Presentiamo un metodo per l'analisi elettroretinografica (ERG) delle larve di zebrafish utilizzando tecniche di micromanipolazione ed elettroretinografia. Questo è un metodo semplice e diretto per saggiare la funzione visiva delle larve di zebrafish in vivo.
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Articolo metodologico
Analisi elettroretinogramma della risposta visiva in Zebrafish larve
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'elettroretinogramma (ERG) è un metodo non invasivo per determinare elettrofisiologico funzione retinica. Attraverso il posizionamento di un elettrodo sulla superficie della cornea, attività elettrica generata in risposta alla luce può essere misurato e utilizzato per valutare l'attività di cellule retiniche in vivo. Questo manoscritto descrive l'uso della ERG per misurare la funzione visiva in zebrafish. Zebrafish sono stati a lungo utilizzato come modello per lo sviluppo vertebrato a causa della facilità di soppressione genica mediante oligonucleotidi morfolino e manipolazione farmacologica. A 5-10 dpf, solo coni sono funzionali nella retina larvale. Pertanto, il zebrafish, a differenza di altri animali, è un potente sistema modello per lo studio della funzione visiva cono in vivo. Questo protocollo utilizza l'anestesia standard micromanipolazione e protocolli stereomicroscopia che sono comuni nei laboratori che eseguono la ricerca zebrafish. I metodi di cui fanno uso di eq elettrofisiologia normaAZIONE e una telecamera a bassa luce per guidare il posizionamento della microelettrodo di registrazione sulla cornea larvale. Infine, si dimostra come un disponibile in commercio ERG stimolatore / registratore originariamente progettato per l'uso con i topi possono essere facilmente adattato per l'uso con zebrafish. ERG di zebrafish larvale fornisce un metodo eccellente per saggiare cono funzione visiva in animali che sono stati modificati da morpholino iniezione oligonucleotide nonché nuove tecniche di ingegneria del genoma come zinco Finger nucleasi (ZFNs), Trascrizione Activator-Like Effector nucleasi (Talens), e cluster regolarmente intervallate brevi palindromo Ripete (CRISPR) / Cas9, i quali hanno notevolmente aumentato l'efficienza e l'efficacia del gene targeting in zebrafish. Inoltre, abbiamo approfittato della capacità di agenti farmacologici di penetrare larve zebrafish per valutare le componenti molecolari che contribuiscono alla fotorisposta. Questo protocollo delinea una configurazione che può essere modificato e utilizzato dai ricercatoricon diversi obiettivi sperimentali.
Introduzione
L'elettroretinogramma (ERG) è un metodo elettrofisiologico invasivo che è stato ampiamente utilizzato in clinica per determinare la funzione della retina nell'uomo. L'attività elettrica in risposta ad uno stimolo luce viene misurata ponendo elettrodi di registrazione sulla superficie esterna della cornea. Le caratteristiche del paradigma stimolo e la forma d'onda di risposta definiscono i neuroni retinici contribuiscono alla risposta. Questo metodo è stato adattato per l'uso con un certo numero di modelli animali tra cui topi e zebrafish. La tipica risposta vertebrati ERG ha quattro componenti principali: l'a-onda, che è un potenziale cornea-n....
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Protocollo
Mantenimento degli animali e protocolli sperimentali sono stati approvati dalla cura e utilizzo dei Comitati animali istituzionale della University of North Carolina a Chapel Hill, e soddisfano tutte le esigenze dell'Ufficio NIH di laboratorio Animal Welfare e l'Associazione per la valutazione e l'accreditamento del laboratorio Animal Care International.
NOTA: Per ottenere le larve di analisi ERG, pubblicato protocolli per la zootecnia zebrafish norma e manutenzione sono stati impiegati 18. Le larve sono ottenuti attraverso l'allevamento naturale e ospitato sotto una luce 14 ore / 10 ore ciclo scuro. Questo protocollo è stato ottimizzato per le larve in ....
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Risultati
Tipicamente, ERG sono registrati da larve di zebrafish a 5 dpf, dal momento che un certo numero di studi hanno pubblicato le registrazioni ERG in questa fase 9, 16,20. Risposte larvali sono stati misurati in condizioni di oscurità adattato senza retroilluminazione utilizzando uno stimolo 20 msec di luce LED bianca. Abbiamo utilizzato un sistema di ERG disponibile in commercio costituito da uno stimolatore luce Ganzfeld e computer di controller / registratore. Lo stimolatore utilizza un sistema di modulazione .......
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Discussione
In questo protocollo una procedura semplice per ERG registrazioni di zebrafish larvale è dettagliata. Questa procedura consente una analisi rapida e completa di function.There visiva sono diversi passaggi critici della procedura che dovrebbe essere tenuto in considerazione. Le larve zebrafish deve essere in buona salute prima dell'esperimento per evitare la morte durante i potenziali trattamenti farmacologici e garantire il sostentamento prolungata durante le registrazioni ERG. Inoltre, è importante che le larve uti.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo i membri dell'impianto di acquacoltura UNC Zebrafish per la manutenzione del pesce zebra. Vorremmo anche ringraziare Diagnosys, LLC per l'assistenza con la configurazione dell'apparato ERG. Ulteriori ringraziamenti vanno alla dottoressa Portia McCoy e al laboratorio del dottor Ben Philpot per l'assistenza con i metodi elettrofisiologici. Desideriamo anche ringraziare Lizzy Griffiths per la sua illustrazione di una larva di pesce zebra. Questo lavoro è stato sostenuto dai premi F32 EY022279 del National Institutes of Health (a J.D.C) e R21 EY019758 (a E.R.W).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Gabbia di Faraday | 80/20 Inc | "Set di erettori industriali" in alluminio progettato su misura per la struttura della gabbia | |
| Spugna PVA | Amazon | B000ZOWG1C | Fornisce una piattaforma morbida e umida per il posizionamento di larve di pesce zebra Sistemi di |
| filtraggio sterili da 150 ml | Corning | 431154 | Soluzioni filtranti per evitare che piccole articolazioni blocchino le micropipette |
| Espion E2 | Sistema | modulare di elettrofisiologia in grado di generare stimoli visivi per qualsiasi stimolatore e registrazione e analisi digitale delle risposte utilizzando software proprietario, maggiori informazioni su | |
| Colordome | Diagnosys, LLC | contact | Stimolatore di luce con LED RGB e sorgenti luminose allo xeno per Ganzfeld ERG, maggiori informazioni su http://www.diagnosysllc.com http://www.diagnosysllc.com |
| Micromanipolatore | Drummond | 3-000-024-R | Mantenimento e posizionamento del microelettrodo di registrazione |
| Supporto ad anello magnetico | Drummond | 3-000-025-MB | Mantenimento e posizionamento della telecamera e dell'elettrodo di riferimento |
| Prolunghe dei cavi | Grass Technologies | F-LX | Cavi di ricambio da femmina a maschio da 1,5 mm per il collegamento degli elettrodi |
| Pin maschio a femmina Adattatore SAFELEAD Grass | Technologies | DF-215/10 | Collegamento di perni da 2 mm a perni da 1,5 per testiera |
| Telaio della zanzariera della finestra (metallo) e scanalatura | Lowes o Home Depot | vari | Per il fissaggio di una rete di rame alla struttura della gabbia di Faraday |
| Filtri Steriflip da 50 ml | SCGP00525 Millipore | Soluzioni filtranti per evitare che piccole articolazioni blocchino le micropipette | |
| Adattatore BNC | Monoprice | 4127 | Collegamento della telecamera al cavo BNC |
| Cavo BNC | Monoprice | 626 | Collegamento della telecamera all'adattatore video |
| Obiettivo della telecamera | Navitar | 1582232 | Visualizzazione del posizionamento del microelettrodo di registrazione sulla cornea larvale |
| Accoppiatore della telecamera | Navitar | 1501149 | Visualizzazione del posizionamento del microelettrodo di registrazione sulla cornea larvale |
| Luna Convertitore BNC a VGA + HDMI | Sewell | SW-29297-PRO | Adattatore da BNC a VGA che consente la proiezione dell'immagine della telecamera sul monitor del computer |
| APB | Sigma | A1910 | Agonista mGluR6, blocca l'onda b che consente l'analisi del potenziale del recettore di massa del cono isolato |
| Vetro borosilicato | Sutter | BF-150-86-10 | Vetro borosilicato lucidato a fuoco (temperatura di metling = 821° C) con filamento e dimensioni di 1,5 mm x 0,86 mm (diametro esterno per diametro interno) |
| P97 Estrattore fiammante/marrone | Sutter | P97 | Per il traino di micropipette in vetro Foglio |
| di sorbotano | Thorlabs | SB12A | Polimero uretanico viscoelastico sintetico, posizionato sotto i supporti di isolamento passivo e la piattaforma ERG per assorbire gli urti e prevenire lo scivolamento, può essere tagliato a misura |
| Breadboard | Thorlabs | B2436F | Piattaforma di isolamento dalle vibrazioni per stimolatore ERG e campione |
| di zebrafishSupporti di isolamento passivo | Thorlabs | PWA074 | Fornisce isolamento dalle vibrazioni alla breadboard |
| Rete di rame | TWP | 022X022C0150W36T | Per la linea Pompa per pipette a gabbia di Faraday |
| VWR | 53502-233 | Utilizzata con le pipette Pasteur per trasferire con cura le larve di pesce zebra | |
| Pipette | Pasteur VWR | 14672-608 | Utilizzata con la pompa per pipette per trasferire con cura le larve di pesce zebra |
| Telecamera | Watec | WAT-902B | Visualizzazione del posizionamento del microelettrodo di registrazione sulla cornea larvale |
| Tricaina (MS-222) | Western Chemical | Tricaine-S | Anestetico di grado farmaceutico,Micro-fil |
| WPI | MF28G-5 | Supporto per microelettrodo di riempimento e vetro per microelettrodo | |
| WPI | MEH2SW15 | Contiene il microelettrodo di vetro, si collega all'apparecchiatura ERG | |
| Elettrodo di riferimento | WPI | DRIREF-5SH | Rompere con cautela l'ultimo centimetro dell'involucro per drenare l'elettrolita ed esporre l'elettrodo a pellet Ag/AgCl sinterizzato |
| Elettrodo di riferimento (alternativo) | WPI | EP1 | Alternativa a DRIREF-5SH. Elettrodo Ag/AgCl che deve essere collegato/saldato al cavo di collegamento |
| Cavo a bassa rumorosità per supporto per microelettrodo | WPI | 13620 | Collegamento del supporto per microelettrodo di registrazione all'adattatore/testiera |
Riferimenti
- Dowling, J. E. The retina: an approachable part of the brain. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1987).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J Neurosci. Methods. 135, ....
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Ristampe e permessi
