Attivazione microglia e microgliosis sono risposte chiave per neurodegenerazione cronica. Qui vi presentiamo i metodi per in vivo, la visualizzazione a lungo termine della retina CX3CR1-GFP + cellule microgliali di oftalmoscopia confocale, e per la soglia e le analisi morfometrica per identificare e quantificare la loro attivazione. Monitoriamo modifiche microgliali durante fasi iniziali di glaucoma all'età.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
In Vivo Dynamics of Retinal microglia attivazione durante neurodegenerazione: confocale oftalmoscopico Imaging e Morfometria cellulare in mouse Glaucoma
In questo articolo
Sommario
Abstract
Microglia, che sono le cellule del sistema nervoso centrale neuroimmune residenti, trasformano la loro morfologia e le dimensioni in risposta al danno del sistema nervoso centrale, il passaggio ad uno stato attivato con funzioni distinte e profili di espressione genica. I ruoli di attivazione della microglia in salute, infortuni e malattie rimangono completamente sconosciuto a causa della loro regolazione dinamica e complessa, in risposta ai cambiamenti nel loro microambiente. Pertanto, è fondamentale per monitorare in modo non invasivo e analizzare i cambiamenti nella attivazione della microglia nel tempo nell'organismo intatto. Studi in vivo di attivazione della microglia sono stati ritardati da limitazioni tecniche per rilevare il comportamento del microglia senza alterare l'ambiente del sistema nervoso centrale. Questo è stato particolarmente impegnativo durante la neurodegenerazione cronica, in cui i cambiamenti a lungo termine devono essere monitorati. La retina, un organo CNS suscettibili di non invasivo immagini dal vivo, offre un potente sistema di visualizzare e caratterizzare le dinamiche di attivazione della microglia durante disturbi cronici.
in vivo della microglia retina, con l'oftalmoscopia confocale (cSLO) e CX3CR1 GFP topi / + giornalista, di visualizzare microglia con risoluzione di cellulare. Inoltre, si descrivono i metodi per quantificare variazioni mensili attivazione delle cellule e la densità in grandi sottopopolazioni di cellule (200-300 cellule per retina). Confermiamo l'uso della superficie Somal come metrica utile per il monitoraggio in tempo reale di attivazione della microglia nella retina applicando automatizzato basato soglia analisi morfometrica delle immagini in vivo. Usiamo questi acquisizione delle immagini in tempo reale e analisi strategie per monitorare i cambiamenti dinamici nella attivazione della microglia e microgliosis durante le prime fasi di neurodegenerazione retinica in un modello murino di glaucoma cronico. Questo approccio dovrebbe essere utile per indagare i contributi di microglia al declino neuronale e assonale nei disturbi cronici del sistema nervoso centrale che colpiscono la retina e del nervo ottico.
Introduzione
Microglia sono cellule neuroimmune che risiedono esclusivamente nel sistema nervoso centrale (SNC) dall'inizio dello sviluppo embrionale e per tutta l'età adulta. Dotato di un repertorio complesso di recettori, l'attività della microglia e l'eterogeneità regionale sono regolate dalla loro interazione bidirezionale con i neuroni vicini, glia, barriera emato-encefalica e infiltranti cellule neuroinfiammatori 1,2. Funzioni microgliali basali contribuiscono alla manutenzione e riparazione fisiologica, in quanto campione del loro territorio per perturbazioni nella omeostasi 3,4. Durante lesioni del SNC o malattia, microglia sono i pri....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
In vivo l'imaging viene eseguito in strutture esenti da organismi patogeni utilizzando protocolli approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso l'Università dello Utah.
NOTA: Questo protocollo di imaging viene utilizzato per topi reporter in cui microglia retina e infiltranti monociti / macrofagi esprimono verde fluorescente proteina (GFP) sotto il controllo del locus recettore fractalkine (CX3CR1).
1. In Vivo Imaging di retina GFP + Microglia da confocale a scansione laser oftalmoscopia (cSLO)
- Accendere il sistema di riscaldamento controllato di acqua, set per sta....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
I nostri recenti studi in vivo utilizzati questi metodi di acquisizione di immagini e di analisi in tempo reale di visualizzare e monitorare la cinetica e modelli di ONH e cambiamenti microgliali retina durante le prime fasi di glaucoma cronico e il loro rapporto alla fine di neurodegenerazione 59. Qui illustriamo un protocollo di acquisizione delle immagini cSLO per visualizzare cellule microgliali in una vasta area della retina centrale di singoli giovani eterozigoti CX3CR1-GFP DBA / 2J retina
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Monitoraggio in tempo reale del numero di cellule microgliali e l'attivazione morfologica durante una malattia neurodegenerativa richiede l'uso di metodi di imaging non invasive che consentono la visualizzazione dettagliata delle funzioni cellulari. Dopo l'imaging, le cellule microgliali devono essere isolati (segmentato) per l'analisi morfometrica utilizzando più passaggi di soglia per valutare le dimensioni Somal e / o la complessità di processo come letture per l'attivazione della microglia. In qu.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Scientific Computing and Imaging Institute dell'Università dello Utah per l'utilizzo del software FluoRender (R01GM09815). Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Glaucoma Research Foundation, della Melsa M. e Frank Theodore Barr Foundation e del National Institute of Health degli Stati Uniti (R01EY020878 e R01EY023621) a M.L.V. e (R01EY017182 e R01EY017950) a B.K.A.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Topi DBA/2J e CX3CR1-GFP/+ I topi | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 000671 e 00582 | sono allevati in casa, introducendo nuovi riproduttori ogni 3 - 4 generazioni per prevenire la deriva genetica. |
| 30½ Ago G e 1 ml di siringa tubercolina slip-tip | BD, East Rutherford, NJ | 305106 e 309659 | |
| 2,2,2-tribromoetanolo, alcol terz-amilico 99% e tampone fosfato compresse saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T48402, 152463 e P4417 | La soluzione di avertin (pH 7,3, filtrata sterile) deve essere una soluzione appena preparata o conservata a 4 ° C per un massimo di 1 settimana. |
| Terapia del calore T/Pump | Gaymar Industries, Orchard Park, NY | TP-650 | |
| Applicatori con punta in cotone | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 23-400-100 | |
| Tropicamide 1% | Bausch & Lomb, Rochester, NY | NDC 24208-585-64 | |
| Lenti a contatto in PMMA, curva base 1,70, diametro totale 3,2 mm, spessore centrale 0,40 mm | Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, Regno Unito | G003709 | Le lenti vengono risciacquate con PBS sterile e conservate in scatole di polipropilene. |
| HRA/Spectralis laser a scansione confocale oftalmoscopio e software Eye Explorer | Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA | Versione 1.7.1.0 | |
| PowerPoint | Microsoft, Redmond, WA | Versione 14.4.3 | |
| Adobe Photoshop | Adobe, San Jose, CA | Versione CS3 | |
| FluoRender | Scientific Computing and Imaging Institute, Università dello Utah | Versione 2.13 | Gratuito. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html |
| NIS-Elements C | Nikon, Melville, NY | Versione 4.30.01 |
Riferimenti
- Hanisch, U. K. Functional diversity of microglia - how heterogeneous are they to begin with. Front. Cell. Neurosci. 7 (65), 1-18 (2013).
- Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
- Davalos, D., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
