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Articolo metodologico

Produzione robotica di Cancer Cell Spheroids con un sistema acquoso bifase per Drug Testing

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DOI:

10.3791/52754

⸱

23 aprile 2015

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, The University of Akron

In questo articolo

Sommario

Viene presentato un protocollo per la stampa robotica di sferoidi di cellule tumorali in un formato di piastra a 96 pozzetti ad alta produttività utilizzando un sistema acquoso a due fasi.

Abstract

Gli sferoidi delle cellule tumorali presentano un modello in vitro rilevante di tumori avascolari per applicazioni di test di farmaci antitumorali. In questo lavoro viene descritto un protocollo dettagliato per la produzione di sferoidi sia monocoltura che co-coltura in un formato di piastra a 96 pozzetti ad alta produttività. Questo approccio utilizza un sistema acquoso a due fasi per confinare le cellule in una goccia della fase acquosa più densa immersa nella seconda fase acquosa. La goccia si appoggia sulla superficie del pozzetto e mantiene le cellule nelle immediate vicinanze per formare un singolo sferoide. Questa tecnologia è stata adattata a un manipolatore robotico di liquidi per produrre sferoidi di dimensioni controllate e accelerare il processo di produzione di sferoidi per applicazioni di screening dei composti. Gli sferoidi trattati con un farmaco clinicamente usato mostrano una ridotta vitalità cellulare con l'aumento della dose del farmaco. L'uso di una piastra a micropozzetti standard per la generazione di sferoidi semplifica l'analisi della vitalità delle cellule tumorali degli sferoidi trattati con farmaci con un lettore di micropiastre. Questa tecnologia è semplice da implementare sia roboticamente che con altri strumenti di manipolazione dei liquidi come le pipette manuali.

Introduzione

Saggi cellulari forniscono uno strumento importante per lo sviluppo e la scoperta di nuovi farmaci anti-cancro. 1,2 Storicamente, colture monostrato di cellule tumorali sono stati impiegati per studiare l'efficacia di composti candidati contro particolari tipi di cellule tumorali. La facilità di manutenzione delle colture monostrato in piastre di coltura standard, la compatibilità di piatti standard con strumenti robotici commerciali per l'aggiunta dei reagenti, e con attrezzature di screening per l'analisi a valle di risposte cellulari a composti chimici sono i principali vantaggi che rendono le culture 2D uno strumento interessante per test anti-droga. 3 Purtroppo, saggi cellulari monostrato spesso non riescono a prevedere l'efficacia di composti in vivo, rendendo lo sviluppo di farmaci e la scoperta di un processo estremamente costoso. 4,5 Nonostante investimento significativo e lo sforzo da aziende farmaceutiche e unità accademiche, solo ~ 1% di anti-cancro sono stati approvati i farmaci negli studi clinicidalla FDA negli ultimi due decenni. 6 Disparità tra culture 2D e l'ambiente 3D complesso di cellule tumorali in vivo è una grave lacuna di sistemi di coltura monostrato. 7 Pertanto, lo screening di composti candidati contro le cellule tumorali in un ambiente che assomiglia più da vicino l'ambiente tumore 3D potrebbe accelerare lo sviluppo di nuovi farmaci chemioterapici. 8

Sferoidi di cellule di cancro presentano un rilevante modello di tumore 3D in vitro. 9,10 Spheroids sono gruppi compatti che si formano attraverso l'assemblaggio spontanea o indotta delle cellule tumorali su superfici non aderenti o in sospensione utilizzando tecniche come pallone filatore, overlay liquido, micro- microfabbricazione . ben array, microfluidica, e gocce appesi 11-16 Spheroids imitano le caratteristiche principali di tumori solidi, tra cui la geometria e il trasporto limitata di ossigeno, sostanze nutritive, e composti di droga nella zona centrale; di conseguenza, hanno più da vicino rigenerano respon drogase di tumori solidi rispetto a colture monostrato. 17-19 Nonostante questo notevole vantaggio, sferoidi non sono comunemente usate per lo screening di composti chimici contro le cellule tumorali. Difficoltà di produrre sferoidi uniformi dimensioni in un ambiente standard elevato rendimento che è compatibile con la robotica disponibili in commercio e strumenti di screening / immagini impedisce l'incorporazione della cultura sferoide in pipeline di sviluppo di farmaci. Anche se i materiali personalizzati e piastre hanno recentemente resi disponibili in commercio per rispondere a questa esigenza, le considerazioni sui costi scoraggiare il loro uso diffuso.

Due importanti tecniche con la capacità di produrre sferoidi dimensioni consistenti in un throughput elevato utilizzare una nuova piattaforma goccia pendente e microfabbricati micro-pozzetti. 13,16,20 Tuttavia, entrambi gli approcci richiedono piatti e dispositivi che sono costosi da produrre e scomodo per gli utenti endpoint speciali in centri di ricerca di base e le industrie farmaceutiche, dove la più grande efforti per la scoperta di nuovi farmaci anti-cancro sono fatti. Nonostante alcuni miglioramenti nella stabilità di gocce di cellule contenenti un recente disegno di appendere piastre goccia, solo ogni foro della piastra è ancora usato durante la coltura per evitare la diffusione / fusione di gocce. 16 Ciò riduce significativamente il throughput sperimentale. Inoltre e rinnovamento della droga è difficile con manuale o robotizzato pipettaggio e sferoidi devono essere trasferiti in una piastra standard per l'analisi biochimica, perché questa configurazione targa non è facilmente compatibile con gli apparecchi tradizionali, come lettori di piastre. 21 micro-pozzetti fabbricati usando litografia soft anche consentire dimensione controllata produzione sferoide. 13,20 Tuttavia, l'incompatibilità di questa piattaforma con strumenti di pipettaggio standard di trattamento impedisce di sferoidi individuali con composti farmacologici / concentrazioni diverse, esponendo tutti sferoidi a una sola condizione di trattamento. Così, questo metodo non è appropriato per altalo screening composti rendimento che richiede il test simultaneo di più composti / concentrazioni.

Per superare questi ostacoli, è stata sviluppata una nuova tecnica per la produzione ad alta velocità di costantemente dimensioni sferoidi di cellule di cancro in piastre a 96 pozzetti standard. 22,23 L'approccio si basa su un sistema polimerico acquoso bifase (ATPS) con polietilene glicole ( PEG) e destrano (DEX) polimeri in fase di formatura. 24 ATPSs sono state recentemente utilizzato in una varietà di applicazioni biologiche romanzo cellulari per consentire micropatterning cellulare e localizzata consegna dei reagenti biologici alle cellule in mezzi acquosi altamente. 25-32 Per formare un sferoide, le cellule tumorali sono mescolati con la fase acquosa DEX e un calo sub-microlitri della sospensione risultante viene pipettato in una immersione soluzione fase PEG acquosa contenente bene. La goccia rimane immiscibile dalla fase di immersione e cellule limita a facilitare la formazione di uno sferoide. Diavolettoortantly, la fase di immersione molto acquosa fornisce sostanze nutritive alle cellule della sferoide e minimizza il problema ben noto dei media evaporazione comune ad alcuni altri test che causano i cambiamenti nei mezzi osmolalità e le fluttuazioni delle concentrazioni di droga. Questa tecnica permette la produzione sferoide e trattamento farmacologico solo utilizzando reagenti disponibili in commercio e strumenti di dispensazione in piastre da 96 pozzetti standard. È importante sottolineare che l'analisi delle risposte cellulari di sferoidi viene eseguita nella stessa piastra utilizzando saggi biochimici standard e lettori di piastre. La facilità di lavorare con ATPS e adattabilità del approccio alla gestione dei liquidi robotizzato fa generazione ad alto rendimento sia mono-cultura e di co-coltura sferoidi una tecnica di laboratorio semplice. Questo nuovo approccio sarà un importante passo avanti verso l'integrazione di sferoidi di cellule di cancro nei processi di sviluppo di farmaci e di scoperta con una migliore velocità di test e di costo-efficacia (un numero crescente di composti e Redu testaticonsumo di reagente ced) e l'efficienza (riduzione hands-on tempo).

Un protocollo dettagliato per la produzione robotizzata di sferoidi di cellule di cancro in piastre da 96 pozzetti utilizzando l'approccio ATPS è descritto di seguito. Inoltre, i dettagli di trattamento farmacologico di sferoidi conseguenti e analisi a valle delle risposte cellulari utilizzando un test biochimico commerciale sono presentati.

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Protocollo

1. Preparazione di polimerici acquosa Due sistema Phase (ATPS)

  1. Pesare 0,5 g di polietilene glicole (PEG) (MW: 35.000) e aggiungerlo al 9,5 ml di terreno di coltura completo in una sterile 15 ml conica per preparare 10 ml di 5% (w / v) di fase acquosa PEG.
    Nota: Aggiungendo la metà del mezzo alla conica per prima, seguita dalla aggiunta il polimero e quindi la quantità rimanente di supporto minimizza l'adesione del polimero alle pareti coniche e aiuta il polimero sciogliere velocemente.
  2. Pesare 0,128 g di destrano (DEX) (MW: 500.000) e aggiungerlo al 0,872 ml di terreno di coltura completo in una provetta sterile da 1,5 ml microcentrifuga per preparare 1 ml del 12,8% (w / v) fase DEX acquosa.
  3. Soluzioni Vortex entrambi per circa 1 minuto per sciogliere i polimeri nel mezzo.
  4. Tenere entrambe le soluzioni in un bagno d'acqua a 37 ° C per 1 ora per assicurare dissoluzione e miscele omogenee. Tenere i tappi sopra il livello dell'acqua per evitare la possibilità di contaminazione delle soluzioni dal bagnoacqua.
  5. Caricare la soluzione fase PEG in una sterile, siringa di plastica e farla passare attraverso un filtro siringa da 0,2 micron dimensione dei pori per rimuovere le impurità.
    Nota: Riempire la siringa con la soluzione di PEG, posizionarlo nell'inserto del filtro sopra un tubo conico e usando la forza, spingere lentamente la soluzione attraverso il filtro. È normale che si verifichi resistenza contro il movimento dello stantuffo della siringa. Minor perdita della soluzione polimerica si verifica come parte della soluzione rimarrà nel filtro, ma la concentrazione di polimero non cambierà.
  6. Pipettare 10 microlitri della soluzione di fase DEX e diluire a 10 ml di mezzo in un tubo separato per provocare 6,4% (w / v) di fase DEX. Aspirare 100 ml di soluzione di fase PEG e versare in una capsula di Petri.
    1. Pipettare 0,5 ml di 6,4% (w / v) di fase nella soluzione di DEX fase di PEG. Visivamente confermare successo formazione ATPS osservando una goccia DEX al microscopio. Il confine gocciadovrebbe rimanere visibile, indicando la presenza di due fasi, distinte acquose stabili.
  7. Conservare lo stock acquosa PEG e soluzioni di fase DEX a 4 ° C fino al momento dell'uso.
    Nota: Si raccomanda di soluzioni polimeriche sono preparati freschi prima di ogni esperimento e utilizzati entro 24 ore di archiviazione.

2. Preparazione per la stampa di cancro Spheroids Cellulari

  1. Crescere le cellule tumorali di interesse (ad esempio, le cellule MDA-MB-157 cancro al seno) per un 90% -100% confluenti monostrato. Per MDA-MB-157 cellule, usare un mezzo costituito di DMEM contenente 10% FBS, 1% glutammina e 1% di antibiotici.
    1. Celle di raccolta con un tampone di dissociazione cellulare (secondo il protocollo del produttore) e caricare la sospensione in una conica da 15 ml. Centrifugare per 5 min a 173,3 xg, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno di coltura completo.
  2. Le celle di carico su un emocitometro e contare di calcolare il numero richiestodi cellule per una densità cellulare sferoidale desiderato. Un monostrato confluente di MDA-MB-157 cellule cresciute in un pallone T75 solito dà ~ 7 x 10 6 cellule.
    Nota:. Densità cellulare Richiesto per un volume di goccia per generare un singolo sferoide dipenderà dal tipo cellulare 22 Per esempio, una densità di 1,5 x 10 4 o maggiore per MDA-MB-157 cellule è raccomandato in 0,3 ml di fase DEX drop garantire la formazione di un unico sferoide.
  3. Cellule di centrifugazione per una seconda volta per 5 minuti a 173,3 xg e risospendere in un volume adeguato di terreno di crescita per concentrare la sospensione ad una densità cellulare desiderata.
    Nota: Ad esempio, se sono state raccolte 7 x 10 6 cellule tumorali, il volume totale della sospensione cellulare richiesta per formare uno sferoide di densità di 1,5 x 10 4 cellule in 0,3 ml DEX fase goccia sarà di 140 microlitri. Tuttavia a causa della diluizione con soluzione di fase DEX nella fase successiva, utilizzare solo 70 ml di mezzo di coltura cellulare per risospendere le cellule.
  4. Aggiungere alla sospensione cellulare risultante un volume uguale del 12,8% (w / v) Soluzione acquosa fase DEX preparato in 1.2. Per l'esempio di 1,5 x 10 4 cellule di densità sferoidale, 70 microlitri della soluzione di fase DEX viene aggiunto a 70 ml di sospensione cellulare.
  5. Mescolare bene la sospensione cellulare per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule e miscelazione di soluzione DEX. Pipettando su e giù dovrebbe essere fatto con delicatezza per evitare la formazione di bolle.

3. Preparazione per la stampa di Spheroids Co-coltura

  1. Crescere cellule tumorali (per esempio, MDA-MB-157 cellule di cancro al seno umano) e le cellule di supporto (ad esempio, fibroblasti umani) ad un 90% -100% confluenti monostrato. Raccogliere ogni tipo di cellula con un buffer di dissociazione cellulare (secondo il protocollo del produttore).
    1. Caricare ogni sospensione in un conica 15 ml, li centrifugare per 5 min a 173,3 xg, e aspirare il surnatante da ciascun conica. Risospendere le cellule di ogni conica in 1 ml di completo grescita media.
      Nota: Coloranti fluorescenti come calceina AM (macchia cellule vive) e coloranti nucleari (Hoechst) possono essere utilizzati per distinguere i due tipi di cellule.
  2. Caricare ciascun tipo di cellula separatamente su un emocitometro e contarli per calcolare il numero di ciascun tipo di cellula per un rapporto desiderato di cellule tumorali di cellule di supporto in sferoidi co-coltura. Monostrati confluenti di MDA-MB-157 cellule e fibroblasti coltivate in fiasche T75 solito danno ~ 7 x 10 6 e ~ 6 x 10 6 cellule, rispettivamente.
  3. Aggiungere il volume corretto dalla sospensione di cellule di supporto alle cellule tumorali sospensione invia un rapporto desiderato del numero di due tipi di cellule. Ad esempio, utilizzare un rapporto di 50 cellule tumorali a 1 fibroblasti.
  4. Centrifugare la conica contenente la sospensione cellulare mista per 5 min a 173,3 XG e risospendere le cellule in un volume adeguato al risultato della densità finale comprendente dei volumi uguali di mezzo di crescita e l'12,8% (w / v) DEX acquosaSoluzione fase (preparato in 1.2).
  5. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare risultante su e giù per assicurare l'omogeneità della sospensione.

4. La stampa di Spheroids tumorali in una piastra a 96 pozzetti

  1. Un giorno prima esperimenti, cappotto lastre non trattate, a fondo tondo da 96 pozzetti con 1% (w / v) Pluronic a 37 ° C per 24 ore. Questo rivestimento impedisce l'adesione delle cellule durante il periodo della cultura.
  2. Pipettare 50 ml di filtrato 5% (w / v) fase acquosa PEG in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti (piastra di destinazione).
  3. Utilizzando una pipetta, mescolare la sospensione cellulare (preparata al punto 2 o 3 step per mono e co-coltura, rispettivamente) e aggiungere 20 ml di sospensione di ogni altro bene da una colonna di una piastra 384 pozzetti (targa fonte) .
  4. Accendere il gestore liquido e "casa" il capo di pipettaggio per registrare le coordinate. Quindi compilare un protocollo già definito (di seguito in 4.6) al fine di garantire da laboratorio e parametri sono definiti correttoly. Questo passo "homing" può essere diverso per i diversi gestori di liquidi.
    Nota: Il flusso del protocollo, mostrato passo-passo di seguito in 4.6, sarà simile a prescindere dal gestore liquido robotica utilizzato; Tuttavia, l'interfaccia di programmazione può differire a causa dell'uso di diversi software.
  5. Posizionare la piastra di origine, la piastra di destinazione, e scatole di tip pipetta in posizioni definite sulla workstation del gestore liquido come mostrato in Figura 1.
  6. Eseguire il protocollo che prevede le seguenti fasi:
    1. Caricare una colonna di barili dalla testa pipettaggio del gestore liquido con miscelazione punte per pipette (8 punte) dalla stazione di lavoro (Figura 1).
    2. Mescolare la sospensione cellulare in pozzetti della piastra di sorgente (Figura 1). Selezionare un volume di miscelazione inferiore al volume di sospensione cellulare in pozzetti per evitare la formazione di bolle.
    3. Espellere punte in una scatola discariche vuota (Figura 1).
    4. Caricare una colonna di barili dalla testa pipettaggio con 10 microlitri di erogazione punte per pipette (Figura 1).
    5. Aspirare 0,3 ml di sospensione cellulare dalla piastra sorgente (Figura 1) in ciascuna punta della pipetta.
    6. Distribuire la sospensione cellulare nei pozzetti di una colonna della piastra di destinazione (Figura 1). Utilizzare un'altezza erogazione di 0,5 mm e una portata di erogazione inferiore a 1 ml / sec.
    7. Ripetere i passaggi attraverso 4.6.1 4.6.6 finché la stampa di colonna per colonna nella intera piastra destinazione è completa.
  7. Rimuovere con cautela la piastra di destinazione dalla superficie workstation e collocarlo in un incubatore umido a 37 ° C e 5% di CO 2. Mantenere la piastra orizzontale durante il trasporto in incubatrice per evitare di interrompere di DEX gocce fase contenenti cellule.
  8. Incubare la piastra per 24 ore per permettere l'aggregazione di cellule in uno sferoide all'interno della goccia fase DEX.

5. Trattamento farmacologico della Cancer Spheroids Cellulari

Si noti che il seguente protocollo è per un trattamento farmacologico 4 giorni e comprende un rinnovamento con farmaco fresco dopo giorno 2. Può essere modificato per altri periodi di trattamento.

  1. Confermare visivamente formazione sferoide in piastre da 96 pozzetti dopo 24 ore. Se necessario, pozzi di immagine per la misurazione di dimensioni di sferoidi dalla media dei diametri più piccoli e più grandi di ogni sferoide.
  2. Preparare la soluzione madre di un farmaco desiderato sciogliendolo in un solvente raccomandato dal costruttore, ad una concentrazione di solubilità predeterminata. Ad esempio, sciogliere cisplatino in acqua a 2 mg / ml.
    Nota: Proteggere la soluzione madre del farmaco dalla luce, se il farmaco è sensibile alla luce.
  3. Utilizzando la tecnica di diluizione in serie, preparare concentrazioni di farmaco diluito con mezzo di coltura cellulare dalla soluzione madre preparata nella fase precedente. Ogni diluizione dovrebbe essere fatta due volte la concentrazione desiderata. DilRapporti ution variano a seconda della concentrazione della partenza e desiderata concentrazione di lavoro.
  4. Aggiungere 50 ml di soluzione medicinale preparata nella fase precedente in ciascun pozzetto. Questo può essere fatto tramite macchina o pipettando manuale.
    Nota: Ogni concentrazione farmaco sarà diluito in mezzo alla concentrazione voluta dal 50 microlitri acquosa fase PEG già in ciascun pozzetto.
    1. Utilizzare sferoidi da due colonne di una piastra a 96 pozzetti (n = 16) per ciascuna concentrazione.
    2. In pozzetti di controllo, aggiungere solo 50 ml di terreno di coltura fresco alle attuali 50 microlitri della fase acquosa PEG.
  5. Incubare sferoidi con il farmaco per 48 ore a 37 ° C e 5% CO 2, al riparo dalla luce.
  6. Dopo 48 h di incubazione, preparare diluizioni fresche del farmaco, alle concentrazioni desiderate e rinnovare farmaco aggiungendo 50 ml di soluzione medicinale fresca a ciascun pozzetto.
    Nota: I pozzi contengono già la concentrazione del farmaco desiderato dal primo farmaco tRATTAMENTO. Pertanto in questa fase di rinnovo, ciascuna concentrazione viene preparata alla concentrazione desiderata in quanto si verificherà alcuna diluizione.
  7. Incubare sferoidi con il farmaco per un altro 48 ore a 37 ° C e 5% CO 2, al riparo dalla luce.

6. Analisi della Cellular Viabilità in Spheroids

  1. Dopo 48 ore di incubazione con rinnovata farmaco (cioè, il tempo totale del trattamento di sferoidi con un farmaco è 4 giorni), misurare il volume totale del mezzo in un pozzetto pipettando manuale.
    Nota: il volume tipico in un bene è ~ 140 microlitri (un piccolo calo si verifica a causa di evaporazione).
  2. Calcolare il volume della cella di reagente vitalità (ad esempio, PrestoBlue) come concentrazione del 10% del volume totale bene. Aggiungere questo volume di reagente vitalità cellulare in ciascun pozzetto.
    Nota: Con un volume di supporto esistente di 140 microlitri in un pozzo, un volume di 15,6 microlitri è necessaria per ottenere una concentrazione del 10% del totale bene. Questo è calcolatodividendo il volume del supporto esistente 9 (140 ml / 9 = 15,6 ml).
  3. Incubare la piastra con il reagente vitalità cellulare aggiunti a ciascun pozzetto per 6 ore a 37 ° C, al riparo dalla luce.
  4. Porre la piastra in un lettore di micropiastra e leggere il segnale di fluorescenza a 560 nm e 590 nm di eccitazione e di emissione, rispettivamente.
  5. Calcolare la vitalità percentuale di cellule in sferoidi normalizzando il segnale fluorescente da pozzi trattati a quella di pozzetti di controllo dopo la media dei valori delle stesse condizioni di trattamento.

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Risultati

La workstation del gestore liquido robotizzato è mostrato in Figura 1. La testa di pipettaggio e tutte le stazioni utilizzati nella stampa robotico di sferoidi nella sezione 4.6 sono etichettati. L'immagine mostra l'uso di due diverse stazioni per scatole di tip (una serie di punte per la miscelazione e la seconda serie di aspirazione / erogazione di cellula miscela fase DEX sospensione acquosa). L'intera configurazione è alloggiato all'interno di un armadio standard di sicurezza biologi...

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Discussione

Spheroids presentano un modello realistico per capire meglio la fisiologia del tumore e l'efficacia dei farmaci e di fornire uno strumento utile per la scoperta di nuovi farmaci anti-cancro. Tali applicazioni potrebbero trarre grandi vantaggi da semplici tecniche di generazione e di manutenzione sferoidale che richiedono solo da laboratorio standard strumenti di gestione dei liquidi e vagliatura. L'uso di un sistema a due fasi acquosa cellule tumorali di aggregati spontaneamente entro la fase goccia permette una...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono il finanziamento del National Institutes of Health R21CA182333.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti e materiali di consumo
Glicole polietilenico, MW: 35,000Sigma-Aldrich94646
Dextran, MW: 500,000Pharmacosmos5510 0500 9007
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Sigma-AldrichD6429
Siero fetale bovinoSigma-Aldrich12306C
GlutamminaLife Technologies35050-061
AntibioticLife Technologies15240-062
Claceina AMLife TechnologiesC3100MP
HoechstLife Technologies33342
CisplatinoSpettro Chimico15663-27-1
PrestoBlueLife TechnologiesA-13261
Pluronic F-108Sigma Aldrich542342
Punte monouso (10 &; l)Puntali monousoC-P10V11.ST
(70 &; micro; l)FluoticsC-P70V11.ST
Piastre a fondo tondo a 96 pozzettiNunc268200
Equipment
Liquid HandlerAgilent TechnologiesSRT Bravo
Lettore di micropiastreBiotek InstrumentsSynergy H1M
fluotici

Riferimenti

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