Viene presentato un protocollo per la stampa robotica di sferoidi di cellule tumorali in un formato di piastra a 96 pozzetti ad alta produttività utilizzando un sistema acquoso a due fasi.
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Articolo metodologico
Produzione robotica di Cancer Cell Spheroids con un sistema acquoso bifase per Drug Testing
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli sferoidi delle cellule tumorali presentano un modello in vitro rilevante di tumori avascolari per applicazioni di test di farmaci antitumorali. In questo lavoro viene descritto un protocollo dettagliato per la produzione di sferoidi sia monocoltura che co-coltura in un formato di piastra a 96 pozzetti ad alta produttività. Questo approccio utilizza un sistema acquoso a due fasi per confinare le cellule in una goccia della fase acquosa più densa immersa nella seconda fase acquosa. La goccia si appoggia sulla superficie del pozzetto e mantiene le cellule nelle immediate vicinanze per formare un singolo sferoide. Questa tecnologia è stata adattata a un manipolatore robotico di liquidi per produrre sferoidi di dimensioni controllate e accelerare il processo di produzione di sferoidi per applicazioni di screening dei composti. Gli sferoidi trattati con un farmaco clinicamente usato mostrano una ridotta vitalità cellulare con l'aumento della dose del farmaco. L'uso di una piastra a micropozzetti standard per la generazione di sferoidi semplifica l'analisi della vitalità delle cellule tumorali degli sferoidi trattati con farmaci con un lettore di micropiastre. Questa tecnologia è semplice da implementare sia roboticamente che con altri strumenti di manipolazione dei liquidi come le pipette manuali.
Introduzione
Saggi cellulari forniscono uno strumento importante per lo sviluppo e la scoperta di nuovi farmaci anti-cancro. 1,2 Storicamente, colture monostrato di cellule tumorali sono stati impiegati per studiare l'efficacia di composti candidati contro particolari tipi di cellule tumorali. La facilità di manutenzione delle colture monostrato in piastre di coltura standard, la compatibilità di piatti standard con strumenti robotici commerciali per l'aggiunta dei reagenti, e con attrezzature di screening per l'analisi a valle di risposte cellulari a composti chimici sono i principali vantaggi che rendono le culture 2D uno strumento interessante per test a....
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Protocollo
1. Preparazione di polimerici acquosa Due sistema Phase (ATPS)
- Pesare 0,5 g di polietilene glicole (PEG) (MW: 35.000) e aggiungerlo al 9,5 ml di terreno di coltura completo in una sterile 15 ml conica per preparare 10 ml di 5% (w / v) di fase acquosa PEG.
Nota: Aggiungendo la metà del mezzo alla conica per prima, seguita dalla aggiunta il polimero e quindi la quantità rimanente di supporto minimizza l'adesione del polimero alle pareti coniche e aiuta il polimero sciogliere velocemente. - Pesare 0,128 g di destrano (DEX) (MW: 500.000) e aggiungerlo al 0,872 ml di terreno di coltura completo in una provetta sterile da 1,5 ml microcentrifug....
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Risultati
La workstation del gestore liquido robotizzato è mostrato in Figura 1. La testa di pipettaggio e tutte le stazioni utilizzati nella stampa robotico di sferoidi nella sezione 4.6 sono etichettati. L'immagine mostra l'uso di due diverse stazioni per scatole di tip (una serie di punte per la miscelazione e la seconda serie di aspirazione / erogazione di cellula miscela fase DEX sospensione acquosa). L'intera configurazione è alloggiato all'interno di un armadio standard di sicurezza biologi.......
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Discussione
Spheroids presentano un modello realistico per capire meglio la fisiologia del tumore e l'efficacia dei farmaci e di fornire uno strumento utile per la scoperta di nuovi farmaci anti-cancro. Tali applicazioni potrebbero trarre grandi vantaggi da semplici tecniche di generazione e di manutenzione sferoidale che richiedono solo da laboratorio standard strumenti di gestione dei liquidi e vagliatura. L'uso di un sistema a due fasi acquosa cellule tumorali di aggregati spontaneamente entro la fase goccia permette una.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono il finanziamento del National Institutes of Health R21CA182333.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti e materiali di consumo | |||
| Glicole polietilenico, MW: 35,000 | Sigma-Aldrich | 94646 | |
| Dextran, MW: 500,000 | Pharmacosmos | 5510 0500 9007 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Siero fetale bovino | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| Glutammina | Life Technologies | 35050-061 | |
| Antibiotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Claceina AM | Life Technologies | C3100MP | |
| Hoechst | Life Technologies | 33342 | |
| Cisplatino | Spettro Chimico | 15663-27-1 | |
| PrestoBlue | Life Technologies | A-13261 | |
| Pluronic F-108 | Sigma Aldrich | 542342 | |
| Punte monouso (10 &; l) | Puntali monouso | C-P10V11.ST | |
| (70 &; micro; l) | Fluotics | C-P70V11.ST | |
| Piastre a fondo tondo a 96 pozzetti | Nunc | 268200 | |
| Equipment | |||
| Liquid Handler | Agilent Technologies | SRT Bravo | |
| Lettore di micropiastre | Biotek Instruments | Synergy H1M |
Riferimenti
- Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. Systems biology in drug discovery. Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).
- Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines. Ant....
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Ristampe e permessi
