Applicazione del DNA-Specific Stain metile Verde al Fluorescent Etichettatura degli embrioni

Sommario

Viene descritto un metodo per la colorazione fluorescente di materiale biologico fisso con l'etichetta specifica del DNA verde metile. Il verde metile viene utilizzato in una soluzione acquosa diluita ed è molto resistente al fotosbiancamento. La sua emissione a lontano rosso consente l'imaging profondo del campione, rendendolo particolarmente adatto per gli embrioni interi.

Abstract

Il verde metilico è noto da tempo come colorante istologico con un'affinità specifica per il DNA, anche se le sue proprietà fluorescenti sono rimaste inesplorate fino a poco tempo fa. In questo articolo, illustriamo il metodo per preparare una soluzione acquosa madre di verde metilico, che una volta diluita può essere utilizzata come una comoda etichetta nucleare fluorescente per cellule e tessuti fissati. Vengono descritte in dettaglio le semplici procedure per etichettare gli embrioni interi di pesce zebra e pulcino e vengono mostrati esempi di immagini ottenute. Il verde metile è eccitato al massimo dalla luce rossa, a 633 nm, ed emette con uno spettro relativamente nitido che raggiunge un picco a 677 nm. È molto economico, non tossico, altamente stabile in soluzione e molto resistente al fotosbiancamento quando legato al DNA. La sua emissione rossa consente l'imaging confocale a scansione ad alta risoluzione inalterato di nuclei in campioni spessi. Infine, questo protocollo di colorazione con verde metilico è compatibile con altre procedure di colorazione cellulare, come la marcatura degli anticorpi o la marcatura dei filamenti di actina con falloidina coniugata con fluoroforo.

Introduzione

La colorazione fluorescente del DNA è ampiamente e abitualmente utilizzata sia nella ricerca biologica che nella diagnosi clinica, sia per lo studio dettagliato della struttura nucleare e cromosomica, per la controcolorazione di tessuti e cellule, sia per lo studio dei parametri del ciclo cellulare¹. Sebbene siano disponibili diverse colorazioni di DNA, le più utilizzate sono state quelle eccitate dalla luce UV ed emesse in blu, che si adattano ai consueti sistemi a tre filtri utilizzati nella maggior parte dei microscopi a epifluorescenza convenzionali se combinati con fluorofori emettitori di verde e rosso-arancio, come proteine fluorescenti o piccole molecole attaccate agli anticorpi. Tra queste colorazioni di DNA che emettono blu, le più comuni sono DAPI e Hoechst agenti leganti i solchi minori^2,3. Tuttavia, l'incorporazione di un'ampia varietà di linee di emissione laser e di rilevamento spettrale nei microscopi a scansione laser, ha permesso ai ricercatori di scegliere per l'uso di coloranti nucleari che emettono il rosso lontano come lo ioduro di propidio (PI) o TO-PRO 3⁴. Un vantaggio di queste colorazioni è che superano il problema dell'autofluorescenza che si trova in molte cellule e tessuti, in particolare negli embrioni⁵, ma molti di essi hanno problemi diversi come avere ampi profili di emissione o essere molto sensibili al fotosbiancamento⁶.

Il ricercatore svizzero Friedrich Miescher scoprì il DNA nel 1869, estraendolo dai nuclei dei globuli bianchi che si trovano nel pus. La chiamò nucleina e pochi anni dopo dimostrò che formava precipitati con la colorazione relativamente nuova del verde metilico. Il verde metile è composto da tre anelli all'anilina, con diversi gradi di metilazione, e ha due cariche positive che gli permettono di legarsi fortemente al solco maggiore del DNA^7,8. La colorazione del DNA con il verde metilico si è dimostrata molto presto specifica, portando allo sviluppo da parte di Unna e Pappenheim di una colorazione combinata con la pironina, che marcava specificamente l'RNA. Da allora la metil-verde-pironina è stata ampiamente utilizzata nella tecnica istologica di routine⁹.

Fino a poco tempo fa, si sapeva molto poco sulle proprietà fluorescenti del verde metilico. Il nostro lavoro precedente, tuttavia, ha scoperto alcuni dei vantaggi spettrali del verde metile⁶ come la sua eccitazione a 633 nm, un comodo spostamento di Stokes, la sua emissione sulla porzione del vicino infrarosso dello spettro elettromagnetico, una fotostabilità più elevata rispetto alle colorazioni di DNA disponibili in commercio con proprietà spettrali simili e ad un costo molto basso. Questo è il motivo per cui abbiamo deciso di testarlo per essere utilizzato come etichetta fluorescente ad altissima affinità e specifica per il DNA su tessuti embrionali e in embrioni interi. Inoltre, fino ad ora la colorazione nucleare con verde metilico veniva eseguita a pH basso, rendendo difficile la combinazione con la colorazione con anticorpi. L'obiettivo del metodo qui descritto è quello di avere un protocollo per la colorazione fluorescente del DNA nucleare che superi l'inconveniente di cui sopra eseguendo la procedura di colorazione a pH fisiologico, rendendolo così un controcolorante adatto per l'immunomarcatura su sezioni e interi tessuti.

Protocollo

1. Purificazione del colorante

1. Preparare una soluzione acquosa al 4% del verde metile sciogliendo 0,4 g di colorante in polvere in 10 ml di acqua distillata. Mescolare accuratamente fino a completa dissoluzione.
2. Sotto una cappa-cappa, mescolare con almeno 2 parti di cloroformio. E 'importante verificare in anticipo se i tubi sono resistenti cloroformio.
3. Mescolare accuratamente e centrifugare per 1 minuto a 2000 xg per accelerare la separazione di fase.
4. Dopo centrifugazione, una fase superiore acquosa con verde metile e una fase organica inferiore con cloroformio e la solita contaminante cristalvioletto sono ottenuti.
5. Recuperare la fase superiore e ripetere l'operazione fino a quando appare fase inferiore del tutto privo di cristallo viola.
6. Al termine, la fase superiore viene recuperato e diluito in acqua ad una concentrazione finale del 2% verde metile. Questa soluzione madre è stabile sul banco di lavoro per mesi e non deve essere protetto dalla luce.

2. Fluorescente nucleare colorazione di Whole embrioni di zebrafish con Metil Verde

1. Fissare gli embrioni durante la notte nel 4% di formaldeide (da paraformaldeide) in tampone fosfato (PBS).
   NOTA: Questo può richiedere da alcune ore a seconda overnight dello spessore degli embrioni. Nell'esempio, abbiamo fissato 48 hr post-fecondazione (HPF) zebrafish embrioni durante la notte.
2. Lavare gli embrioni tre volte in PBS-T (1% Triton X-100 in PBS) per 5 min. L'elevata concentrazione di detersivo permeabilizes cuticola.
3. Preparare un 1: 5,000-1: 10.000 soluzione di verde metile (dal 2% soluzione madre) in PBS-T. La presenza di detersivo durante l'incubazione è utile per i campioni spessi, come zebrafish embrioni e larve.
4. Incubare gli embrioni nella soluzione per almeno 6 ore a 4 ° C, con dolce dondolio. Anche in questo caso, lo spessore dell'embrione è il parametro di calibrazione per la lunghezza dell'incubazione.
5. Lavare gli embrioni 3 times con PBS per 30 minuti per eliminare l'eccesso di detersivo. Metile fluorescenza verde è solo evidente quando si lega al DNA, quindi sfondo dalla molecola non legato è trascurabile.
6. Montare su un vetrino scavato o una camera in casa con soluzione di montaggio (75% glicerolo, 0,1 M Tris · HCl pH 8).
   NOTA: Se la colorazione nucleare deve essere eseguita dopo immunomarcatura, verde metile può essere incorporato alla soluzione di montaggio alla concentrazione di lavoro, senza la necessità di lavare via.
7. Conservare in frigorifero o avviare immediatamente l'imaging. Eseguire l'imaging con un confocale a scansione laser (o altro a fluorescenza) microscopio con eccitazione a 633 nm ed emissione filtri impostati per registrare a 650-750 nm, tenendo conto del fatto che le emissioni di metile verde raggiunge il suo massimo a 677 nm.
   NOTA: Forniamo i dati misurati del profilo emissioni verde metile, per essere caricati nel software di acquisizione, come materiale supplementare.

3. fluorescente nucleare StAining di Whole Chick embrioni utilizzando metile Verde

1. Incubare le uova di gallina fecondate allo stadio di interessi. Fissare gli embrioni notte in formaldeide al 4% (da paraformaldeide) in PBS a 4 ° C. Lavare gli embrioni 3 volte in PBS-T per 2 ore.
2. Preparare un 1: 5,000-1: 10.000 soluzione di verde metile (dal 2% soluzione madre) in PBS-T. Incubare gli embrioni nella soluzione colorante notte a 4 ° C. Lavare gli embrioni 3 volte in PBS, 1 ora ciascuno. Montare in camera con il 75% di glicerolo, 0,1 M Tris, pH 8.

4. Imaging fluorescente Nuclei in embrioni interi montato

1. Preparare una camera di imaging incollando diversi strati di nastro isolante su un vetrino da microscopio e accuratamente tagliato un foro in esso con un bisturi per posizionare gli embrioni all'interno. Questo consentirà di evitare gli embrioni da schiacciamento durante l'imaging.
2. Trasferire accuratamente gli embrioni alla camera di imaging e riempire la camera verso l'alto con il 75% glicerolo, 0,1 M Tris-HCl, pH = 8 con unla formazione di bolle vuoto.
3. Coprire con un # 0 vetrino evitare o eliminare media straripante. Sigillare con smalto.
4. Acquisire immagini del campione su un microscopio a fluorescenza dotato di un filtro di eccitazione 633 o linea laser.
   NOTA: i filtri delle emissioni dovrebbero riguardare al massimo 677 emissione di verde metile.

Risultati

Colorazione nucleare dei campioni di spessore. Il protocollo qui descritto consente il conseguimento di colorazione omogenea delle strutture profonde in embrioni interi. Lenti in via di sviluppo formare nuclei 48 hpf embrioni di zebrafish sono omogeneamente etichettati (Figura 1).

Metile colorazione verde DNA permette la discriminazione di ciclo cellulare differenze morfologiche a carico, come l'individuazione di figure mitotiche o nuclei apoptotici (Figura 2A).

Discussione

Il progressivo sviluppo delle tecniche di microscopia negli ultimi decenni, con particolare attenzione alle variazioni della microscopia a fluorescenza, ha portato alla possibilità di esplorare la dinamica e la struttura di campioni di tessuto intatto, compresi gli embrioni interi^10,11. Una delle principali limitazioni è stata, tuttavia, la disponibilità di fluorofori di buona qualità che possono essere utilizzati per colorare direttamente e rapidamente le strutture subcellulari.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Glicerolo	Sigma-Aldrich	G5516
Verde metile	Dr. G. Grü bler		Testato anche Sigma-Aldrich 323829, che è privo di cristallovioletto
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	158127
Microscopia confocale a scansione laser Leica TCS-SP5	Leica Microsystems
Phalloidin– Isotiocianato di tetrametilrodamina B	Sigma-Aldrich	P1951
cloroformio	Sigma-Aldrich	372978
Centrifuga 5810 R	eppendorf	5811 000.010
vetrini per microscopio	Deltalab	D100004
vetrini coprioggetti	Esco optics	R525025