Articolo metodologico

Un poco costoso, test comportamentale scalabile per la misurazione etanolo sedazione sensibilità e tolleranza Rapid in

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DOI:

10.3791/52676

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15 aprile 2015

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1Department of Human and Molecular Genetics, Virginia Commonwealth University, 2VCU Alcohol Research Center, Virginia Commonwealth University

In questo articolo

Sommario

Semplici saggi per misurare la sensibilità all'etanolo e la rapida tolleranza in Drosophila facilitano l'uso di questo organismo modello per studiare questi importanti comportamenti correlati all'etanolo. Qui viene descritto un test relativamente semplice e scalabile per misurare la sensibilità all'etanolo e la rapida tolleranza nei moscerini.

Abstract

L'uso di alcol disturbo (AUD) è una sfida di salute gravi. Nonostante una grande componente ereditaria per AUD, pochi geni sono stati inequivocabilmente implicati nella loro eziologia. Il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è un modello potente per esplorare i meccanismi molecolari alla base genetica comportamenti alcol-correlati e detiene quindi una grande promessa per l'identificazione e la comprensione della funzione dei geni che influenzano AUD. L'uso del modello Drosophila per questi tipi di studi dipende dalla disponibilità di saggi che misurano affidabile risposte comportamentali a etanolo. Questo rapporto descrive un test adatto per valutare la sensibilità etanolo e tolleranza rapida in mosche. Etanolo sensibilità misurata in questo saggio è influenzata dal volume e la concentrazione di etanolo utilizzato, una varietà di manipolazioni genetiche precedentemente riportati, e anche la lunghezza di tempo in linea sono alloggiati senza cibo immediatamente prima del test. Al contrario, etanolo sensitivity misurata in questo dosaggio non è influenzato dal vigore di movimentazione mosca, sesso in linea, e la supplementazione di mezzo di crescita con antibiotici o lieviti vivi. Tre metodi diversi per quantificazione sensibilità etanolo sono descritte, tutto conduce a risultati sostanzialmente indistinguibili sensibilità etanolo. La natura scalabile di questo test, in combinazione con la sua semplicità complessiva di set-up e relativamente a basso costo, lo rendono adatto per l'analisi piccola e grande scala genetica della sensibilità etanolo e tolleranza rapida in Drosophila.

Introduzione

L'uso di alcol disturbo (AUD) è un problema di salute enorme in tutto il mondo (rivisto in 1). Sebbene i meccanismi di guida lo sviluppo di AUD sono complesse, questi disturbi hanno una notevole componente genetica (ad esempio, 2). La grande ereditabilità di AUD e le risposte comportamentali conservati in etanolo in molte specie (recensito in 3,4) hanno generato un forte interesse ad utilizzare organismi modello genetici per studiare il coinvolgimento di specifici geni nei comportamenti etanolo legate verso una migliore comprensione delle basi molecolari di AUD. Il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è emerso come organismo modello principale per esplorare i meccanismi molecolari-genetica dei comportamenti etanolo correlati (recensito in 3,4). Studi in mosche hanno evidenziato i ruoli per diverse vie di segnalazione nelle risposte comportamentali a etanolo (recensito in 5). Curiosamente, alcuni dei geni e dei percorsi che influenzare respons comportamentalies a etanolo in linea sono stati implicati in roditori comportamenti etanolo correlati e / o AUD umana (ad esempio, 6-14). La conservazione di meccanismi di guida comportamenti etanolo legate tra le specie, insieme con la suite di strumenti genetici disponibili nel sistema modello Drosophila, sottolineano l'utilità del modello di mosca della frutta per studiare la genetica di risposte comportamentali a etanolo.

Sensibilità 15,16 e tolleranza (rivisto in 17) di etanolo negli esseri umani è legato allo sviluppo di AUD. Entrambe queste risposte comportamentali a etanolo può essere modellato in linea attraverso una serie di test di laboratorio (rivisto in 3,4). Tutti i saggi mosca noti gli autori sono basati su uno dipendente dal tempo etanolo-indotta sedazione / incoordinazione o di recupero in funzione del tempo da etanolo sedazione.

In un precedente articolo dal nostro gruppo sulla genetica della sensibilità etanolo e rtolleranza APID in Drosophila, un test comportamentale basato su etanolo sedazione vapore indotta di mosche è stato utilizzato 18. Test in questo test è stato avviato con il trasferimento dal vivo adulti vola senza anestesia svuotare fiale alimentari, intrappolando le mosche nelle fiale con una spina di acetato di cellulosa, aggiungendo etanolo verso l'alto (cioè, lato non volo) del tappo di acetato di cellulosa, e sigillare la fiala contenente mosche, spina acetato di cellulosa e di etanolo con un tappo di silicone (vedi schema in Figura S3, riferimento 18). Più fiale che rappresentano diversi gruppi di mosche sono state valutate in parallelo, aumentando la velocità di questo test. Fiale sono stati dati un codice anonimo e sperimentatori sono stati accecati per gruppo di trattamento per prevenire la distorsione intenzionale nella valutazione della sedazione. In un esperimento standard mosche in fiale erano picchiettare leggermente ad intervalli di 6 min e, dopo un recupero di 30 secondi, il numero di mosche sedati in ogni flacone è stato contato e converted per cento mosche attivi. Mosche assorbiti vapori di etanolo dal tappo di acetato di cellulosa in modo dipendente dal tempo, causando un aumento progressivo in etanolo interno 18 e sedazione (riferimento cf 18 e Figure 1A e 1B in questo rapporto). La sedazione in questo test è stato operativamente definita come mosche (i) in piedi in assenza di camminare o (ii) che giace sulla schiena, con o senza sbattere le ali. Qui, questo dosaggio etanolo sedazione è descritta in dettaglio, ulteriore ottimizzazione operativa che riguardano l'uso è previsto, e il test viene utilizzato per indirizzare il contributo delle opzioni integrazione alimentare sulla sensibilità fly sedazione.

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Protocollo

1. Giorno Prima Assay

  1. Raccogliere mosche in fiale alimenti freschi in gruppi di 11 (sesso unico) in breve (1-5 minuti) CO 2.
  2. Consentire mosche di recuperare O / N in fiale alimentari in uno spazio ambiente controllato (tipicamente 25 ° C, 60% umidità relativa, 12 hr luce / buio ciclo).
  3. Preparare la soluzione di etanolo (s) diluendo puro (100%) di etanolo in purificato (≥18 MW) di acqua a concentrazione finale (s) appropriato per l'esperimento previsto. Lasciare la soluzione (s) per tornare alla RT O / N.
    Nota: La diluizione di etanolo è esotermica.

2. Giornata di test

  1. Per ogni flacone di mosche da testare, preparare (i) un ambiente pulito, vuoto alimentare flacone; Per esempio, il test flacone, (ii) un nuovo plug acetato di cellulosa, (iii) un tappo silicone e (iv) 1 ml di soluzione di etanolo (vedi Tabella 3).
  2. Preparare sala prove regolando la temperatura a 20-25 ° C e umidità relativa al 55-65%.
  3. Hanno un altro lavoratoreassegnare un codice univoco a ciascun gruppo di flaconi e registrare il codice per dopo. Posizionare fiale codificati con le mosche in sala prove per ambientarsi per pochi minuti.
  4. Etichetta fiale test vuoti per abbinare i codici di fiale vola da 2.3.
  5. Costruire un registro test cartaceo inserendo i codici in colonne (una colonna / flaconcino) in un foglio di calcolo simile alla Tabella 1.
  6. Utilizzo del registro di test come una guida, organizzare fiale alimentari codificati con mosche e fiale di test vuoti in corrispondenza array in sala prove.
    Nota: Un ragionevole numero massimo di fiale di test è 24 (cioè, 6 set di 4 flaconcini ciascuna).
  7. Trasferimento vola da flaconcini alimentari in abbinati / etichettati fiale test vuoto e inserire immediatamente spine in acetato di cellulosa in fiale di prova fino a quando le spine di acetato di cellulosa sono 2 cm sotto le cime delle fiale.
  8. Hereafter, gestire ogni fila di quattro fiale come insieme ad sfalsati min intervalli di 1.
  9. Per la valutazione tempo 0, cogliere ogni flaconcino individualmente with pollice e l'indice, toccare delicatamente sul tavolo tre volte per battere mosche al fondo della fiala, attendere 30 sec e poi contare il numero di mosche che sono immobili / morti. Registrare il numero di mosche immobili / morte per ogni flacone al tempo 0 min nel registro test cartaceo.
  10. Inizia timer conteggio continuamente al tempo 0 e iniziare immediatamente aggiungendo 1 ml di etanolo a tappi acetato di cellulosa in fiale per la prima riga / set di 4 fiale. Aggiungere 1 ml di etanolo per i tappi di acetato di cellulosa in fiale a intervalli di 5 sec nell'ordine in cui saranno testati. Aggiungere etanolo per i tappi di acetato di cellulosa in un movimento circolare in modo che l'etanolo viene assorbita in modo uniforme in tutto i tappi di acetato di cellulosa. Quando l'etanolo è stato aggiunto a tutti i 4 flaconcini di test nel set, inserire un tappo di silicone in ogni fiala per sigillarlo.
  11. A volte 1, 2, 3, 4 e 5 min, aggiungere 1 ml di etanolo al secondo, terzo, quarto, quinto e sesto set di 4 flaconcini, rispettivamente. Continuare inserendo tappi in silicone dopoaggiungendo etanolo per ciascun set di 4 fiale.
  12. Al momento 6 min, testare la prima serie di 4 flaconi afferrando ogni flacone con il pollice e l'indice, picchiettando delicatamente sul tavolo tre volte per battere mosche al fondo del flacone, in attesa 30 sec e poi contare e registrare il numero totale di mosche che sono sedati. Score vola come sedato se (i) stanno sul pavimento del flacone, ma non camminano o (ii) si trovano sulla schiena, con o senza sbattere le ali.
  13. Maneggiare ogni flacone all'interno del set ad intervalli di 5 sec utilizzando il programma in tabella 2.
  14. A volte 7, 8, 9, 10 e 11 min, testare il secondo, terzo, quarto, quinto e sesto set di fiale, rispettivamente, come fatto per la prima serie.
  15. Al tempo 12 min, testare la prima serie di 4 provette nuovamente come descritto in 2.12 e continuare il test secondo, terzo, quarto, quinto e sesto serie di flaconi a 13, 14, 15, 16 e 17 minuti, rispettivamente.
  16. Continuare mosche test come descritto in 2.12 fino a quando tutte le mosche sono sedated.
  17. Inserire il numero totale di mosche in ogni fiala nel registro test cartaceo. Censore mosche immobile / morti al tempo 0 dal numero totale di mosche.
  18. Calcolare i cento mosche attivi ad ogni valutazione di time-point e dati plot come% mosche attivi (asse y) in funzione del tempo (asse x). Quantificare etanolo sedazione interpolando sedazione Tempo 50 valori (ST50, tempo al 50% sedazione) dal terzo ordine curva polinomiale o sigmoidale adatta o calcolare l'area sotto la curva.
  19. Compilare i dati provenienti da flaconi decodificati e effettuare analisi statistiche (ad esempio, una via ANOVA con Bonferroni test di confronto multiplo), secondo il disegno sperimentale.

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Risultati

I dati grezzi di questa analisi etanolo sedazione sono i numeri di mosche che vengono sedati in funzione del tempo di esposizione al vapore etanolo. I dati grezzi sono convertiti in linea attivi cento in funzione del tempo (dati primario, figure 1A, B, D - F). La sensibilità all'etanolo sedazione dai dati primari può essere quantificata come sedazione Tempo 50 (ST50), il tempo necessario per il 50% di mosche per diventare sedato o aea sotto la curva (AUC), via interpolazione curva a...

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Discussione

Test semplice che riproducibile quantificare fenotipi significativi sono di grande valore per l'analisi del comportamento. Il lavoro qui descritto affronta diversi aspetti pratici di un test per misurare la sensibilità etanolo sedazione e tolleranza rapida in Drosophila. Sebbene non sia un obiettivo di questo lavoro, analisi comportamentali sono facilitate mantenendo l'ambiente e lo sfondo costante genetico per soggetti di prova all'interno di uno studio. Inoltre, i confronti dovrebbero generalmente...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questi studi sono stati supportati da sovvenzioni del National Institutes of Health, National Institute for Alcoholism and Alcohol Abuse a M.G. (P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537). Gli autori ringraziano Jill Bettinger per le utili discussioni e Jacqueline DeLoyht per l'assistenza tecnica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
fiale per alimentiVWR89092-772stretto
FlugsGenesee/flystuff.com49-102
tappo in siliconeFisher Scientific09-704-1l#4
etanoloPharmaco-Aaper111000200200 proof
stretto

Riferimenti

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