A Pipeline veloce e affidabile per lo studio batterica trascrittoma un'analisi caso: serina-dipendente regolazione genica in Streptococcus pneumoniae

Sommario

Questo manoscritto descrive l'uso della tecnologia all'avanguardia fornita dai DNA-microarrays. I microarray forniscono una panoramica dei cambiamenti trascrittomici nei batteri che si verificano in una condizione specifica. Inoltre, sottolineiamo la facilità con cui è possibile analizzare grandi quantità di dati utilizzando comodi pacchetti software sviluppati internamente.

Abstract

Espressione genica e la sua regolazione sono molto importanti per capire il comportamento delle cellule in condizioni diverse. Varie tecniche sono usate oggi per studiare l'espressione genica, ma la maggior parte sono limitati in termini di fornire una visione globale dell'espressione dell'intero trascrittoma. DNA microarrays offrire una tecnologia di ricerca rapida ed economica, che offre una panoramica completa di espressione genica globale e hanno un gran numero di applicazioni, tra cui l'identificazione di nuovi geni e fattori di trascrizione siti, caratterizzazione delle attività trascrizionale di cellule e vincolante anche aiutare ad analizzare migliaia di geni (in un singolo esperimento). In questo studio, sono stati ottimizzati i presupposti per l'analisi del trascrittoma batterica dalla raccolta delle cellule per l'analisi del DNA microarray. Tenendo conto del tempo, i costi e la precisione degli esperimenti, la piattaforma tecnologica si rivela molto utile e universalmente applicabale per studiare transcripto battericames. Qui, eseguiamo analisi del DNA microarray con Streptococcus pneumoniae come caso-studio confrontando le risposte trascrizionali di S. pneumoniae coltivate in presenza di concentrazioni variabili L-serina nel terreno. RNA totale è stato isolato mediante un metodo Macaloid utilizzando un kit di isolamento di RNA e la qualità dell'RNA è stata verificata utilizzando un kit di controllo qualità dell'RNA. cDNA è stato redatto utilizzando trascrittasi inversa e campioni di cDNA sono stati etichettati utilizzando uno dei due coloranti fluorescenti ammine-reattiva. DNA microarray diapositive in casa sono stati utilizzati per l'ibridazione dei campioni di cDNA etichettati e dati di microarray sono stati analizzati utilizzando un framework pre-elaborazione dei dati cDNA microarray (Microprep). Infine, Cyber-T è stato utilizzato per analizzare i dati generati utilizzando Microprep per l'identificazione di statisticamente significative geni differenzialmente espressi. Pacchetti software, inoltre, costruito in-house (pepe, FIVA, divulgare, MINISTERO, Genome2D) sono stati utilizzati per analizzaredati.

Introduzione

Lo studio di tutta la serie di mRNA abbondanza (trascrittoma) codificata dal genoma di un organismo unicellulare o una cellula eucariotica in un momento specifico o in una condizione specifica, tra cui sovraespressione del gene o knock-out, si chiama trascrittomica. Trascrittomica ci permette di osservare in che misura i geni sono espressi in una particolare condizione in un punto di tempo X e ci dà informazioni su come fortemente i geni sono espressi rispetto a un riferimento.

Un microarray è un array bidimensionale su un supporto solido (solitamente un vetrino o silicio cella a film sottile) che può essere utilizzato per saggiare grandi quantità di materiale biologico utilizzando screening ad alto rendimento, e miniaturizzato, trasformazione multiplex e paralleli e rilevazione metodi. Microarrays sono disponibili in varie tipologie, tra cui DNA microarrays, microarrays della proteina, microarrays peptide, microarray di tessuti, microarrays dell'anticorpo, microarrays cellulari e altri. Un DNA microarray èfondamentalmente un insieme di punti di DNA microscopici fissato ad una superficie solida, di solito vetro. DNA microarray sono utilizzati per misurare i livelli di espressione di un gene o di una serie di geni simultaneamente o di genotipizzare più regioni del genoma ^2,3. Picomoli (10 ^-12 moli) di una sonda sono presenti all'interno di ogni spot DNA che rappresenta una specifica sequenza di DNA, noto anche come reporter. Le molecole di mRNA etichettati dai campioni vengono chiamati gli «obiettivi». Fluorofori sono utilizzati per misurare ibridazione sonda-target e rivelazione di bersagli fluoroforo marcata determina la relativa abbondanza di sequenze di acido nucleico nel target. Un esperimento microarray può compiere più test genetici in parallelo perché un array può contenere decine di migliaia di sonde. Il layout di un esperimento microarray semplice è mostrato in figura 1. Recentemente, è stato stabilito nei nostri laboratori ed altri che queste matrici sono riutilizzabili, il che rende questa tecnica molto conveniente effective.

Diverse tecniche di isolamento di RNA e di depurazione sono stati sviluppati nel corso degli anni, tra cui C-TAB, SDS e metodi GT ^4-8. Inoltre, diversi kit commerciali sono inoltre disponibili. Per l'espressione genica RNA di alta qualità è molto importante. Pertanto, i metodi di isolamento dell'RNA vengono modificati per ottenere una quantità massima di RNA. Allo stesso modo, sono ridotti al minimo i passaggi per la preparazione cDNA e l'etichettatura di cDNA. Normalizzazione dei dati dopo la scansione viene eseguita anche in modo efficiente utilizzando in-house costruita pacchetti e strumenti ⁹ software.

Streptococcus pneumoniae è un patogeno umano Gram-positivi che colonizza il rinofaringe ed è la causa di infezioni multiple come la polmonite, la sepsi, otite media e la meningite ^10. Il batterio può utilizzare un'ampia varietà di nutrienti necessari per la crescita e la sopravvivenza ^11,12. Numerosi studi sono stati effettuati sullametabolismo dell'azoto pneumococco e regolazione sottolineando l'importanza di aminoacidi e il loro ruolo nella virulenza ^13,14. In questo studio, la risposta transcriptomic di S. pneumoniae alle mutevoli concentrazioni di L-serina, un acido abbondantemente presente nel plasma del sangue umano amino, è notificato mediante DNA microarray. La risposta trascrittomica di S. pneumoniae cresciuto in una concentrazione minima di L-serina (150 mM) è stato confrontato con quello coltivato in una concentrazione massima (10 mM) di serina. Mezzo chimicamente definito (CDM o terreno minimo) ¹⁵ è stato utilizzato per questo studio per controllare la concentrazione di serina. Il focus di questo studio è quello di rendere facile da usare questa tecnica e di fornire diversi strumenti per la normalizzazione e l'analisi dei dati. Pertanto, una serie di strumenti sono stati sviluppati per l'analisi e l'interpretazione dei dati. FIVA (Functional Information Viewer e Analyzer) fornisce una piattaforma per il trattamento delle informazioni contenute in gruppi di geni che hannomodelli di espressione genica simili e per la costruzione di profili funzionali ^16. PROCURATORE è un altro pacchetto software che facilita l'individuazione delle funzioni putativi e annotazioni di geni ^17. Facendo uso di metodi di clustering, divulgare fornisce un algoritmo di rilevamento sito DNA di legame. Motivi Cis -regulatory di geni possono essere proiettati usando questo algoritmo ^18. Genome2D offre una piattaforma basata su Windows per la visualizzazione e l'analisi dei dati trascrittoma offrendo diverse gamme di colori per caratterizzare i cambiamenti nei livelli di espressione genica su una mappa del genoma ^19. Il webserver Pepe offre, oltre al metodo di all-in-one di analisi, una serie di strumenti per l'industria mineraria per regulons, promotori e fattore di trascrizione siti di legame ^{di 20.} Annotazione completa delle regioni intergeniche in un genoma batterico può essere ottenuto utilizzando questo pacchetto. I biologi possono trarre grandi vantaggi da pepe quanto offre loro una piattaforma per la progettazione dell'esperimentos in modo che le informazioni ipotizzata può essere confermata in vitro ^20. Questi pacchetti software contribuiscono in modo significativo all'analisi microarray come la maggior parte di loro sono liberamente disponibili e rendere la normalizzazione dei dati e di analisi molto affidabile.

Protocollo

1. Preparazione di Media e Cultura cellulare

1. Grow S. pneumoniae D39 ceppo selvatico ²¹ come descritto in precedenza ^11. Inoculare cellule stoccati a -80 ^{° C} in 10% glicerolo (con rapporto di 1/100 in 50 ml provette sterili) in 50 ml chimica definita Medium (CDM) con un pH finale di 6,4 ^15, ma omettere L-serina dal amminoacido miscela.
   Nota: sono stati utilizzati due diversi CDM; uno contenente una concentrazione minima di L-serina (150 mM) e l'altra contenente una concentrazione massima di L-serina (10 mM). Questa concentrazione minima è fondamentalmente la concentrazione di L-serina nel plasma del sangue umano e l'obiettivo è quello di confrontare l'espressione genica di S. pneumoniae ceppo D39 in queste due condizioni.

2. Isolamento di RNA totale

1. Materiale
   1. Utilizzare fenolo acido, grado RNA per l'isolamento di RNA totale.
   2. Macaloid:
      1. Sospendere 2 grammi dimacaloid in 100 ml TE e far bollire per 5 min. Raffreddare a RT e sonicare fino macaloid gels.Centrifuge la soluzione a 2.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente, risospendere in 50 ml TE pH 8 e conservare a 4 ° C.
   3. Soluzioni:
      1. Trattare tutte le soluzioni con etere pirocarbonato (DEPC). Aggiungere 100 microlitri DEPC / 100 ml di soluzione, incubare O / N a 37 ° C e autoclave per 15 min.
2. Metodologia
   1. Crescere 50 ml di S. coltura cellulare pneumoniae D39 in 50 ml provette a ³⁷ ° C (senza scuotimento) fino a metà fase esponenziale (OD ~ 0,3). Culture centrifugare a 4 ° C su 10.000 × g per 2 minuti. Eliminare i media e congelare immediatamente il pellet di cellule in azoto liquido.
   2. Premix 300 ml di cloroformio: IAA (24: 1) e 300 ml di fenolo (fenolo acido, grado RNA). Utilizzare 500 microlitri della fase organica nel passaggio 2.2.3.
   3. Preparare la seguente miscela in anticipo in tubi con tappo a vite senza RNA: 0.5 G perle di vetro, 50 ml 10% SDS, 500 microlitri fenolo / cloroformio: IAA (come preparato al punto 2.2.2), strato macaloid (150-175 ml, non è esatto in quanto è molto viscoso). Risospendere il pellet di cellule in 400 microlitri TE (DEPC) e aggiungere le cellule risospese nei tubi con tappo a vite.
   4. Per rompere le cellule, posizionare i tubi con tappo a vite in un battitore tallone per impulsi 2x 60 "('omogeneizzare') con 1 min intervallo in ghiaccio. Centrifugare i campioni per 10 min a 10.000 xg (4 ° C).
   5. Trasferire la fase superiore in una nuova provetta, aggiungere 500 microlitri di cloroformio: IAA (24: 1) e centrifugare per 5 min a 10.000 xg (4 ° C).
   6. Trasferire 500 microlitri della fase superiore ai tubi freschi, aggiungere 2 volumi (1 ml) di lisi / tampone di legame e mescolare pipettando su e giù. Isolare RNA totale utilizzando il kit di isolamento dell'RNA e seguire il produttore protocollo raccomandato.

3. RNA Cleanup

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Per rimuovere la contaminazione del DNA da RNA totale, aggiungere 100 microlitri mix DNAseI (buffer DNAse 90 microlitri e 10μl DNAseI) e incubare per 20-30 minuti a 15-25 ºC.

Lavare pulito RNA utilizzando il kit RNAse. Ottenere 50 ml di volume di eluizione.

4. Analisi di RNA

1. Determinare la concentrazione di RNA su uno spettrofotometro. Determinare la qualità di RNA utilizzando un test come segue (Figura 2).
   1. Diluire 1 ml di campione con 50 ml di acqua DEPC per ottenere una concentrazione di 20-200 ng / ml.
   2. Usare 1 ml campione di RNA diluito per verificare la qualità sulla Bioanalyser secondo le istruzioni del produttore.
2. Nota: un rapporto di 23S: 16S di circa 2.0 è considerata buona unità ¹ A260 RNA corrispondente a 40 mg / ml.. Una quantità raccomandata per l'etichettatura è 10-20 mg.

5. cDNA Preparazione ed etichettatura

S copi "> NOTA: Il seguente protocollo è stato seguito per la preparazione e l'etichettatura cDNA.

1. Ricottura
   1. Eseguire reazione ricottura in 300 provette PCR microlitri, mantenendo la concentrazione di RNA totale 10-15 mg per diapositive fatti in casa o 5 mg per le diapositive made-aziendali. Mescolare RNA con 2 nonamers microlitri casuali (1,6 mg / mL) e aggiungere acqua priva di nucleasi se necessario, per mantenere il volume finale della miscela ricottura a 18 ml.
   2. Mantenere la miscela annealing a 70 ° C per 5 min. Dopo di che, raffreddare la miscela a temperatura ambiente per 10 min (annealing) e, se necessario, centrifugare le reazioni al fondo della provetta. Mettere le provette di reazione in ghiaccio per almeno 1 min.
2. Trascrizione inversa
   1. Preparare il mix trascrittasi inversa come segue: a 18 microlitri mix ricottura, aggiungere 12 ml mix Master (composto da 6 microlitri di buffer 5x First Strand, 3 ml 0.1 M DDT, 1,2 ml 25x AA-dUTP / nucleotide mix e 1,8 microlitri inversione transcriptase (1 ml per le diapositive made-aziendali). Tenere il mix di reazione per 2-16 ore a 42 ° C.

6. Degrado di mRNA e Purificazione di cDNA

1. Per degradare il mRNA dalla miscela di reazione, aggiungere 3 ml di 2,5 M NaOH e posto a 37 ° C per circa 15 min. Successivamente, aggiungere 15 ml di 2M Hepes acido libero per neutralizzare il NaOH.
2. Purificare la miscela cDNA utilizzando PCR colonne clean-up e seguire il protocollo del produttore.

7. Misura di cDNA Concentrazione

1. Misurare le concentrazioni di cDNA su uno spettrofotometro. Per continuare con l'etichettatura, verificare che la concentrazione di cDNA è di almeno 60 ng / ml (slides fatte in casa) o 20 ng / ml (slides made-aziendali).

8. Etichettatura del cDNA con Amine-reattiva Dye e Purificazione

1. Utilizzare ammina reattiva tintura per etichettare il cDNA. Direttamente mescolare il cDNA con un'aliquota (5 ml) diammina-reattiva tintura.
2. Incubare la miscela a temperatura ambiente, al buio, per 60 a 90 minuti e procedere direttamente alla purificazione di colorante marcato cDNA. Purificare cDNA dye-marcato utilizzando PCR colonne clean-up e seguendo il protocollo del produttore. Eluire cDNA in 50 ml di tampone di eluizione.

9. Misura di Labelled cDNA

1. Utilizzare uno spettrofotometro per misurare l'incorporazione di coloranti ammina reattiva nel cDNA. Verificare che la concentrazione di coloranti ammina reattiva è almeno 0,5 pmol / ml in un volume totale di 50 microlitri.

10. La miscelazione di Labelled cDNA Campioni

1. Per scivoli fatti in casa, utilizzare tutto il cDNA marcato per l'ibridazione con la differenza di non più del 30% della concentrazione di cDNA. Per diapositive made-aziendali, utilizzare cDNA con non più di 2 volte differenza di concentrazione cDNA.
   Nota: normalmente, è necessaria circa 300 ng di cDNA per le diapositive made-società, che è molto poco rispetto al reqquantità di cDNA uired per diapositive fatti in casa.

11. ibridazione e di lavaggio

1. Utilizzare i seguenti reagenti: acqua demineralizzata, etanolo 99%, TIMIDO Buffer (fatta in casa, con 40 microlitri lievito RNA). Preparare massimo 1 ml di SHY.
2. Apparecchiatura e soluzioni di preparazione
   1. Accendere concentratori di vuoto e di riscaldamento di almeno 1 ora prima dell'essiccazione. Accendere ibridazione del forno, con set point impostato alla temperatura di ibridazione corretta (per S. pneumoniae DNA microarray, utilizzare 45 ° C). Allo stesso modo, preriscaldare cassette ibridazione e forno per 30-60 minuti.
   2. Preriscaldare tampone SHY a 68 ° C per almeno 30 minuti.
3. Preparazione del campione (contrassegnato cDNA)
   1. Combinare uguali quantità di cDNAs etichettati (max differenza 30%). Essiccare il campione usando i concentratori sotto vuoto ad alta temperatura (circa 40 min.) Fino a che il volume è inferiore a 7 microlitri.
4. Lifter-slip
   1. Utilizzare pulite sollevatore-scivola.Nota: ± 30 ml possono essere caricati sulla diapositiva.
   2. Pulire il sollevatore-scivola con sapone, un sacco di acqua di rubinetto e il 100% di etanolo. Nota: scivola sollevatore sporchi danno fondo elevato.
   3. Asciugare il sollevatore-scivola con pistola ad aria compressa per soffiare via le particelle di polvere. Posizionare un pulito sollevatore-scivolo sulla trasparenza con il rivestimento in teflon bianco ai lati rivolti verso il basso.
5. L'aggiunta di tampone di ibridazione (per l'etichetta cDNA)
   1. Sciogliere i campioni essiccati colorante in 7 ml H ₂ O e incubare a 94 ° C per 2 min.
   2. Immediatamente, aggiungere 35 microlitri preriscaldato tampone SHY (68 ° C), mescolare delicatamente e girare alla massima velocità per 1 minuto per sbarazzarsi di precipitati. Preriscaldare la sonda a 68 ° C per circa 5 minuti fino a quando il carico.
6. Slide-sollevatore-slip assemblaggio e preriscaldamento.
   1. Collocare il supporto per ibridazione di diapositive su un calore-blocco a 50 ° C. Collocare i vetrini microarray DNA con il sollevatore-scivolo sul supporto ibridazione diapositive riscaldata e priscaldare il vetrino con sollevatore-scivolo per un minuto. Eseguire i passi successivi il più rapidamente possibile.
   2. Aggiungere 40 ml di destinazione campione alla fine della diapositiva. Consentire il passaggio del fluido tra le superfici di vetro con la forza capillare. Eseguire tutte pipettaggio lentamente e con attenzione.
   3. Tenere i vetrini con sollevatore-slip orizzontale in ogni momento e muoversi lentamente per assicurarsi che il sollevatore antiscivolo non si mosse.
   4. Prendere la cassetta ibridazione preriscaldata dal forno ibridazione e chiudere la macchina. Luogo filtro di carta imbevuto con 3 ml 2x SSC (citrato salina standard) nel cassetto ibridazione.
   5. Posizionare delicatamente il supporto per diapositive ibridazione con scivoli nel cassetto ibridazione. Chiudere la cassetta ibridazione e mettere in forno di ibridazione di nuovo (per circa 16-18 ore).
7. Lavaggio diapositive
   1. Preparare freschi di lavaggio-buffers I, II e III (750 ml per la fase di lavaggio). Per 500 ml di wash-buffer di I, usare 2 x SSC / 0.5% SDS. Per 500 ml di wash-appassionatoer II, utilizzare 1 x SSC / 0,25% SDS. Per 500 ml lavare-buffer III, utilizzare 1 x SSC / 0.1% SDS (optional)
   2. Posizionare i lavatoi buffer a 30 ° C (per essere sicuri SDS è sciolto).
   3. Immergere i vetrini più rapidamente possibile, ma molto lentamente, in un tubo Falcon riempito con 50 ml di tampone di lavaggio I finché il vetro poggia sul fondo conico del tubo.
   4. Dopo pochi secondi, quando i lavandini sollevatore scivolamento sul fondo della provetta, estrarre il vetrino con le pinzette senza graffiare la matrice e mettono nel rack della stazione di lavaggio. Continuare con il lavaggio senza intervallo di tempo.
   5. Lavare i vetrini per 5 min in 500 ml lavare-buffer I (in una stazione di lavaggio). Dategli un secondo lavaggio per 20-30 minuti a 500 ml lavare-buffer II (in una stazione di lavaggio). Analogamente, lavare i vetrini per 5 min in 500 ml lavare-buffer III (opzionale) (in una stazione di lavaggio).
   6. Asciugare le diapositive per 2 min a 2.000 giri.

12. Microarray Analysis

1. Scansione di immaginicon rispettive lunghezze d'onda in scanner e salvarli in una cartella "Giove Progetto".
2. Utilizzare software per analizzare i file scansionati inizialmente come descritto in precedenza 22. Dopo l'esecuzione di questo software, selezionare la scheda "Apri immagine" per caricare il file di immagine rosso (-.550) come "Red" e file di immagine verde (-.635) come "Green". Carica il file gal (.gal) con lista di array S. pneumoniae il file di immagine selezionando "Load List Array" scheda 22.
   Nota: questa lista di array composto da 48 reti, in ogni griglia c'erano 16 righe e 15 colonne. Ogni posto in griglia rappresenta un singolo gene e informazioni posto compreso il nome del gene viene aggiunto attraverso un file di descrizione spot. I numeri piatte sono dati da sinistra a destra e dall'alto verso il basso.
3. Dopo individuare accuratamente le griglie, selezionare la scheda "Trova Array, Trova blocchi, Allinea Funzioni" per allineare i punti. Dopo l'allineamento di tutte le funzioni, analizzare l'immagine selezionando l'opzione "Analisi" tab. Creare un nuovo file con i risultati, istogramma e diagramma a dispersione. Salvare il file dalla scheda "Salva risultati come" come file .gpr per ulteriori analisi.
4. Eseguire un'ulteriore normalizzazione e l'elaborazione dei dati con sviluppato in-house software Microprep descritti ^9.
5. Utilizzare repliche biologiche indipendenti per dati microarray DNA che sono dye-swap. Eseguire implementazione CyberT di una variante di t-test1 e calcolare i tassi di scoperta di falsi (FDR), come descritto ^9.
6. Per geni differenzialmente espressi, prendere p <0,001 e FDR <0.05 come standard.
7. Carica DNA microarray dati sulla pagina di presentazione NCBI per ottenere un GEO (Gene Expression Omnibus) numero di accesso.

Risultati

RNA, isolamenti e analisi di cDNA

L-serina è uno degli amminoacidi essenziali e la sua concentrazione nel plasma del sangue umano varia 60-150 mM in bambini e adulti. Il suo ruolo nella biosintesi delle purine e pirimidine sottolinea la sua importanza nel metabolismo ed è un precursore di diversi aminoacidi (glicina, cisteina e triptofano). Per studiare l'effetto di L-serina nel complesso trascrittoma di S. pneumoniae D39 ceppo selvatico, analisi microarray del cepp...

Discussione

Descriviamo un protocollo di facile uso che può essere applicato per eseguire tutta l'analisi trascrittoma di batteri. Il punto chiave su questa particolare tecnica è che la condizione in cui le cellule vengono raccolte varierà. Dopo la raccolta delle cellule e RNA isolamento, questa tecnica diventa uguale per tutti i tipi di campioni batterici e segue i passi esattamente uguali, pertanto, può essere applicato a qualsiasi tipo di coltura batterica. Il protocollo è molto semplice e conveniente e parte da isolamento d...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
isolamento dell'RNA
Perle di		105015
IAA		106630
Nanodrop	Nanodrop	ND-100
Agilent BioAnalyser	Agilent	G2940CA
Superscript III	Tecnologie di vita Invitrogen	18080044
AA-dUTP	Tecnologie di vita Invitrogen	AM8439
DDT	Tecnologie di vita Invitrogen
Primo tampone a trefoli	Tecnologie di vita Invitrogen	18080044
NaOH	SigmaAldrich	S8045-1KG
HEPES	SigmaAldrich	H4034-500G
DyLight-550	Thermoscientiffic	62262
DyLight-650	Thermoscientiffic	62265
SHY Buffer	SigmaAldrich	H7033-125ML
Speedvac raffreddatore	Eppendorf	RUGNE3140	concentratore Speedvac più
forno di ibridazione	Grant Boekel	Iso-20
Lifter-slips	Erie Scientific	25x60I-M-5439
Wipe	KIMTECH
SDS	SigmaAldrich	L3771-100g
SSC	SigmaAldrich	W302600-1KG-K
Caricatore automatico Genpix 4200A1		analitiche MSD	Scanner per microarray
Bicarbonato di sodio	SigmaAldrich	104766