Questo manoscritto descrive l'uso della tecnologia all'avanguardia fornita dai DNA-microarrays. I microarray forniscono una panoramica dei cambiamenti trascrittomici nei batteri che si verificano in una condizione specifica. Inoltre, sottolineiamo la facilità con cui è possibile analizzare grandi quantità di dati utilizzando comodi pacchetti software sviluppati internamente.
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Articolo metodologico
A Pipeline veloce e affidabile per lo studio batterica trascrittoma un'analisi caso: serina-dipendente regolazione genica in
In questo articolo
Sommario
Abstract
Espressione genica e la sua regolazione sono molto importanti per capire il comportamento delle cellule in condizioni diverse. Varie tecniche sono usate oggi per studiare l'espressione genica, ma la maggior parte sono limitati in termini di fornire una visione globale dell'espressione dell'intero trascrittoma. DNA microarrays offrire una tecnologia di ricerca rapida ed economica, che offre una panoramica completa di espressione genica globale e hanno un gran numero di applicazioni, tra cui l'identificazione di nuovi geni e fattori di trascrizione siti, caratterizzazione delle attività trascrizionale di cellule e vincolante anche aiutare ad analizzare migliaia di geni (in un singolo esperimento). In questo studio, sono stati ottimizzati i presupposti per l'analisi del trascrittoma batterica dalla raccolta delle cellule per l'analisi del DNA microarray. Tenendo conto del tempo, i costi e la precisione degli esperimenti, la piattaforma tecnologica si rivela molto utile e universalmente applicabale per studiare transcripto battericames. Qui, eseguiamo analisi del DNA microarray con Streptococcus pneumoniae come caso-studio confrontando le risposte trascrizionali di S. pneumoniae coltivate in presenza di concentrazioni variabili L-serina nel terreno. RNA totale è stato isolato mediante un metodo Macaloid utilizzando un kit di isolamento di RNA e la qualità dell'RNA è stata verificata utilizzando un kit di controllo qualità dell'RNA. cDNA è stato redatto utilizzando trascrittasi inversa e campioni di cDNA sono stati etichettati utilizzando uno dei due coloranti fluorescenti ammine-reattiva. DNA microarray diapositive in casa sono stati utilizzati per l'ibridazione dei campioni di cDNA etichettati e dati di microarray sono stati analizzati utilizzando un framework pre-elaborazione dei dati cDNA microarray (Microprep). Infine, Cyber-T è stato utilizzato per analizzare i dati generati utilizzando Microprep per l'identificazione di statisticamente significative geni differenzialmente espressi. Pacchetti software, inoltre, costruito in-house (pepe, FIVA, divulgare, MINISTERO, Genome2D) sono stati utilizzati per analizzaredati.
Introduzione
Lo studio di tutta la serie di mRNA abbondanza (trascrittoma) codificata dal genoma di un organismo unicellulare o una cellula eucariotica in un momento specifico o in una condizione specifica, tra cui sovraespressione del gene o knock-out, si chiama trascrittomica. Trascrittomica ci permette di osservare in che misura i geni sono espressi in una particolare condizione in un punto di tempo X e ci dà informazioni su come fortemente i geni sono espressi rispetto a un riferimento.
Un microarray è un array bidimensionale su un supporto solido (solitamente un vetrino o silicio cella a film sottile) che può essere utilizzato per saggiare grandi....
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Protocollo
1. Preparazione di Media e Cultura cellulare
- Grow S. pneumoniae D39 ceppo selvatico 21 come descritto in precedenza 11. Inoculare cellule stoccati a -80 ° C in 10% glicerolo (con rapporto di 1/100 in 50 ml provette sterili) in 50 ml chimica definita Medium (CDM) con un pH finale di 6,4 15, ma omettere L-serina dal amminoacido miscela.
Nota: sono stati utilizzati due diversi CDM; uno contenente una concentrazione minima di L-serina (150 mM) e l'altra contenente una concentrazione massima di L-serina (10 mM). Questa concentrazione minima è fondamentalmente la concentrazione di L-serina nel plasm....
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Risultati
RNA, isolamenti e analisi di cDNA
L-serina è uno degli amminoacidi essenziali e la sua concentrazione nel plasma del sangue umano varia 60-150 mM in bambini e adulti. Il suo ruolo nella biosintesi delle purine e pirimidine sottolinea la sua importanza nel metabolismo ed è un precursore di diversi aminoacidi (glicina, cisteina e triptofano). Per studiare l'effetto di L-serina nel complesso trascrittoma di S. pneumoniae D39 ceppo selvatico, analisi microarray del .......
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Discussione
Descriviamo un protocollo di facile uso che può essere applicato per eseguire tutta l'analisi trascrittoma di batteri. Il punto chiave su questa particolare tecnica è che la condizione in cui le cellule vengono raccolte varierà. Dopo la raccolta delle cellule e RNA isolamento, questa tecnica diventa uguale per tutti i tipi di campioni batterici e segue i passi esattamente uguali, pertanto, può essere applicato a qualsiasi tipo di coltura batterica. Il protocollo è molto semplice e conveniente e parte da isolamento d.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Ringraziamo Anne de Jong e Sigieri Holsappel aiuto per la produzione slitta DNA microarray. Il supporto di Anne de Jong per l'analisi bioinformatica è anche apprezzato. Ringraziamo anche Jelle Slager per la revisione della carta. Muhammad Afzal e Irfan Manzoor sono supportati dall'Università GC, Faisalabad, Pakistan nell'ambito del programma di sviluppo della facoltà di HEC Pakistan.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| isolamento dell'RNA | |||
| Perle di | 105015 | ||
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Tecnologie di vita Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Tecnologie di vita Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Tecnologie di vita Invitrogen | ||
| Primo tampone a trefoli | Tecnologie di vita Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac raffreddatore | Eppendorf | RUGNE3140 | concentratore Speedvac più |
| forno di ibridazione | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Caricatore automatico Genpix 4200A1 | analitiche MSD | Scanner per microarray | |
| Bicarbonato di sodio | SigmaAldrich | 104766 |
Riferimenti
- Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
- Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods.
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Ristampe e permessi
