Abbiamo sviluppato un modello in vitro di dormienza nel midollo osseo per cellule di cancro al seno sensibili agli estrogeni. L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare l'uso del modello per lo studio della biologia molecolare e cellulare della dormienza e per la generazione di ipotesi per successivi test in vivo.
Lo studio della dormienza del cancro al seno nel midollo osseo è un'impresa eccezionalmente difficile a causa della complessità delle interazioni delle cellule dormienti con il loro microambiente, la loro rarità e l'eccessivo eccesso di cellule ematopoietiche. A tal fine, abbiamo sviluppato un modello clonogenico 2D in vitro della dormienza di cellule di carcinoma mammario sensibili agli estrogeni nel midollo osseo. Il modello è costituito da alcuni elementi chiave necessari per la dormienza. Questi includono 1) l'uso di cellule di carcinoma mammario sensibili agli estrogeni, che sono il tipo che probabilmente rimane dormiente per periodi prolungati, 2) incubazione di cellule a densità clonogenica, in cui l'interazione strutturale di ciascuna cellula è principalmente con il substrato, 3) fibronectina, un elemento strutturale chiave del midollo e 4) FGF-2, un fattore di crescita abbondantemente sintetizzato dalle cellule stromali del midollo osseo e fortemente depositato nella matrice extracellulare. Le cellule incubate con FGF-2 formano cloni dormienti dopo 6 giorni, che consistono di 12 o meno cellule che hanno un aspetto piatto distinto, sono significativamente più grandi e più sparse rispetto alle cellule in crescita e hanno un ampio rapporto citoplasma/nucleo. Al contrario, le cellule incubate senza FGF-2 formano principalmente colonie in crescita costituite da >30 cellule relativamente piccole. Le perturbazioni del sistema con anticorpi, inibitori, peptidi o acidi nucleici il giorno 3 dopo l'incubazione possono influenzare significativamente vari aspetti fenotipici e molecolari delle cellule dormienti a 6 giorni e possono essere utilizzate per valutare il ruolo di molecole, fattori o vie di segnalazione localizzate nella membrana o nella sopravvivenza delle cellule dormienti. Pur riconoscendo la natura in vitro del test, può funzionare come uno strumento molto utile per raccogliere informazioni significative sui meccanismi molecolari necessari per l'insediamento e la sopravvivenza delle cellule dormienti. Questi dati possono essere utilizzati per generare ipotesi da testare in modelli in vivo.
Le cellule tumorali del seno metastatizzano al midollo osseo prima che la malattia è rilevabile 1, non appena i piccoli tumori si sviluppano vasi sanguigni 2,3. Il processo metastatico è rapido ma inefficiente. Le cellule entrano i nuovi vasi sanguigni rapidamente a milioni al giorno 4 ma pochi sopravvivono il viaggio in organi distanti 5. Tuttavia, alcuni sopravvivono micrometastasi nel midollo e può essere trovato come cellule singole o piccoli grumi di cellule in aspirati di midollo osseo da pazienti di nuova diagnosi 1. Queste cellule resistono chemioterapia adiuvante, che viene somministrato per lo scopo di ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
1. clonogenica
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Gli esperimenti sono stati condotti per ricapitolare il test. L'andamento temporale dell'esperimento è mostrato in Figura 2A. Le cellule vengono incubate a densità clonogenica giorno -1, si aggiunge FGF-2 in un mezzo fresco al giorno 0 e le cellule sono coltivate fino al giorno 6, quando sono macchiati e le colonie sono contate. Eventuali perturbazioni al sistema vengono somministrati il giorno 3 in 100 volumi microlitri a 10x concentrazioni finali desiderato. Figura 2B mo.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Il nostro modello è composto da diversi elementi chiave della dormienza nel midollo osseo. Consiste di estrogeni cellule sensibili, che sono del tipo destinato a rimanere sospeso nel osseo per prolungati periodi 10, si compone di fibronectina, un elemento strutturale chiave del midollo, FGF-2, un fattore di crescita abbondantemente sintetizzato dal stroma del midollo osseo e pesantemente depositato nella matrice extracellulare del midollo osseo 31,32 e l'incubazione delle cellule con densità de.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Supportato dal Dipartimento della Difesa Grants DAMD17-01-C-0343 e DAMD17-03-1-0524, la Commissione di Stato del New Jersey su Cancer Research 02-1140-CCR-E0 e Ruth Estrin Goldberg Memorial per la Ricerca sul Cancro (RW)
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Celle MCF-7 | Celle ATCC | HTB-22 | |
| T47D | ATCC | HTB-123 | |
| BD BioCoat Fibronectin 24 pozzetti Clear Flat Bottom Piastra multipozzetto trattata | con TC Corning | 354411 | |
| BD BioCoat Fibronectina 60 mm Piastre | di coltura Corning | 354403 | |
| BD BioCoat Fibronectina 100 mm Piastre di coltura | Corning | 354451 | |
| BD BioCoat 22x22mm #1 Vetrino coprioggetti con applicazione uniforme di fibronectina umana | Piastra per | 354088 | |
| 6 pozzetti | CellTreat | 229106 | |
| Dulbecco Modified Eagle Glucosio medio-alto 10X Polvere | Corning Life Sciences | 50-013-PB | |
| Siero fetale bovino inattivato al calore | Fonte di siero internazionale | FB02-500HI | |
| 0,25% tripsina/2,21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Soluzione di penicillina-streptomicina, 100X | Corning | 30-002-CI | |
| L-glutammina, 100x, | Corning | 25-005-CI | |
| FGF umano ricombinante R | & base D Systems | 234-FSE-025 | |
| Inibitore Akt (1L6-idrossimetil-chiro-inositolo-2-(R)-2-O-metil-3-O-ottadecil-sn-glicerocarbonato) | CalBiochem | 124005 | |
| LY294002 | CalBiochem | 19-142 | Chenical PI3K inibitore |
| C3 transferasi | Il citoscheletro | CTO3 | inibisce RhoA, RhoB e RhoC, ma non le GTPasi correlate come Cdc42 o Rac1 |
| Y-27632 dicloridrato. | Santa Cruz Biotechnology | 129830-28-2 | |
| BODIPY FL-fallacidina (verde) | Sonde molecolari | B607 | Fluorocromo per colorazione fibrillare actina |
| BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (rosso) | Sonde molecolari | R415 | Fluorocromo per colorazione fibrillare actina |
| Alexa Fluor 488 Asino anticorpo IgG di topo, reagente ReadyProbes | Sonde molecolari | R37114 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant con DAPI | Sonde molecolari | P-36931 |
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
Richiedi permesso