimenti di microscopia, a intervalli di tempo desiderato posto 1 ml di cellule su un pad agarosio M2G per l'imaging.

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Risultati

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Sincronizzazione tipicamente produce due bande di cellule (Figura 1B): la banda swarmer, che ha una densità più elevata, e una banda cellulare pedinato / predivisional di densità inferiore. Per garantire la sincronizzazione efficiente controlli comuni comprendono il monitoraggio della OD 600 e misurando i livelli di proteina Ctra da Western Blot in distinte del ciclo cellulare punti di tempo. La OD 600 dovrebbe aumentare di circa 2 volte nel corso del ciclo cellulare (Figur...

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Discussione

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Il ciclo cellulare batterico è un processo fondamentale nella vita ed è importante per lo studio della crescita e come bersaglio per gli antibiotici di nuova generazione. Qui, abbiamo dettagliato le procedure di sincronizzazione rapida per C. crescentus NA1000, un organismo modello per lo studio del ciclo cellulare batterico e della divisione cellulare asimmetrica. Questo metodo è modificabile per il western blot, la profilazione dell'espressione genica e i saggi di microscopia a fluorescenza per studiare la re...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano i membri del laboratorio Shapiro e Erin Schrader per i commenti sul manoscritto. Gli autori riconoscono il sostegno finanziario da: borsa di studio post-dottorato NIH F32 GM100732 a JMS e sovvenzioni NIH R01 GM51426 e R01 GM32506 a LS.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Silice colloidale rivestita PVP (Percoll)Sigma-AldrichP4937
Silice colloidale (Ludox AS-40)Sigma-Aldrich420840
JA10 RotoreBeckman-Coulter369687
JA20 RotoreBeckman-Coulter334831
Soluzione di chelato di solfato ferrosoSigma-AldrichF0518
Provette da centrifuga da 30 mlCorning8445
Na2HPO4EMDSX0720-1
KH2PO4VWRBDH9268-500G
NH4ClAmresco0621-500g

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  3. McAdams, H. H., Shapiro, L. A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space. Science. 301, 1874-1877 (2003).
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Sincronizzazione del ciclo cellularecentrifugazione a densit differenzialeisolamento di cellule swarmermicroscopia a contrasto di faseanalisi Western Blotprofilazione dell espressione genicaanalisi della proteina CTRAdivisione cellulare asimmetrica

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