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Articolo metodologico

Misura Stress ossidativo Resistenza

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⸱

DOI:

10.3791/52746

⸱

9 maggio 2015

 , 
1Goodman Cancer Research Center, McGill University, 2Department of Biochemistry, McGill University

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Sommario

C. elegans è un organismo modello attraente per studiare le vie di trasduzione del segnale coinvolte nella resistenza allo stress ossidativo. Qui forniamo un protocollo per misurare la resistenza allo stress ossidativo di animali da C. elegans in fase liquida, utilizzando diversi agenti ossidanti in piastre a 96 pozzetti.

Abstract

Lo stress ossidativo, che è il risultato di uno squilibrio tra la produzione e la detossificazione di specie reattive dell'ossigeno, è un fattore importante di patologie umane croniche, tra cui malattie cardiovascolari e neurodegenerative, diabete, invecchiamento e cancro. Pertanto, è importante studiare stress ossidativo non solo in sistemi cellulari ma anche utilizzando interi organismi. C. elegans è un interessante organismo modello per studiare la genetica di ossidative vie di trasduzione del segnale di stress, che sono altamente evolutivamente conservate.

Qui, mettiamo a disposizione un protocollo per misurare la resistenza allo stress ossidativo in C. elegans a liquido. Brevemente, ROS inducono reattivi come paraquat (PQ) e H 2 O 2 vengono sciolti in tampone M9, e soluzioni sono aliquotati nei pozzetti di una piastra microtiter a 96 pozzetti. L4 sincronizzato / ragazzo C. animali elegans sono trasferiti nei pozzetti (5-8 animali / e) e la sopravvivenza è misurataogni ora fino maggior parte dei worm sono morti. Quando si esegue un test di resistenza allo stress ossidativo con una bassa concentrazione di fattori di stress in lastre, l'invecchiamento potrebbe influenzare il comportamento degli animali su stress ossidativo, che potrebbero portare ad una interpretazione errata dei dati. Tuttavia, nel saggio qui descritto, questo problema è improbabile che si verifichi in quanto vengono utilizzati solo L4 / giovani adulti. Inoltre, questo protocollo è poco costoso e risultati sono ottenuti in un giorno, che rende questa tecnica attraente per schermi genetici. Nel complesso, questo aiuterà a capire ossidativi vie di segnale di stress di trasduzione, che si potrebbe tradurre in una migliore caratterizzazione delle ossidativo malattie umane allo stress associato.

Introduzione

Negli eucarioti, fosforilazione ossidativa che si svolgono nella catena di trasporto degli elettroni dei mitocondri è il principale motore della produzione di energia sotto forma di ATP. Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono un sottoprodotto naturale di questo processo. Nonostante il loro importante ruolo di molecole di segnalazione, eccessivo ROS può causare danni al DNA, proteine ​​carbonilazione, e l'ossidazione dei lipidi. Uno squilibrio tra la produzione di ROS e la disintossicazione è causa di stress ossidativo, che porta alla perdita di energia, danno cellulare, e fa scattare la morte delle cellule 1,2. Lo stress ossidativo contribuisce all'invecchiamento e allo sviluppo di molte malattie mortali tra cui il cancro, il diabete, malattie cardiovascolari e neurodegenerative 3-9.

Le cellule si sono evolute strategie di difesa enzimatici e non enzimatici per mantenere livelli adeguati di ROS e di proteggere i loro elettori contro il danno ossidativo 1,2. Superossido dismutasi (SOD) Gli enzimi agiscono in primo luogo a convert superossido da H 2 O 2, che viene poi convertito in acqua catalasi o enzimi perossidasi. Strategie non enzimatici di difesa sono per lo più le molecole che reagiscono più velocemente con ROS rispetto alle macromolecole cellulari, proteggendo componenti cellulari essenziali. Nonostante il ruolo protettivo dei ROS enzimi disintossicanti, alcune molecole ROS sfuggire i meccanismi di difesa antiossidanti e portano al danno ossidativo. Detection, la riparazione e la degradazione dei componenti cellulari danneggiate sono strategie essenziali della difesa durante lo stress ossidativo 1,2.

Segnalazione meccanismi coinvolti nella resistenza allo stress e lo stress ossidativo in particolare sono molto evolutivamente conservati 10,11. A differenza delle cellule esperimenti di coltura in cui le condizioni organismal sono solo parzialmente riprodotti, lo studio dello stress ossidativo in organismi modello 12,13 ha un grande significato. C. elegans è un nematode vita libera che può essere facilmente ed economicamente culturato su un prato batterica sui terreni di coltura. E 'di piccole dimensioni (circa 1 mm di lunghezza) e normalmente cresce come un ermafrodita sé concimazione, che facilita le manipolazioni genetiche. Ha un rapido ciclo di vita e una capacità riproduttiva alto, producendo circa 300 figli per ogni generazione, che lo rende uno strumento potente per eseguire grandi schermi genetiche 14. Le C. elegans genoma è completamente sequenziato e il 40-50% dei geni sono previsto per essere omologhi di geni associati alla malattia umana 15-18. L'atterramento di geni di interesse utilizzando RNAi è rapido e facile in C. elegans. Gene giù regolamento potrebbe essere realizzato nutrire gli animali E. coli, batteri che ospitano un plasmide che esprime l'RNA a doppio filamento che gli obiettivi del mRNA di interessi 19. Pertanto, la determinazione della funzione del gene utilizzando su larga scala schermi RNAi ha un grande impatto sulla comprensione delle malattie umane tra cui il cancro 20,21.

Studi di oresistenza allo stress xidative in C. elegans hanno portato all'identificazione di meccanismi conservati di resistenza allo stress ossidativo 13,22. Alcune vie individuate sono percorsi comuni che modulano la longevità e resistenza ad altre sollecitazioni così come ipossia, calore, e lo stress osmotico. Questi percorsi comprendono la segnalazione dell'insulina, segnalazione TOR, e autofagia. Altre vie principali riguardano la disintossicazione del ROS come gli enzimi superossido dismutasi e degli enzimi catalasi, o riparare i danni come shock termico e chaperone proteine ​​11,13,22.

Questo protocollo descrive come determinare la resistenza allo stress ossidativo di C. elegans a liquido. Abbiamo usato flcn-1 (ok975) e wild-type animali per dimostrare il protocollo dal momento che abbiamo già mostrato una maggiore resistenza allo stress ossidativo in caso di perdita di flcn-1 (ok975) in C. elegans 23. Abbiamo anche dimostrato che questo aumento della resistenza dipendesu AMPK e autofagia, un asse di segnalazione che migliora bioenergetica cellulare e favorisce la resistenza allo stress 23. PQ è un fattore di stress ossidativo che interferisce con la catena di trasporto degli elettroni per produrre specie di ossigeno reattive 24. Lo stesso dosaggio potrebbe essere adattato e altre fonti di ROS o composti che generano ROS potrebbe essere utilizzato come H 2 O 2 e rotenone. Saggi simili sono stati sviluppati su piastre in cui sono utilizzati basse concentrazioni di PQ 25,26. Il vantaggio di questo test è che è molto veloce, ed i risultati potrebbero essere ottenuti in un giorno. Inoltre, il volume totale di liquido utilizzato per eseguire il test di resistenza allo stress ossidativo in piastre da 96 pozzetti è bassa rispetto al volume usato per preparare PQ contenenti piastre. Pertanto, la quantità di PQ usata è nel dosaggio liquido è basso, il che rende il test poco costoso e limita la produzione di rifiuti tossici. Tuttavia, le limitazioni di questo test rispetto ai saggi piastra comprendono lack di cibo nel dosaggio liquido e la minore concentrazione di ossigeno nel liquido rispetto all'aria. Questi sono fattori importanti che in alcuni casi, potrebbe influenzare i risultati. Pertanto, confermando riproducibilità utilizzando altri metodi di resistenza stress ossidativo è raccomandato per appoggiare risultati ottenuti in questa analisi.

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Protocollo

1. Preparazione dei reagenti

  1. Preparazione dei supporti per C. crescita elegans (in questo caso, gli animali wild-type e animali flcn-1 (ok975) mutante).
    1. Preparare Modified miscela secca di Youngren Solo Bacto-peptone (MYOB) contenente 5,5 g di Tris HCl, 2,4 g di Tris base, 31 g di Bactopetone, 20 g di NaCl e 0,08 g di colesterolo. Mescolare bene con agitazione.
      NOTA: Questo mix è sufficiente per preparare 10 litri di MYOB media.
      NOTA: mezzo di crescita (NGM) piastre normali potrebbero essere utilizzati al posto delle lastre MYOB 27. Tuttavia, lo stesso tipo di piastre deve essere utilizzato per una valida comparazione dei ceppi e tra ripetizioni indipendenti. In questo protocollo, abbiamo usato solo piatti MYOB.
    2. Preparare 1 L di MYOB medio aggiungendo 6 g di MYOB mix secco, 17 g di agar e portare a 1 L con H 2 O e autoclave per 45 minuti a 122 ° C. Versare in piastre e lasciare asciugare a temperatura ambiente per 2 giorni.
    3. Usando una tecnica sterile, inoculare 100 ml di culture di terreno LB brodo con E. batteri coli OP50 e crescono O / N a 37 ° C.
    4. Piastre Seed MYOB con E. batteri coli OP50. Permettono di crescere a temperatura ambiente per 48 ore.
  2. Preparazione per la down-regulation gene utilizzando RNAi
    1. Preparare MYOB piastre RNAi-alimentazione. Procedere come nei passaggi 1.1.1 e 1.1.2. Dopo la sterilizzazione in autoclave, lasciare il mezzo di raffreddare fino a circa 55 ° C e aggiungere 1 ml di 1 M isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) e 1 ml di ampicillina 100 mm.
    2. Streak E. coli HT115 batteri trasformati con un plasmide che esprime sia EV controllo o flcn-1 RNAi specifico ampicillina (50 ug / ml) / tetraciclina (15 ug / ml) piastre di agar. Grow cultura O / N a 37 ° C.
    3. Scegli colonie e inoculare E. coli HT115 batteri trasformati con un plasmide che esprime o EV controllo o flcn-1 specifica RNAi e crescere la cultura in LB / ampicillina (50 mg / ml) di media e O / N a 37 & #176; C.
    4. Piatti di semi con E. coli HT115 EV batteri o HT115 flcn-1 batteri RNAi.
      NOTA: Mantenere le piastre 48 ore a temperatura ambiente prima dell'uso. Se RNAi atterramento da alimentazione è efficace, utilizzare altri metodi di consegna del ds-RNA 28.
  3. Indurre stress ossidativo con paraquat (PQ):
    1. Preparare tampone M9 mescolando 3 g di KH 2 PO 4, 6 g di Na 2 HPO 4, 5 g di NaCl e 0,25 g di MgSO4 · 7 H 2 O. Portare a 1 litro con acqua distillata. Soluzione Autoclave per 45 minuti a 122 ° C e conservare le bottiglie a temperatura ambiente.
    2. Il giorno del test, preparare la soluzione M9 / PQ contenenti. Per questo protocollo, utilizzare PQ 100 mm (0,1028 g di PQ sciolti in 4 ml di tampone M9 riempie un intero 96 pozzetti con 40 ml di M9 / PQ per pozzetto).
      ATTENZIONE: PQ è un composto pericoloso e altamente tossico. Maneggiare secondo le linee guida appropriate.
      NOTA: La prima volta che l'esecuzione di un nuovo streno o una nuova condizione, si raccomanda di saggiare la sopravvivenza in concentrazioni crescenti di PQ per determinare la migliore concentrazione da utilizzare per uccidere gli animali entro 7-10 ore.

2. Preparazione di Age-sincronizzato L4 Popolazione

  1. Trasferimento 20 ermafroditi adulte gravide ad una piastra MYOB fresco seminato con E. batteri coli OP50. Preparare più matrici in base al numero di vermi necessari durante il dosaggio.
  2. Consentire loro di deporre le uova per 6 ore e quindi utilizzando un verme filo di platino selezionamento rimuovere le madri. Controllare le piastre al microscopio per valutare il numero di uova deposte.
  3. Lasciare le uova per schiudersi e crescere a 20 ° C per 48 ore. A questo punto, gli animali sono in un L4 / giovane tardivamente adulti. Scegli stessi animali palco e trasferire ai pozzetti-soluzione contenente PQ.
    NOTA: Dal momento che 48 ore di incubazione si applica solo ai mutanti che crescono in modo simile a wild-type animali, è importante monitorare sviluppotasso di mutanti recentemente testati per garantire la conformità al tasso di sviluppo wild-type, in caso contrario, devono essere utilizzati altre linee temporali.
  4. In alternativa, utilizzare tecniche di sincronizzazione. Genera popolazione sincronizzato di L1 vermi larve con una soluzione di ipoclorito (25 ml di acqua, 125 ml di 5,25% di ipoclorito di sodio, 50 ml di 4 M NaOH; avvolgere bottiglia con un foglio di alluminio per isolare dalla luce). Tuttavia, per questa analisi, non è consigliabile, in quanto intenso candeggio potrebbe influenzare il comportamento degli animali durante il dosaggio.
    ATTENZIONE: Maneggiare soluzione di ipoclorito secondo le linee guida.
    NOTA: quando si utilizza RNAi per regolare lungo il gene di interesse, sincronizzare gli ermafroditi come descritto nel paragrafo 2, con l'eccezione del trasferimento delle madri alle piastre RNAi seminate con specifici batteri RNAi. Quando il colpo con l'RNAi è debole, si raccomanda di alimentazione per più generazioni.

3. Esecuzione del Stress Ossidativo Resistenza Assay

  1. Dispensare 40 ml di soluzione di 100 PQ mm (preparato fresco) per ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti. Utilizzare almeno 12 pozzetti come repliche di ogni condizione (trattamento, mutante, etc.). Utilizzando un verme scelta filo di platino, trasferire 5-8 animali L4 larve di ogni bene che indica l'ora di inizio e l'ora di fine.
  2. Quando si avvia un'altra condizione, nota l'ora di inizio e l'ora di fine. Posizionare la piastra a 20 ° C nel tempo di incubazione se trasferire i vermi e segnando animali morti un'ora dopo dal momento di inizio.
  3. Utilizzando il microscopio da dissezione, contare la sopravvivenza ogni ora. Agitare delicatamente la piastra prima di iniziare a contare. Indicare i vermi che non si muovono, anche dopo avvistare una luce ad alta intensità, come animali morti. Indicare anche il numero di animali vivi.
    NOTA: Guardando forma verme, le code e il movimento della testa ad alto ingrandimento, contribuire a determinare vermi morti dal vivo.
  4. Ripetere questa operazione fino a quando la maggior parte ogni ora vermi sono morti.

4. Determinazione della sopravvivenza Percentuale in Every Time Point

  1. Calcolare il numero totale di animali per condizione sommando il numero totale di animali trasferiti ad ogni pozzetto. Ignorare gli animali che sono danneggiati o uccisi al momento del trasferimento.
  2. Per ogni punto di tempo, calcolare il numero totale di animali morti per condizioni (somma di animali morti nei 12 pozzetti). Per ogni punto di tempo, di calcolare la percentuale di morte (numero di animali morti diviso per il numero totale degli animali e moltiplicato per 100) e la percentuale di sopravvivenza (100 meno cento morte).
  3. Ripetere questo test almeno 3 volte indipendenti.

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Risultati

Confrontando wild-type C. elegans per flcn-1 (ok975) animali mutanti

Qui abbiamo usato PQ 100 mM per determinare la resistenza di tipo selvaggio C. elegans animali rispetto a flcn-1 (ok975), che ha dimostrato di resistere allo stress ossidativo, il calore, e anossia 23. Dopo 4 ore di trattamento, il 48,3% di wild-type sopravvissuto rispetto al 77,8% di sopravvivenza in flcn-1 (ok975) animali. Come previsto, flcn-1 (ok975) anima...

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Discussione

C. elegans è un interessante organismo modello per studiare la resistenza allo stress ossidativo in vivo geneticamente poiché può essere facilmente colto, e rapidamente conduce a un gran numero di prole geneticamente identici. Diversi metodi per misurare la resistenza allo stress ossidativo sono stati precedentemente descritti e sono basati sulla integrazione di piastre di coltura con le varie fonti di ROS quali PQ, rotenone, H 2 O 2, e juglone 25,26,29-32. Qui si descr...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Riconosciamo il Centro Caenorhabditis Genetica per C. ceppi elegans. Supporto Il finanziamento è stato fornito dal Terry Fox Research Institute. Riconosciamo inoltre sostegno concesso al Parlamento europeo dal Rolande e Marcel Gosselin Graduate Studentship e la borsa di formazione CIHR / FRSQ in FRN53888 ricerca sul cancro del Programma di Formazione Cancer Research McGill integrato.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Agar grado batteriologicoMulticell800-010-LG
Peptone batteriologicoOxoidLP0037
Cloruro di sodio grado biotecnologicoBioshop7647-14-5
ColesteroloSigmaC8503-25G
UltraPure tris cloridratoInvitrogen15506-017
Tris aminometanoBio Basic Canada Inc77-86-1
IPTGSanta Cruz Biotechnologysc-202185A
AmpicillinaBioshop69-52-3
Estratto di lievitoBio Basic Inc.8013-01-2
Metile viologeno dicloruro idratoAldrich chimica856177-1G
Piastra di Petri 60 x15 mmFisherFB0875713A
Pipetta 10 mlFisher1367520
Fosfato di potassio monobasicoG-BiosciencesRC-084
Solfato di magnesio eptaidratoSigmaM-5921
Sodio fosfato bibasicoBioshop7558-79-4
Discovery v8 microscopio
96 pozzetti chiaro piastra
flcn-1 Fonte RNAiAhringer Libreria
stereo zeiss per microtitolazione

Riferimenti

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Ristampe e permessi

Errata corrige


Formal Correction: Erratum: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A reference was corrected in the publication of Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates. There was an error with reference 34 in the Citations section. It has been updated from:

Allen, E., Walters, I.B., Hanahan, D. Brivanib a dual FGF/VEGF inhibitor,is active both first and second line againstmouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance toVEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, (16) 5299-310 (2011).

to:

Allen, A. T., Maher, K. N., Wani, K. A., Betts, K. E., & Chase, D. L. Coexpressed D1- and D2-like dopamine receptors antagonistically modulate acetylcholine release in Caenorhabditis elegans. Genetics. 188, 579-590 (2011).

Tag

Piastra da microtitolazione a 96 pozzettiTrattamento con ParaquatSaggio di sopravvivenzaAdulto giovane L4 sincronizzatoMicroscopio da dissezioneTampone M9Interferenza dell'RNAScreening genetici
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