Qui vi presentiamo un protocollo che descrive ossigenato ex situ macchina di perfusione di fegati donatore. Questo articolo contiene un passo per passo protocollo di procurarsi e preparare il trapianto di fegato per la macchina di perfusione, preparare il liquido di perfusione, primo la macchina di perfusione ed eseguire ossigenato normotermica macchina perfusione del trapianto di fegato.
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Articolo metodologico
Ex Situ normotermica macchina di perfusione di Vivi donatori
In questo articolo
Sommario
Abstract
In contrasto con conservazione a freddo statico convenzionale (0-4 ° C), ex situ perfusione macchina può fornire una migliore conservazione di fegati di donatori. Perfusione continua degli organi offre l'opportunità di migliorare la qualità di organi e permette ex valutazione della vitalità economica situ di fegati donatori prima del trapianto. Questo articolo video fornisce un passo per passo protocollo per ex situ perfusione macchina normotermica (37 ° C) di fegati di donatori umani utilizzando un dispositivo che fornisce una pressione e temperatura controllate pulsatile perfusione dell'arteria epatica e perfusione continua della vena porta. Il liquido di perfusione viene ossigenata da due ossigenatori a membrana a fibre cave e la temperatura può essere regolata tra 10 ° C e 37 ° C. Durante la perfusione, l'attività metabolica del fegato così come il grado di lesione può essere valutata mediante analisi biochimica dei campioni prelevati dal liquido di perfusione. Perfusione macchina è uno strumento molto promettenteper aumentare il numero di fegati che sono adatti per il trapianto.
Introduzione
L'attuale metodo di conservazione dell'organo nel trapianto di fegato è a filo con e successivo stoccaggio di fegatini di donatori a freddo (0-4 ° C) del liquido di conservazione (come ad esempio l'Università di Wisconsin soluzione o la soluzione Istidina-triptofano-chetoglutarato). Questo metodo è denominato frigoconservazione statica (SCS). Sebbene il tasso metabolico di fegati a 0-4 ° C è molto basso, vi è ancora richiesta per / min / g di tessuto epatico 0,27 mmol ossigeno, che non possono essere forniti durante SCS 1. Il metodo convenzionale di SCS, quindi, si traduce in un certo grado di (ulteriore) lesione di fegatini di donatori. Anche se questa quantità di lesioni conservazione non è un problema nel fegato del donatore di buona qualità, può diventare un fattore critico e limitante fegati non ottimali che hanno già subito un certo grado di lesione del donatore. Per questo motivo, fegatini con una qualità non ottimale o cosiddetti criteri esteso donatore (ECD) fegati sono spesso respinte per il trapianto come il rischio of fallimento precoce innesto viene considerato troppo alto. Alti tassi di funzione in ritardo trapianto, non funzione primaria, e stenosi biliari non anastomotiche (NAS) sono stati descritti nei riceventi di fegati da donazione dopo la morte circolatorio (DCD), i donatori di età superiore o destinatari di innesti steatosico 2. NAS sono una delle principali cause di morbilità e mortalità dopo trapianto di fegato. NAS può verificarsi in entrambi i dotti biliari extra-donatore e intraepatiche e può essere accompagnata da intraduttale fango biliare e la formazione di fusione 3,4. Sebbene l'eziologia di NAS è pensato per essere multifattoriale, danno da ischemia / riperfusione dei dotti biliari durante la conservazione del trapianto e trapianto è stato identificato come uno dei principali sottostante meccanismo di 2,5. Il trapianto di un innesto DCD è stato identificato come uno dei più forti fattori di rischio per lo sviluppo di NAS. La combinazione di un periodo di ischemia calda in un donatore DCD, ischemia fredda durante la conservazione di organi, e successiva riperfusionelesioni nel ricevente è pensato per essere responsabile per lesione irreversibile delle vie biliari, che, in combinazione con una scarsa capacità rigenerativa dei dotti biliari, provoca cicatrici fibrotica e restringimento delle vie biliari dopo trapianto di fegato 2,5. NAS sono stati segnalati nel 30% dei pazienti che hanno ricevuto un fegato DCD 6-8. È ormai chiaro che l'attuale metodo di SCS di fegati per il trapianto non è sufficiente per preinjured fegati ECD come quelli da donatori DCD. Metodi alternativi sono necessari per aumentare e ottimizzare l'utilizzo di fegati ECD per il trapianto.
Macchina perfusione (MP) è un metodo di conservazione di organi che possono fornire una migliore conservazione di organi, rispetto a SCS. MP potrebbe essere particolarmente rilevante per la conservazione di innesti ECD. Un importante vantaggio di MP è la possibilità di fornire l'ossigeno per l'innesto durante il periodo di conservazione. MP può essere eseguita a varie temperature,che sono stati classificati come ipotermico (0-10 ° C), subnormothermic (10-36 ° C) e normotermica (36-37 ° C) MP (NMP). A seconda della temperatura utilizzata per MP, il tipo di liquido di perfusione deve essere regolata e con l'aumentare della temperatura più ossigeno deve essere fornito. La prima applicazione clinica di MP nel trapianto di fegato umano è stato basato sulla perfusione ipotermica senza l'ossigenazione attiva del 9,10 liquido di perfusione. In modelli animali, ipotermia MP ossigenata (0-10 ° C) ha dimostrato di avere effetti protettivi contro l'ischemia / riperfusione del fegato innesti 11 e per fornire una migliore conservazione del plesso vascolare peribiliare della bile condotti 12. Subnormothermic ossigenato MP a 20 ° C o 30 ° C è stato anche studiato in modelli animali e ha dimostrato di fornire prima il recupero della funzione del trapianto di fegati DCD, rispetto a SCS 13,14. La fattibilità di subnormothermic MP ossigenato di fegato umano è stata recdipendentemente riportato in una serie di sette fegati donatori umani scartati 15. NMP (37 ° C), permette la valutazione della fattibilità del trapianto e la funzionalità prima del trapianto 16,17. Inoltre, MP consente graduale rewarming dell'innesto epatica prima del trapianto, che è stato dimostrato per facilitare il recupero e rianimazione dell'innesto 18.
Il dispositivo perfusione utilizzato nel protocollo corrente epatica perfusione macchina consente dual perfusione (attraverso la vena porta e l'arteria epatica) utilizzando due pompe centrifughe, che forniscono un continuo flusso portale e un flusso pulsatile arteriosa. Il sistema è a pressione controllata, permettendo autoregolazione del flusso attraverso il fegato, a seconda della resistenza intraepatica. Due cavi ossigenatori a membrana fibra consentono l'ossigenazione del trapianto di fegato, come pure per la rimozione di CO 2. La temperatura può essere impostata in base al tipo previsto di MP (temperat minima ure di 10 ° C). Portata, pressione e temperatura vengono visualizzati sul dispositivo in tempo reale consentendo un controllo continuo del processo di perfusione. Un nuovo set monouso sterile tubi, serbatoio e ossigenatori è disponibile per la perfusione di ogni innesto (figura 1).
Lo scopo di questo articolo il video è quello di fornire un passo per passo protocollo per ex situ macchina normotermica perfusione di fegati di donatori umani che utilizzano questa macchina di perfusione epatica di nuova concezione.
Figura 1: (A) Un disegno schematico, (B) una foto della macchina perfusione, (C) una vista ravvicinata della ossigenatore, e (D) pompa centrifuga usata per la perfusione normotermica di fegati di donatori umani.ottenere = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Protocollo
Questo protocollo è stato approvato dal Comitato Etico Medico (Medisch Ethische Toetsingscommissie) del University Medical Center di Groningen, Paesi Bassi.
1. Preparazione del liquido di perfusione
Nota: Il volume totale del fluido di perfusione preparato per normotermica perfusione macchina secondo questo protocollo è 2.233 ml e l'osmolarità mirata del liquido di perfusione è 302 mOsmol / L.
- Dai componenti del liquido di perfusione descritto in Tabella 1, mantenere le umane imballato globuli rossi, plasma congelato fresco e albumina umana separati. Mescolare il resto dei componenti in modo sterile e conservare la soluzione in un sacchetto sterile per il trasporto in sala operatoria (OR). Fate questo in un ambiente sterile (idealmente una buona struttura Manufacturing Practice) o in una cappa a flusso laminare in una stanza della cultura.
| Componenti | Quantità |
| Globuli rossi concentrati (ematocrito 60%) | 840 ml |
| Il plasma fresco congelato | 930 ml |
| L'albumina umana 200 g / L (Albuman, Sanquin) | 100 ml |
| Modificata la nutrizione parenterale (Clinimix N17G35E, Baxter International Inc.) | 7.35 ml |
| Multivitaminici per infusione (Cernevit, Baxter International Inc.) | 7 ml |
| Oligoelementi concentrati per infusione (Nutritrace, B. Braun Melsungen AG) | 7.35 ml |
| Metronidazol per somministrazione endovenosa (5 mg / ml) (Flagyl, Sanofi-Aventis) | 40 ml |
| Cefazolina 1.000 mg pallone da 5 ml polvere per somministrazione endovenosa (Servazolin, Sandoz) | 2 ml |
| L'insulina ad azione rapida (100 UI / ml) (Actrapid®, Novo Nordisk) | 20 ml |
| Glubionate calcio, soluzione endovenosa 10%, 137,5 mg / ml (Sandoz) | 40 ml |
| H 2 O sterile | 51.3 ml |
| NaCl soluzione 0,9% | 160 ml |
| Il bicarbonato di sodio soluzione 8,4% | 31 ml |
| Eparina 5.000 IE / ml per la somministrazione intravenosa | 4 ml |
| Totale | 2.233 ml |
Tabella 1: Components della perfusione fluido 16.
- Trasferimento umana globuli rossi (840 ml), plasma congelato fresco (930 ml), albumina umana 200 g / L (100 ml) e la soluzione preparata al punto 1.1 al, o somministrato al dispositivo perfusione.
2. Adescamento del dispositivo di perfusione
- Aggiungere i componenti del liquido di perfusione, compresi gli umani imballato globuli rossi, plasma fresco congelato, albumina umana e la soluzione preparata al punto 1.1 alla macchina tramite il connettore sopra le ossigenatori e rimuovere tutte le bolle d'aria dal tubo.
- Accendere la pompa venosa e seguire le istruzioni del produttore sullo schermo. Quindi, accendere la pompa arteriosa e seguire le istruzioni del produttore sullo schermo.
- Nulla la misuratori di pressione contro la pressione atmosferica seguendo le istruzioni sullo schermo. Questo assicura che la pressione misurata durante le perfusione è la pressione reale a livello della vena porta e l'arteria epatica.
- Avviare l'ossigenazione utilizzando CarboGen (95% O 2 + 5% CO 2) ad una portata di 4 l / min. Il flusso d'aria sarà diviso tra i due ossigenatori (2 L / min per ossigenatore) e questo dovrebbe portare a un pO 2 di circa 60 kPa (o 450 mmHg) nel liquido di perfusione. Per perfusioni più lunghi, è consigliabile utilizzare sorgenti separate di ossigeno e anidride carbonica. Ciò consente piccoli aggiustamenti del rapporto O 2 / CO 2, che possono essere utilizzati per regolare il pH e pCO 2 del liquido di perfusione.
- Prendere un campione per la misurazione della perfusione emogasanalisi 15-20 min dopo che il dispositivo è stato innescato e controllare il pH e elettroliti conseguenza.
NOTA: assicurarsi di eliminare circa 3 ml di liquido di perfusione prima di prendere dei campioni, in quanto questo fluido è nel tubo periferico e non rappresenta il fluido di perfusione nel sistema. Aggiungi un 8,4% di bicarbonato di sodio sOLUZIONE per potere tampone, l'obiettivo di un pH fisiologico (7,35-7,45). Ad esempio, aggiungere 25-35 ml di una soluzione di bicarbonato di sodio 8,4% e controllare i livelli di pH e bicarbonato nel liquido di perfusione prendendo campioni per la misurazione del gas di sangue ad intervalli regolari.
3. Appalti e preparazione di Vivi donatori
Nota: Procurare dell'organo utilizzando la tecnica standard di raffreddamento in situ e lavare con liquido di conservazione fredda (0-4 ° C) 19. Per facilitare incannulamento dell'arteria, lasciare un segmento dell'aorta supratruncal attaccato alla arteria epatica (Figura 2A).
- Lavare le vie biliari con il fluido di conservazione (cioè, University of Wisconsin soluzione). Legare il dotto cistico con una sutura chirurgica.
- Imballare e conservare l'organo in un sacchetto di donatore di organi sterili di serie e box con ghiaccio tritato per il successivo trasporto al centro di MP.
- Iniziola procedura tavolo indietro immediatamente all'arrivo del fegato donatore in sala operatoria.
- Prendete un campione di almeno 10 ml di liquido di conservazione per i test microbiologici.
- Rimuovere gli allegati diaframmatica all'area nuda del fegato così come qualsiasi muscolo cardiaco restante dal gambetto della vena cava con forbici chirurgiche.
- Staccare l'arteria e vena porta con le forbici dissezione e rami laterali legare con suture chirurgiche o hemoclips.
- Chiudere l'estremità distale del segmento dell'aorta supratruncal usando una sutura non assorbibile monofilamento (ad esempio, 3-0 Prolene). Inserire la cannula arteriosa nell'estremità prossimale dell'aorta supratruncal e fissare con suture (Figura 2A). Utilizzare la cannula fornito nella confezione monouso come fornito dal produttore del dispositivo di perfusione.
- Inserire la cannula venosa nella vena porta e fissare con punti di sutura. Utilizzare la cannula fornite nelle disposPacchetto grado. La vena epatica rimane uncannulated.
- Lavare il dotto biliare con la soluzione di conservazione. Inserire un catetere di silicone nel dotto biliare e fissare con punti di sutura.
NOTA: Non inserire il catetere troppo in profondità nel dotto biliare in quanto ciò potrebbe causare lesioni dell'epitelio biliare. - Lavare il fegato con 0,9% NaCl tramite la cannula vena porta come segue:
- Se l'innesto è stato conservato in University of Wisconsin soluzione come soluzione di conservazione, risciacquare il fegato con 2.000 ml di freddo (C 0-4 °) 0,9% NaCl seguita da 500 ml di caldo (37 ° C) 0,9% di NaCl soluzione.
- Se l'innesto è stato conservato in soluzione Istidina-triptofano-chetoglutarato come la soluzione di conservazione, scovare il fegato con 1.000 ml di freddo (0-4 ° C) 0,9% NaCl seguiti da 500 ml di caldo (37 ° C) 0,9 soluzione NaCl%. Lo scopo del filo caldo è per evitare un calo significativo della temperaturaliquido di perfusione.
- Eseguire immediatamente il colore caldo prima di collegare il fegato per il dispositivo di perfusione.
NOTA: Tenere sempre la durata tra filo caldo e l'inizio di NMP meno di 1-2 minuti.
| Caratteristiche del donatore (N = 12) | Numero (%) o medio (IQR) |
| Età (anni) | 61 (50-64) |
| Genere maschile) | 8 (67%) |
| Tipo di donatore DCD, Maastricht Tipo III DBD | 10 (83%) 2 (17%) |
| Indice di massa corporea (BMI) | 27 (25-35) |
| Motivo del rifiuto DCD + età> 60 anni DCD + alto indice di massa corporea DCD + vari motivi * Grave steatosi | 5 (41%) 3 (25%) 2 (17%) /> 2 (17%) |
| Soluzione di conservazione Soluzione UW Soluzione HTK | 6 (50%) 6 (50%) |
| Donatori tempo di ischemia calda a DCD (min) | 14 (17-20) |
| Tempo di ischemia a freddo (min) | 389 (458-585) |
| Indice di rischio dei donatori (DRI) | 2,35 (2,01-2,54) |
Tabella 2: donatori caratteristiche * storia del donatore di abuso di droghe per via endovenosa per un trapianto e donatore prolungata SO 2 <30% dopo la sospensione del supporto vitale per un altro trapianto.. Abbreviazioni: DCD, donazione dopo la morte circolatorio; DBD, donazione dopo la morte cerebrale; UW, Università del Wisconsin; HTK, istidina-triptofano-chetoglutarato
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Figura 2: (A) le immagini di un innesto donatore umano che è stato preparato sul tavolo posteriore e (B - D) è stata successivamente perfuso normothermically. (A) La cannula arteriosa viene inserito nell'aorta surpratruncal e la cannula venosa viene inserito nella vena porta. Il dotto biliare è cannulata con un catetere biliare silicio. (B) Il fegato è posizionato nella camera di organo con la superficie anteriore rivolta verso il basso e cannule sono collegati ai tubi del dispositivo di perfusione. (C) 30 min dopo l'inizio della perfusione normotermico macchina. (D) 6 ore dopo l'inizio della perfusione normotermico macchina. Durante il funzionamento la camera organo è coperto da un coperchio trasparente per mantenere un ambiente umido sterile per il fegato (non mostrato in queste immagini)."> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
4. normotermica macchina di perfusione
- Posizionare il fegato nella camera organo con la superficie anteriore rivolta verso il basso. Collegare immediatamente il fegato al dispositivo perfusione primed collegando la cannula vena al tubo afflusso portale del dispositivo perfusione e la cannula arteriosa al tubo flusso arterioso del dispositivo.
- Inizia perfusione su entrambi i lati del portale e arteriosa seguendo le istruzioni del produttore sullo schermo. Impostare la pressione arteriosa media a 70 mmHg e la pressione venosa portale medio a 11 mmHg.
- Dai campioni di liquido di perfusione ogni 30 minuti per l'analisi immediata dei parametri di gas nel sangue (pO 2, pCO 2, SO 2, HCO 2 - e pH) e parametri biochimici (glucosio, calcio, lattato, potassio e sodio) utilizzando un analizzatore di gas del sangue convenzionali . Assicuratevi di scartare circa 3 ml di perfusionefluido prima di prendere i campioni, come questo fluido è nel tubo periferico e non rappresenta il fluido di perfusione nel sistema.
- Per prendere questi campioni aspirare il liquido di perfusione utilizzando una siringa da 1 ml dai connettori di campionamento che fanno parte del set di tubi monouso del dispositivo perfusione. Per ogni campione utilizzare una nuova siringa e immediatamente rimuovere eventuali bolle d'aria dalla siringa su aspirazione del liquido di perfusione. Quindi inserire la siringa nel analizzatore di gas di sangue e seguire le istruzioni del produttore riportate nel manuale dell'analizzatore.
- Raccogliere il plasma dal liquido di perfusione, congelare e conservare a -80 ° C per la determinazione della fosfatasi alcalina (ALKP), gamma-glutamil transferasi (gamma-GT), alanina aminotransferasi (ALT), urea e bilirubina totale. Raccogliere plasma dopo 5 minuti di centrifugazione del liquido di perfusione a 1.500 xg e 4 ° C.
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Risultati
12 fegati umani che sono stati declinati per il trapianto a causa di vari motivi sono stati utilizzati dopo aver ottenuto il consenso informato per la ricerca provenienti da famiglie di donatori. Caratteristiche donatori sono descritte in Tabella 2. I fegati di donatori umani sono stati perfusi normothermically per 6 ore utilizzando il protocollo descritto in questo documento. La qualità dei fegati sono stati valutati attraverso il monitoraggio omogeneità macroscopica della perfusione del fegato
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Discussione
Questo video offre un passo per passo protocollo per normotermica macchina di perfusione di fegatini di donatori umani utilizzando un dispositivo che consente a pressione controllata a doppio perfusione attraverso la arteria epatica e vena porta. Seguendo questo protocollo, guasti tecnici della macchina di perfusione non si è verificato e tutti gli innesti sono stati ben perfuso e ben ossigenato. I situ perfuso fegati ex avevano emodinamica stabile ed erano metabolicamente attiva, come definito dalla p...
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Dichiarazioni
Gli autori di questo manoscritto non hanno alcun conflitto di interessi di rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro di ricerca è stato sostenuto finanziariamente da sovvenzioni fornite da Innovatief Actieprogramma Groningen (IAG-3), Jan de Cock Kornelis Stichting e Tekke Huizingafonds, tutto nei Paesi Bassi. Siamo grati a tutti i coordinatori di trapianto olandesi per identificare i potenziali scartato fegatini e ottenere il consenso informato.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Assistenza epatica | Assistenza d'organo OA | . Li.Li.140 | Dispositivo di perfusione |
| Liver Assist confezione monouso | Organ Assist | OA. Li.DP.540 | Set monouso e cannule |
| Meredith No.8 | Vygon Nederlands B.V. | 1362082 | Cannula del dotto biliare |
| Albumina umana 200 g/L / ALBUMAN | Sanquin | 15522598 | 100 ml |
| Nutrizione parenterale modificata | Baxter Nederland B.V. | N14G30E | 7,35 ml |
| Multivitaminici per infusione / CERNEVIT | Baxter International Inc. | 9800927 | 7 μ l |
| Oligoelementi concentrati per infusione / NUTRITRACE | B. Braun Melsungen AG | 14811332 | 7,35 ml |
| Metronidazolo 5 mg/ml | Baxter Nederland B.V. | 98181882 | 40 ml |
| di Cefazolina / SERVAZOLIN | Sandoz B.V. | 15611337 | 2 ml |
| insulina ad azione rapida | 20 ml | ||
| di glucoinato di calcio, soluzione endovenosa 10%, 137,5 mg/ml | Sandoz 97038695 | 40 ml | |
| sterile H2O | Fresenius Kabi Nederland B.V. | 98084453 | 51,3 ml |
| NaCl 0,9% | Baxter Nederland B.V. | 15262510 | 160 ml |
| di eparina 5.000 IE/ml per somministrazione endovenosa | LEO Pharma B.V. | 98026178 | 4 ml |
| Bicarbonato di sodio 8,4% | B. Braun Melsungen AG | 97973874 | La quantità dipende dal pH |
| Globuli rossi concentrati (in SAGM) | Banca del sangue (Sanquin) | N0012000 | 750 ml |
| Plasma fresco congelato | Banca del sangue (Sanquin) | N04030A0/N04030B0 | 900 ml |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
