Articolo metodologico

Un metodo semplice e poco costoso per la determinazione fredda sensibilità e adattamento nei topi

DOI:

10.3791/52640

⸱

17 marzo 2015

 ,  ,  , 
1MSTP, Neuroscience Program, Washington University in St. Louis, 2Washington University Pain Center, Department of Anesthesiology, Washington University in St. Louis

In questo articolo

Sommario

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Il Cold Plantar Assay (CPA) misura la risposta al freddo tra 30 °C e 5 °C e può anche misurare l'adattamento al freddo. Questo protocollo descrive come utilizzare il CPA per misurare l'ipersensibilità al freddo, l'analgesia e l'adattamento nei topi.

Abstract

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L'ipersensibilità al freddo è un problema clinico serio, che colpisce un ampio sottogruppo di pazienti e causa una significativa diminuzione della qualità della vita. Il test plantare a freddo consente la valutazione oggettiva ed economica della sensibilità al freddo nei topi e può quantificare sia l'analgesia che l'ipersensibilità. I topi vengono acclimatati su una lastra di vetro e una pallina di ghiaccio secco compressa viene tenuta contro la superficie di vetro sotto la zampa posteriore. La latenza al prelievo dal vetro di raffreddamento viene utilizzata come misura della sensibilità al freddo.

La sensazione di freddo è importante anche per la sopravvivenza nelle regioni con sbalzi di temperatura stagionali e, per mantenere la sensibilità, gli animali devono essere in grado di regolare le loro soglie di risposta termica in modo che corrispondano alla temperatura ambiente. Il Cold Plantar Assay (CPA) consente anche lo studio dell'adattamento ai cambiamenti della temperatura ambiente testando la sensibilità al freddo dei topi a temperature comprese tra 30 °C e 5 °C. I topi vengono acclimatati come descritto sopra, ma la lastra di vetro viene raffreddata alla temperatura iniziale desiderata utilizzando scatole di alluminio (o pacchetti di fogli di alluminio) riempite con acqua calda, ghiaccio umido o ghiaccio secco. La temperatura della piastra viene misurata al centro utilizzando una sonda a termocoppia a filamento T. Una volta che la piastra ha raggiunto la temperatura di partenza desiderata, gli animali vengono testati come descritto sopra.

Questo test permette di testare i topi a temperature che vanno da innocue a nocive. Il CPA produce risposte comportamentali inequivocabili e coerenti nei topi non feriti e può essere utilizzato per quantificare sia l'ipersensibilità che l'analgesia. Questo protocollo descrive come utilizzare il CPA per misurare l'ipersensibilità al freddo, l'analgesia e l'adattamento nei topi.

Introduzione

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Misurare reattività freddo nei roditori è importante per migliorare la comprensione dei potenziali meccanismi di sensibilità freddo negli esseri umani sia in condizioni normali e patologiche. The Cold plantare Assay (CPA), originariamente sviluppato diversi anni fa 1, è stato progettato per generare risposte riproducibili, inequivocabili murine comportamentali a uno stimolo freddo consegnato a RT. Miglioramenti più recenti di questo test hanno permesso la misurazione riproducibile di sensibilità fredda in un ampio intervallo di temperature 2. Entrambe le versioni sono inoltre progettati per essere relativamente alto rendimento, e poco costoso da utilizzare.

Una grande quantità di progressi sono stati compiuti nella comprensione dei meccanismi di sensibilità a freddo utilizzando altri metodi comportamentali. Un metodo è il test di evaporazione acetone, che comporta tamponando o spruzzando acetone sulla zampa mouse e misurando la quantità di tempo che il mouse spende portando l'3,4 zampa. Purtroppo,le risposte alla acetone evaporazione sono confusi dalla sensazione umida e l'odore del acetone. Inoltre, lo stimolo fredda che viene applicato durante la prova di evaporazione acetone può variare in base alla quantità di acetone applicata, ed è difficile da quantificare. Infine, i topi hanno risposte indenni minime quantità di acetone al basale, rendendo impossibile misurare l'analgesia in assenza di ipersensibilità con questo metodo.

Un altro test classico per le risposte a freddo è il test coda flick, dove la latenza di recesso viene misurata dopo la coda è immerso in 5,6 acqua fredda. Mentre le risposte comportamentali in questo saggio sono inequivocabili e il test misurano risposte ad una temperatura specifica, gli animali devono essere trattenuti durante la prova, che possono alterare la risposta fredda attraverso ben definite meccanismi analgesici da stress 7.

Un altro strumento comunemente usato è il test della piastra fredda, che misura il comportamentorisposte di topi dopo che sono posti su una piastra di Peltier raffreddato 8-10. Mentre questo strumento fornisce informazioni sulle risposte animale a temperature specifiche, è stato anche utilizzato incoerente; diversi gruppi hanno misurato diversi tipi di risposte incluso il numero di salti 8,11, la latenza alla prima risposta 8,11- 13, e il numero di ascensori paw 11,13,14 con risultati molto diversi. Il saggio piastra fredda è relativamente bassa capacità, come solo un animale può essere testato per volta, e richiede un dispositivo Peltier costosi e fragili.

Il test preferenza temperatura 2-piastra è un derivato comunemente usato per il test della piastra fredda che misura la quantità relativa di tempo che gli animali passano su 2 piastre collegate delle diverse temperature 9,15- 17. Un altro simile test comunemente usato è il saggio gradiente termico, in cui la quantità di tempo che i topi passano in differenti zone di temperaturacompresa tra 5 ° C e 45 ° C su una piastra metallica lunga 16 viene misurata. Mentre questi test permettono il confronto delle temperature, non è chiaro se il comportamento rappresenti avversione temperatura o di preferenza temperatura.

Infine, la dinamica dosaggio piastra fredda è stato usato per misurare quanto topi rispondono alle mutevoli temperatura ambiente 18. Questo metodo prevede il posizionamento mouse su un dispositivo Peltier RT e rampa verso il basso per 1 ° C durante la misurazione di quanto i topi saltano o leccarsi le zampe a temperature diverse placche. Mentre questo test come topi adattarsi ad un ambiente di raffreddamento, non fornisce un modo per testare come topi rispondono ad uno stimolo freddo nella cornice di una temperatura ambiente più fresco. Inoltre, richiede attrezzature costose effettuare e non fornisce un modo per acclimatare topi all'apparecchiatura prova prima di misurare la loro sensibilità fredda.

Per completare questi test, il CPA testa il ACCLIMAted risposte ad uno stimolo fredda ben definito in una varietà di campi di temperatura, o durante il processo di adattamento a temperature ambiente freddo. Si può testare fino a 14 topi alla volta con il nostro apparato attuale, con la possibilità di essere a buon mercato in scala per i test high-throughput.

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Protocollo

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Tutti i protocolli topo erano in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute e sono state approvate dal comitato Animal Studies di Washington University School of Medicine (St. Louis, MO).

1. Preparare la piastra di prova e Contenitori

  1. Pulire la superficie del vetro.
  2. Fissare la T-tipo di sonda termocoppia filamento alla superficie al centro della lastra di vetro con il nastro di laboratorio.
  3. Posizionare dello stabulario sulla lastra di vetro in una singola linea lungo il centro del piatto.
  4. Infilare la sonda della termocoppia attraverso il recinto degli animali centro e collegarlo alla data logger. Girare il data logger sulla mentre disattivare la funzione di spegnimento automatico, e collegare il logger al computer con il cavo fornito.
    1. Se si registra la temperatura della piastra durante l'esperimento, aprire il software datalogger per iniziare a registrare le temperature della piastra.
    2. Se necessario, modificare il software di ricavo la temperatura della piastra ogni secondo.
    3. Iniziare il rilevamento della temperatura utilizzando il software fornito con il data logger termico.
  5. Separare il recinto con inserti neri per impedire l'interazione visiva tra i topi.
  6. Posizione rispecchia sotto il vetro in modo tale che la parte inferiore delle recinzioni è visibile da una posizione seduta comoda.

2. riscaldamento / raffreddamento della lastra di vetro

  1. Riempire scatole di alluminio con acqua riscaldata, ghiaccio umido, o ghiaccio secco e posizionare in modo appropriato sulla lastra di vetro (pacchetti di stagnola alluminio riempiti con ghiaccio secco può essere utilizzato anche per raffreddare il vetro; Figura 1) 2.
    1. Per la prova a 30 ° C, posizionare le scatole di alluminio circa 0,25 '' lontano dai recinti degli animali (Figura 2b) 2.
      1. Impostare un circolatore acqua riscaldata su entrambi i lati della piastra di vetro. Impostare il circolatore a 45 - 60 ° C, e civia e per riempire le scatole di alluminio, con un flusso costante di acqua calda (Figura 1C) 2.
      2. Posizionare i circolatori tale che l'acqua calda dalle scatole di alluminio drena direttamente nel serbatoio del circolatore su ciascun lato (Figura 1C) 2.
    2. Per il test a temperatura ambiente, lasciare le caselle vuote (Figura 2) 2.
    3. Per la prova a 17 ° C, posizionare le caselle circa 0,25 '' lontano dai recinti di animali su entrambi i lati e riempire con ghiaccio umido (Figura 2) 2.
    4. Per la prova a 12 ° C, posizionare le caselle circa 1,25 '' di distanza dalle recinzioni su entrambi i lati e riempire con ghiaccio secco (Figura 2) 2.
    5. Per le prove a 5 ° C, posizionare le caselle circa 0,25 '' distanti custodie su entrambi i lati e riempire con ghiaccio secco (Figura 2) 2.
      1. Quando il raffreddamento del bicchiere con ghiaccio secco, assicurarsi che vi sia sufficiente ventilazione per evitare l'accumulo di CO 2 nella stanza.
  2. Attendere che il vetro per raggiungere il campo di temperatura desiderata.
  3. Aggiungere i topi ai contenitori sulla piastra.
    NOTA: Un generatore di rumore bianco può essere utilizzato per ridurre i disturbi acustici.
  4. Attendere che i topi si adatti.
    NOTA: Nella nostra struttura questo richiede circa 2,5 ore, ma puo 'variare notevolmente in base stabulazione degli animali e le condizioni di manipolazione.
  5. Mantenere vetro nel range di temperatura desiderato garantendo che le scatole siano pieni di acqua riscaldata, ghiaccio umido o ghiaccio secco.
    NOTA: Con il nostro apparato le caselle devono essere riempite con ghiaccio circa ogni 90 min.
    NOTA: Per la condizione di 17 ° C, è utile svuotare la maggior parte dell'acqua dalle scatole di alluminio attraverso i fori di scarico prima di riempire con ghiaccio. Ciò stabilizzare la temperatura migliore e prtroppopieno evento
    NOTA: La quantità esatta del ghiaccio secco varia stagionalmente, ma in generale mantenendo caselle più di ¼ completi lungo tutta la lunghezza della scatola manterrà costante la temperatura.

3. Test del Mice a temperature fisse

  1. Al di fuori della sala del comportamento, riempire un secchio di ghiaccio pieno per metà di ghiaccio secco.
  2. Con un martello o mazzuolo, schiacciare il ghiaccio secco in una polvere finissima.
    NOTA: eccessivo del secchio renderà difficile schiacciare completamente il ghiaccio secco in polvere.
  3. Utilizzando una lama di rasoio o forbici, tagliare la parte superiore di una siringa da 3 ml.
  4. Utilizzando un ago 21 G, colpire 3 fori ai lati opposti della siringa (totale di 6 buche).
    NOTA: Questi fori diminuirà la pressione generata dalla sublimazione comprimendo il ghiaccio secco. La siringa cut-off può essere riutilizzato per diversi esperimenti.
  5. Prendere la siringa, polvere ghiaccio secco, e un cronometro portatile nella stanza comportamentale.
  6. Riempire la camera di siringa di mezzo pieno di polvere di ghiaccio secco. Tenere l'estremità tagliata del siringa contro un oggetto piatto, e saldamente comprimere la polvere utilizzando lo stantuffo. Stai attento; lo stantuffo di plastica può piegarsi o rompersi dalla pressione. Se questo accade, sostituire lo stantuffo di una nuova siringa.
  7. Estendere la punta del pellet ghiaccio secco compressa oltre il bordo della siringa.
  8. Topi di prova che sono completamente a riposo.
    1. A 30 ° C, 23 ° C e 17 ° C, i topi che hanno tutte 4 zampe sul vetro e non si muove, ma non completamente addormentato 19.
    2. Al 12 ° C e 5 ° C, i topi di prova che sono su 2 zampe o 4 zampe e non in movimento o saltare.
  9. Utilizzando gli specchi per il targeting, delicatamente ma con fermezza premere il filo pellet piatto contro la superficie di vetro sotto il mouse hindpaw (Figura 1A) 2. Avviare la mano-timer.
  10. Arrestare il timer e rimuovere il pellet quando il mouse si allontana dal vetro raffreddato.
    NOTA: Lo spostamento di retrocessione può essere verticale o orizzontale.
    1. Se il mouse si muove molto brevemente la zampa e poi ritorna alla superficie di raffreddamento, continuano i tempi e stimolando il mouse fino a quando fa una mossa permanente di distanza.
      NOTA: Il nostro laboratorio utilizza un tempo massimo di 20 sec stimolo per topi nella maggior parte dei casi.
  11. Ripetere questa procedura di test fino a quando vengono raccolti almeno 3 valori per ogni zampa di ciascun animale. Prove separate test zampe opposte sulla stessa mouse almeno 7 min, e prove consecutive separati per ciascuna zampa di almeno 15 min.
  12. Se necessario, utilizzare diversi spessori di vetro per generare differenti tassi di raffreddamento (Figura 3) 1.
    NOTA: Il tasso di raffreddamento è inversamente correlato con lo spessore del vetro.

4. Verifica del Mice Durante fredda Adattamento

NOTA: Questo è un protocollo alternativo che consente di testare la piattaforma di vetroe si raffredda, piuttosto che una volta che il piatto si è stabilizzata ei topi hanno completamente adattato per l'ambiente freddo.

  1. Seguire le istruzioni di cui alla sezione 1 per impostare l'apparecchio.
  2. Seguire le istruzioni riportate nella sezione 3 di prendere misurazioni di base a RT (Figura 7A) 2.
  3. Pre-raffreddare le scatole in alluminio con ghiaccio secco.
  4. Una volta latenze ritiro di base sono stati misurati, posizionare le caselle preraffreddato sul piatto circa 1,25 '' di distanza dalle recinzioni su entrambi i lati (Figura 7A, freccia etichettato come "ghiaccio secco ha aggiunto") 2.
  5. Seguire le istruzioni riportate nella sezione 3 di prendere misure come la lastra di vetro si raffredda, le misurazioni il più spesso possibile.

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Risultati

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Le risposte comportamentali indotte da topi a partire da 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, e 12 ° C sono altamente riproducibili (Figura 4A) 20. Per misurare lo stimolo freddo generato sotto il hindpaw, i topi sono stati anestetizzati con ketamina / xilazina / acepromazina cocktail e le zampe sono state fissate sul vetro sulla cima di una termocoppia di tipo T filamento (Figura 4B) 20. Il vetro è stato raffreddato o riscaldato alla gamma di test desiderato. Sebbene la piastr...

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Discussione

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Il CPA può essere utilizzato per valutare la sensibilità al freddo e l'adattamento al freddo nei topi. Fornisce un modo economico ed efficiente per misurare le risposte al freddo in animali acclimatati e non trattenuti in un'ampia varietà di intervalli di temperatura. Fornisce inoltre una risposta comportamentale inequivocabile con una variabile di output facilmente quantificabile e analizzabile. È già stato utilizzato per valutare i cambiamenti nella sensibilità al freddo indotti dall'infiammazione1, dal ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare i contributi dell'intero Gereau Lab per l'editing del manoscritto. Questo lavoro è supportato dai fondi NINDS 1F31NS078852 a DSB e dal fondo NINDS NS42595 a RWG.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sonda a termocoppia di tipo TPhysitempIT-24pUtilizzato per misurare la temperatura superficiale del vetro (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Lastra di vetroAzienda vetraria locale (a St. Louis, Stemmerich Inc)Utilizziamo vetro pyrex (galleggiante borosilicato). Il nostro laboratorio utilizza generalmente 1/4'', ma anche 3/16'' e 1/8'' sono utili
Registratore di dati termiciExtechEA15Termologger per tenere traccia della temperatura del vetro (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
Siringa da 3 mlBD309657La parte superiore viene tagliata e il ghiaccio secco viene compresso nella siringa per generare una sonda fredda
ComputerSe si utilizza il logger Extech, qualsiasi Pcwill funzionerà
Scatole di alluminioUniversity a St. Louis le scatole dell'officinasono lunghe 3 ', larghe 4,5 '' e alte 3 '' con un coperchio sigillato. C'è un foro da 1/2" praticato in un lato corto di ogni scatola, vicino al fondo. Questi fori vengono riempiti con rubinetti di gomma quando le scatole sono riempite con ghiaccio umido o acqua calda.
Circolatore d'acqua riscaldatoVWRQualsiasi modello di circolatore d'acqua con pompa funzionerà
Ago da 21 GBD305165La dimensione esatta dell'ago non è importante
TimerQualsiasi timer manuale funzionerà
SpecchioQualsiasi specchio piatto funzionerà
Washington meccanica manuale

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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