Isolamento di cellule mononucleate dal Sistema Nervoso Centrale di ratti con EAE

Sommario

In questo video ci mostrano come isolare le cellule mononucleate del sistema nervoso centrale di topi con encefalomielite autoimmune sperimentale.

Abstract

Se lo studio di una malattia autoimmune rivolta al sistema nervoso centrale (CNS), come encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE, 1), o la risposta immunitaria ad un'infezione del sistema nervoso centrale, come ad esempio la poliomielite, Lyme neuroborreliosi, o neurosifilide, è spesso necessario isolare il CNS-infiltrazione delle cellule immunitarie.

In questo video-protocollo dimostriamo come isolare le cellule mononucleate (MNC), dal sistema nervoso centrale di un topo con EAE. Il primo passo di questa procedura richiede un perfusione cardiaca del roditore con una soluzione salina per garantire che nessun sangue rimane nei vasi sanguigni irrigazione del sistema nervoso centrale. Ogni contaminazione sangue aumentare artificialmente il numero di apparente SNC infiltrazione multinazionali e può modificare la composizione apparente del sistema immunitario infiltrarsi. Abbiamo poi dimostrare come rimuovere il cervello e il midollo spinale del ratto per dilaceration successive per preparare un cella singola sospensione. Questa sospensione è separato su un doppio strato gradiente Percoll per isolare il multinazionali. Dopo il lavaggio, queste cellule sono poi pronti a sottoporsi a qualsiasi procedura richiesta.

Cellule mononucleate isolate utilizzando questa procedura è realizzabile e può essere utilizzato per elettrofisiologia, citometria a flusso (FACS), o biochimica. Se la tecnica viene eseguita in condizioni sterili (utilizzando strumenti sterili in una cappa di coltura di tessuti), le cellule possono essere coltivate in terreni di coltura. Una popolazione di cellule dato può essere ulteriormente purificato utilizzando le procedure di separazione magnetica o una FACS.

Protocollo

1. Profondamente anestetizzare ratti. Spruzzare con il 70% di etanolo e fare una perfusione cardiaca con PBS per 10 minuti per rimuovere le cellule dai vasi sanguigni (taglio atri destro e profumato attraverso il ventricolo sinistro).
2. Togliere il cervello e il midollo spinale e posto in una provetta da 50 ml contenente ghiacciata PBS. Tagliare il cervello e il midollo spinale in un colino cella di 70 millimetri collocati in un piatto da 10 cm di Petri contenente 10 ml di PBS ghiacciata. Premere ogni pezzo di organo attraverso il filtro delle cellule utilizzando il retro di una sterile uno stantuffo della siringa ml. Raccogliere la sospensione singola cella in una provetta da 50 ml su ghiaccio. Lavare le cellule con PBS colino e aggiungere al tubo fino a quando la soluzione è limpida.
3. Centrifugare per 8-10 minuti a 390 g.
4. Risospendere le cellule in 20 ml di Percoll PBS + 30% e sovrapposizione su 10 ml di Percoll PBS + 70%.
5. Centrifugare a 390 g per 20 minuti a temperatura ambiente.
6. Togliere il grasso sulla parte superiore del tubo. Raccogliere le cellule dall'interfaccia e lavare due volte con PBS. Conte.

Discussione

Questa procedura, come tutte le procedure che coinvolgono gli animali vivi, devono essere approvati da un uso animale vostra istituzione e sul comitato per la cura. Si consiglia un veterinario o un tecnico veterinario essere presente quando si esegue la perfusione cardiaca prima per assicurare un sufficiente livello di anestesia viene data l'animale prima e durante la procedura, e che gli animali non sottoposti a inutili sofferenze o angoscia.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
PBS, 1x, sterile	Reagente	GIBCO, by Life Technologies	14190-250
Filtro cellulare, 70 µm	Strumento	Fisher Scientific	08-771-2
Percoll	Reagente	Sigma-Aldrich	P1644