Il metodo di imaging verticale descritto in questo protocollo consente la visualizzazione dettagliata dei poli di un uovo di Drosophila melanogaster in via di sviluppo. Questa visione finale fornisce una nuova prospettiva sulle disposizioni e le morfologie di più tipi di cellule nell'epitelio follicolare.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
L'oogenesi di Drosophila melanogaster fornisce un contesto ideale per lo studio di vari processi di sviluppo poiché l'ovaio è relativamente semplice in architettura, è ben caratterizzato ed è suscettibile di analisi genetica. Ogni camera uovo è costituita da cellule germinali circondate da un singolo strato epiteliale di cellule follicolari somatiche. Sottogruppi di cellule follicolari subiscono la differenziazione durante fasi specifiche per diventare diversi tipi di cellule. Le tecniche standard consentono principalmente una visione laterale delle camere uovo e quindi una visione limitata dell'organizzazione e dell'identità delle cellule follicolari. Il protocollo di imaging verticale descrive una tecnica di montaggio che consente una nuova visione verticale delle camere delle uova con un microscopio confocale standard. I campioni vengono prima montati tra due strati di gelatina di glicerina in posizione laterale (orizzontale) su un vetrino da microscopio in vetro. La gelatina con le camere delle uova racchiuse viene quindi tagliata in blocchi, trasferita su un vetrino coprioggetti e capovolta per posizionare le camere delle uova in posizione verticale. Le camere delle uova montate possono essere visualizzate su un microscopio confocale verticale o invertito. Questa tecnica consente di studiare la specificazione, l'organizzazione, i marcatori molecolari e lo sviluppo delle cellule follicolari con nuovi dettagli e da una nuova prospettiva.
Introduzione
Studio di Drosophila melanogaster ha fornito grandi intuizioni nella regolazione genetica di una vasta gamma di fenomeni. In particolare, non vi è stata un'ampia ricerca sullo sviluppo delle uova, perché ovogenesi fornisce un modo trattabili per indagare molti diversi processi di sviluppo, tra cui patterning tessuti, i cambiamenti di polarità cellulare, la commutazione del ciclo cellulare, e la regolazione traslazionale 1,2,3,4. Un importante evento morfogenica durante oogenesi è la specificazione, l'acquisizione di motilità e la migrazione di un insieme di cellule chiamate cellule di confine (recensito in 5). Poiché la migrazione delle cellule è una caratteristica chiave della morfogenesi animali, e perché la regolazione genetica di questo processo è ben conservato, meccanismi di determinati in mosche sono suscettibili di essere importante in altri contesti. Quindi, stiamo studiando il controllo molecolare della migrazione delle cellule di confine. Per i nostri studi, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per osservare i poli anteriori di sviluppo delle uova,dove sorgono le cellule di confine, per esaminare come si sviluppano nel dettaglio.
All'interno l'ovaio, esistono camere uovo a vari stadi di sviluppo lungo le catene di chiamate ovarioli, che sono racchiusi in un sottile guaina (Figura 1A). Ogni camera di uovo andrà a formare un uovo. Durante oogenesi, diversi tipi di cellule devono sviluppare in modo coordinato. Il D. Camera melanogaster uovo è composto da 16 celle germinali, tra cui un ovocita, circondato da un singolo strato epitelio follicolare 6. Un piccolo numero di cellule specializzate, chiamate cellule polari, sorgono a anteriore e posteriore poli dell'epitelio. Le cellule di frontiera 6-8 originano nell'epitelio anteriore della camera di uovo, indotta dalle cellule polari 5,7. A metà oogenesi (fase 9), le cellule di confine si staccano dai loro vicini e migrano tra le cellule nutrici per raggiungere l'ovocita al posteriore della camera di uovo 5,7. Questo movimento deve essere realizzatomentre le cellule di confine rimangono in un cluster circostante due celle polari non mobili, rendendo questo tipo di migrazione cellulare collettiva. La migrazione di successo del cluster cella di bordo assicura il corretto sviluppo del micropilo del guscio d'uovo, che è necessaria per la fecondazione.
Le cellule polari anteriori istruiscono il destino delle cellule di confine attivando una cascata di trasduzione del segnale. Cella polare secernono una citochina, non accoppiato (UPD), che si lega ad un recettore transmembrana, Domeless (DOME), sulla vicina cellule del follicolo durante fase 8 dello sviluppo dell'ovocita 8,9. Il legame di UPD provoca Janus tirosin chinasi (JAK) di fosforilare il trasduttore di segnale e attivatore di trascrizione (STAT) 8,10,11. STAT sposta quindi al nucleo di attivare la trascrizione. Le cellule di confine lenti (SLBO) è un fattore di trascrizione che è un bersaglio trascrizionale diretta di STAT ed è anche necessario per la migrazione delle cellule di confine 12. Viste laterali delle camere uovo indicano tattività di STAT cappello è regolata in un gradiente attraverso l'epitelio anteriori 8,11,13. Cellule del follicolo vicini alle cellule polari hanno i più alti livelli di attivazione STAT, quindi diventano cellule di frontiera e invadono il tessuto germinale adiacente.
Per capire come le cellule di confine sono specificati all'interno e si staccano dal epitelio, abbiamo bisogno di osservare come il tessuto è organizzato. Se consideriamo le camere di uova da una prospettiva antero-on, ci aspetteremmo simmetria radiale di attività STAT nelle cellule follicolari che circondano le cellule polari. Un dall'estremità vista sarebbe anche mostrare più accurato differenze di proteine di membrana e interfacce cellula-cellula prima e durante il distacco che confrontando cellule in differenti piani focali. Perché le camere di uova sono oblunghe e attaccato tra loro da cellule gambo, si depositano su vetrini lateralmente, il che rende difficile osservare l'architettura anteriore. Pertanto, molte informazioni sulle cellule ai poli della camera uovo hastato dedotto da viste laterali. Anche se alcune informazioni possono essere ottenute attraverso algoritmici 3-D ricostruzioni di sezioni ottiche, dispersione della luce, photobleaching e limiti più poveri della risoluzione dell'asse Z rendere queste informazioni meno dettagliate e affidabili, in assenza di tecniche costose come super-risoluzione microscopio 14 . Altri tipi di immagini sezione a base (per esempio, microscopia elettronica o microtomo sezionamento) richiedono ampie manipolazione dei tessuti, comprendenti disidratazione, aumentando la probabilità di artefatti. Così, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per l'immagine D. camere melanogaster uovo mentre in posizione verticale. Questo metodo è già dimostrato utile nel chiarire come cellule mobili sono fated (vedere risultati rappresentativi e Manning et al, in esame), ed è probabile che sia più ampiamente prezioso negli studi di altri aspetti della oogenesis.
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Protocollo
1. dissezione ovarioli
- Trasferire una quindicina di 2-4 giorni di età mosche femmine e alcuni maschi di una nuova mosca alimento flacone con aggiunta di lievito secco attivo. Utilizzare il cotone come una presa per i flaconi, e aggiungere qualche goccia di acqua per il cotone per mantenere l'umidità alta.
- Luogo flacone in un incubatore a 25 ° C per 14-16 ore per massimizzare il numero di stage 8-10 camere uovo.
NOTA: Il tempo di incubazione varia a seconda della temperatura e la fase desiderata. - Preparare i media dissezione, 0.1M KPO 4 e NP40 soluzioni come necessario per il giorno successivo (vedi Materiali).
- Anestetizzare linea con CO 2, e mettere sotto un microscopio dissezione. Dispensare alcune gocce di media dissezione in ogni cavità nella diapositiva depressione vetro.
- Tenere pinze in ogni mano ad un angolo di circa 30 ° rispetto al piano del tavolo e orientare una mosca femmina con le ali giù. Con la mano non dominante, prendere la femmina usando pinze, afferrando il suo al dinterior dell'addome, vicino al torace, e la immergere nei media dissezione nella depressione slitta (Figura 1A riquadro).
- Con l'altra coppia di pinze, afferrare l'esoscheletro al posteriore ventrale dell'addome e perforare attraverso. Afferrare le ovaie alla estremità posteriore, quindi tirare fuori dell'addome e posto in media fresca sull'altro lato della slitta depressione. (Figura 1A riquadro). Evitare di tirare a parte l'intestino. Eliminare la carcassa.
- Ripetere con gli altri mosche femminili fino a quando tutte le ovaie vengono sezionati. Eliminare i maschi.
- Con una coppia di pinze, tenere un'ovaia alla fine posteriore (vicino più grandi camere d'uovo), e con l'altra mano usare un paio di pinze per pizzicare una delle camere più uova anteriori (germarium). (Figura 1A).
- Lentamente e costantemente, tirare una catena ovariole dalla guaina dell'ovaio. Continuare a sezionare fuori ovarioli individualmente fino a quando tutte le camere uovo desiderati sono rdell'uso e rimossi.
- Ripetere i passaggi 1,7-1,8 per tutti ovaie sezionati.
- Una volta completato, il trasferimento ovarioli ad un tubo 0,6 ml con una pipetta di trasferimento di plastica.
- Lasciate ovarioli depositano sul fondo della provetta, quindi procedere al fissaggio e colorazione passi.
2. immunofluorescenza (IF) La colorazione di ovarioli
- Rimuovere con attenzione i media dissezione da ovarioli con una pipetta. Assicurarsi di non rimuovere eventuali ovarioli o camere di uova. Lasciare circa 50 ml di ovarioli e media dissezione.
- Aggiungere 50 ml di 16% paraformaldeide a 150 ml di 0,1 M KPO 4 Buffer in un tubo, e aggiungere la soluzione alle camere uovo di correggerli. Incubare mentre a dondolo per 10 min. ATTENZIONE: paraformaldeide è tossico.
- Rimuovere fissativo e lavare due volte con 0,5 ml di tampone di lavaggio NP40.
- Lavare due volte per 15 minuti ciascuno a RT.
- Fare riferimento alla norma se il protocollo 15 per passi successivi.
- In breve, dopo la fissazione, aggiungereanticorpi primari alle diluizioni appropriati e incubare O / N a 4 ° C. Lavare in NP40 più volte, quindi aggiungere anticorpi secondari (1: 200) diluizioni.
- Lavare più volte in NP40, quindi aggiungere DAPI (1: 1.000) per 10 minuti, quindi ripetere lavaggi. Una volta se il protocollo è completo, aggiungere 200 ml di glicerolo al 50% in PBS per camere d'uovo e lasciate riposare a temperatura ambiente per 2 ore.
- Rimuovere la soluzione, sostituirlo con il 70% glicerolo in PBS, e coprire con un foglio. Posizionare campione a 4 ᵒC fino al momento per il montaggio. Nel frattempo, continuare con il passo 3.
3. preparazione preliminare di diapositive gelatina glicerina
- Misurare almeno 4 ml di glicerina gelatina con una spatola e riempire un tubo di coltura cellulare di vetro per il marchio a metà strada. Sciogliere gelatina glicerina in un bagno di acqua a 55 ° C per 30 min.
- Versare una piccola goccia di glicerolo, circa 300 ml, dalla soluzione madre su due vetrini da microscopio. Utilizzando un tessuto, diffuso glicerolo in un sottile layer su ciascuna delle diapositive. Ciò fornisce una base e consente una facile rimozione di gelatina glicerina al punto 5.6.
- Tagliare la punta fuori di un filtrato puntale 1.000 ml. Usa taglio puntale per trasferire 1000-1500 ml di caldo gelatina glicerina lentamente ad ogni vetrino da microscopio. Fare attenzione per evitare le bolle.
- Lasciate diapositive gelatina glicerina riposare per 5 minuti a temperatura ambiente per impostare.
- Collocare ogni diapositiva gelatina glicerina in 60 mm × 15 mm piatto di Petri e coprire con pellicola trasparente. Posto a 4 ° CO / N. Facoltativamente, negozio di glicerina scivoli gelatina per un massimo di 5 giorni a 4 ° C.
4. Montaggio Egg Chambers
- Utilizzando campioni dal punto 2.5, pipette alcune gocce 3 microlitri delle camere uovo nel 70% glicerolo attraverso uno glicerina gelatina diapositiva. Continuare pipettaggio 3 gocce microlitri fino a quando tutte le camere di uova sono in questa diapositiva. Assicurarsi che ogni goccia contiene almeno dieci camere d'uovo. Nel frattempo, scaldare un tubo cultura di gelatina glicerina in un bagno di 55 ° C Acque.
- Posizionare il vetrino gelatina glicerina con le camere d'uovo al microscopio dissezione. Regolare ingrandimento in modo che solo una goccia di camere uovo è nel campo di vista (Figura 1B).
- Utilizzando un ago calibro 30 come un cucchiaio, prendere la camera stadio di uovo desiderato. Quando necessario, camere uovo desiderati separati da una catena ovariole utilizzando l'ago come un coltello.
- Per evitare detriti che possono interferire con le immagini, trasferire la camera delle uova alla seconda diapositiva gelatina glicerina, con la parte anteriore rivolta verso sinistra (Figura 1E -1). Ripetere finché ci sono almeno sette camere uovo allineati in una colonna (Figura 1C).
- Formare nuove colonne di sette finché tutte le camere uovo desiderati vengono trasferiti alla seconda slitta gelatina glicerina.
- Strappare un piccolo pezzo di tessuto e di torsione. Usare questo per assorbire l'eccesso di PBS-Glicerolo dalle camere di uova da sfiorando ciascuno. Fare attenzione a non rimuovere le camere di uova.
- Tagliare ilpunta di un filtrato puntale 200 microlitri. Utilizzare questo per trasferire 150 ml di glicerina gelatina per coprire tutte le colonne delle camere uovo.
NOTA: La quantità di glicerina gelatina necessario per coprire le colonne si riferiscono al fasi camera d'uovo e il numero di colonne. Importo può essere regolata. - Lasciate che le camere d'uovo montati riposare per 5 minuti a temperatura ambiente fino a quando lo strato superiore della gelatina glicerina è completamente solidificato (Figura 1D).
- Luogo di diapositive delle camere uovo montati in un piatto di 60 mm × 15 millimetri di Petri e coprire con pellicola trasparente. Conservare a 4 ° CO / N per consentire gli strati gelatina glicerina per solidificare insieme (posto al buio se non vi è preoccupazione per photobleaching).
5. Preparazione di uova Chambers for Imaging
- Mettere diapositive delle camere uovo montati sotto un microscopio dissezione. Regolare ingrandimento in modo che solo una colonna di camere uovo è nel campo visivo.
- Utilizzando un angolo di 45 ° bisturi in miniatura, tagliare un straight linea lungo il lato destro della prima colonna di camere d'uovo (vicino al lato posteriore delle camere d'uovo). (Figura 1D-E)
- Quindi, tagliare sopra la prima camera uovo in alto e in basso l'ultima camera di uovo in colonna. A questo punto la colonna di camere uovo deve essere tagliato su tre lati.
- Utilizzando un microknife, fetta lungo il lato sinistro della colonna, il più vicino possibile al lato anteriore delle camere d'uovo (Figura 1E -3).
- Dispensare 100 ml di freddo 1X PBT sulla colonna di taglio.
- Utilizzare una spatola rotonda taglio per rimuovere la gelatina glicerina in eccesso intorno a tre lati della colonna taglio delle camere uovo e scartare, lasciando il resto della diapositiva.
- Inserire la spatola nella taglio effettuato sul lato anteriore della camere d'uovo e separare la colonna dal blocco gelatina glicerina primaria.
- Preparare i campioni per entrambi invertiti (5.8.1) o verticale (5.8.2) microscopia.
- Per invertito Microscopio: t Transferegli colonna camere uovo per un coprioggetto con il lato anteriore delle camere uovo rivolto verso il basso. Ripetere i passaggi 5,2-5,8 fino a quando tutte le colonne di gelatina glicerina sono stati rimossi e montato. Aggiungere un paio di gocce di 50% PBS-glicerolo su ogni blocco di camere d'uovo per evitare che si secchi. Camere di uova Immagine direttamente sul coprioggetto.
- Per microscopio verticale: Trasferire la colonna di camere uovo di un vetrino da microscopio con il lato anteriore rivolto verso l'alto. Ripetere i passaggi 5,2-5,9 fino a quando tutte le colonne di gelatina glicerina sono stati rimossi e montati su vetrini da microscopio. Aggiungere un paio di gocce di 50% PBS-glicerolo su ogni blocco di camere d'uovo e blocchi di copertura con un # 1 ½ coprioggetto.
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Risultati
Il metodo di imaging in posizione verticale ha permesso di vedere direttamente l'organizzazione delle cellule dell'epitelio follicolare anteriore in fase 8. indicatore generale per il destino delle cellule del follicolo, il Occhi Assente (EYA) di proteine, così come il marcatore DNA nucleare DAPI, ha mostrato anche espressione in questo campo delle celle, e hanno dimostrato che tutte le cellule potrebbero essere visti con simili intensità di colorazione (Figura 2b "). Proteine regolate in...
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Discussione
Qui si descrive un metodo per montare e immagine piccola, sviluppando camere uovo da una prospettiva dall'estremità. Tecniche comuni per le camere di imaging di uova sono ottimizzati per le viste laterali e soprattutto permettono una visualizzazione precisa delle cellule del follicolo medio-laterale quando colorati con anticorpi fluorescenti. L'uso di Z-stack o 3-D ricostruzioni aiuti in visualizzazione di più piani focali, ma è ancora insufficiente per la risoluzione sub-cellulare dei poli delle camere uovo ell...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Apprezziamo l'assistenza dei membri della comunità delle mosche, in particolare la dottoressa Denise Montell, la dottoressa Lynn Cooley e la dottoressa Pernille Rorth, per i reagenti. Ringraziamo Flybase, il Bloomington Drosophila Stock Center e la Developmental Studies Hybridoma Bank rispettivamente per le informazioni e per la fornitura di stock di mosche e anticorpi. LM è supportato dalla borsa di studio del Dipartimento dell'Istruzione, dalla borsa di studio per la formazione (P200A120017) Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) e da una sovvenzione NIGMS Initiative for Maximizing Student Development (2 R25-GM55036). Una parte del lavoro di microscopia è stata supportata dalla sovvenzione NSF MRI DBI-0722569 e dalla Keith R. Porter Core Imaging Facility. La ricerca è stata supportata in parte da un NSF CAREER Award (1054422) e da un Basil O'Connor Starter Scholar Award della March of Dimes, entrambi assegnati a MSG.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,1 M Tampone fosfato di potassio (KPO4 Buffer) | Aggiungere 3,1 g di NaH2PO4• H2O e 10,9 g di Na2HPO4 (anidro) a H2O distillato per ottenere un volume di 1 L. Il pH della soluzione finale sarà 7,4. Questo tampone può essere conservato fino a 1 mese a 4°C. | ||
| Soluzione acquosa di paraformaldeide al 16%, | microscopia elettronica | Scienze 15710 | senza metanolo per preservare la fluorescenza GFP |
| 30G x 1/2 pollice ago | VWR | BD305106 | smusso regolare |
| Genesee Scientific | 62-103 | Per ingrassare le mosche femmine | |
| Siero bovino Albumina | PAA-azienda di coltura cellulare | A15-701 | Utilizzato in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Pinze | Strumenti di scienza fine | 11295-10 | Lega Dumostar, punta biologie; le punte affilate sono essenziali per la dissezione |
| ovarioleDAPI (4′,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato) | Sigma Aldrich | D9542 | 5 mg/ml soluzione madre |
| Siero fetale bovino (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Aggiunto al mezzo di dissezione supplementare (10%) |
| Provetta per coltura in vetro | VWR | 47729-576 | |
| Vetrini a depressione in vetro | VWR | 470019-020 | a doppia cavità da 1,2 mm di spessore |
| Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mezzi di montaggio | |
| Glicerolo | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (intercambiabile per Nonidet P-40) Utilizzato nel tampone di lavaggio NP40 |
| Stereoscopio fluorescente Leica | Leica Microsystems | ||
| Microscopio confocale Leica SP5 | Leica Microsystems | 40x/0.55NA | |
| Micro spatola | VWR | 82027-518 | Vetrino |
| microscopio | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Tampone | 50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0,5% Ipegal, 1 mg/ml BSA e 0,02% sodio azide | ||
| Penicillina-Streptomicina-Glutammina | Life Technologies | 10378-016 | Aggiunto al mezzo di dissezione supplementare (0,6X) |
| Petridish- Polisterina, sterile | VWR | 82050-548 | 60 L x 15 H mm |
| Tampone fosfato Soluzione salina | Sigma | Aldrich P3813-10PAK | 10 confezioni di polvere |
| Fosfato di potassio bibasico | Sigma Aldrich | P3786-500G | Utilizzato in 0,1 M KPO4 Buffer |
| Fosfato di potassio monobasico | Sigma Aldrich | P9791-500G | Utilizzato in 0,1 M KPO4 tampone |
| [intestazione] | |||
| Schneider' s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 | Con L-glutammina e bicarbonato di sodio |
| Azoturo di sodio | Sigma Aldrich | S2002-25G | Utilizzato nella colorazione di anticorpi fluorescenti |
| Cloruro di sodio | Sigma Aldrich | S3014-500G | Utilizzato nel tampone di lavaggio NP40 |
| TRIS-HCl | IBI Scientific IB70144 | 1 M TRIS-HCl, pH 7.4 | |
| Volocity Immagine 3D Software di analisi | PerkinElmer | Per l'elaborazione di Z-stack confocali |
Riferimenti
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