Una tecnica di arricchimento Ottimizzato per l&#39;isolamento di<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Batteriofago Specie campione di terreno Isolati

Sommario

Presentiamo un protocollo di arricchimento per l'isolamento di batteriofagi che infettano batteri del genere Arthrobacter. Questo protocollo di arricchimento produce risultati rapidi e riproducibili per l'isolamento e l'amplificazione dei fagi di Arthrobacter da isolati del suolo.

Abstract

L'isolamento dei batteriofagi da campioni ambientali è stato eseguito per decenni utilizzando i principi stabiliti dai pionieri della microbiologia. L'isolamento dei fagi che infettano gli ospiti di Arthrobacter è stato limitato, forse a causa del basso tasso di successo di molte tecniche di isolamento precedenti, con il risultato di un gruppo sottorappresentato di fagi Arthrobacter disponibili per lo studio. La tecnica di arricchimento qui descritta, a differenza di molte altre, utilizza un estratto filtrato privo di batteri contaminanti come base per la crescita dei batteri indicatori, Arthrobactersp. KY3901, in particolare. Rimuovendo prima i batteri del suolo, i fagi bersaglio non sono ostacolati dalla competizione con i batteri nativi del suolo presenti nei campioni iniziali del suolo. Questo metodo di arricchimento ha portato a dozzine di fagi unici da diversi tipi di terreno e ha persino prodotto diversi tipi di fagi dallo stesso campione di suolo isolato arricchito. L'uso di questa procedura può essere esteso alla maggior parte dei terreni aerobici ricchi di nutrienti per l'isolamento dei fagi in una vasta gamma di batteri ospiti interessanti.

Introduzione

L'ubiquità di specie Arthrobacter in ambienti di terreno offre un vasto numero e la diversità dei fagi che possono essere isolati da questa specie di batteri ospiti. Membri batteriche della famiglia Acintobacteriaceae sono più notevole per i loro percorsi catabolici di degradare composti recalcitranti come l'atrazina e vari altri pesticidi e diserbanti ^1,2,3. Sebbene la maggior parte della ricerca è stata effettuata utilizzando ceppi ambientali di Arthrobacter, isolati clinici di questo genere si trova nel sangue, urine, gli occhi, e molte altre fonti umane tutte espongono eterogeneità filogenetico ^4.

Protocollo

1. Preparazione di cellule Arthobacter per Phage Isolation

• Cultura Arthrobacter sp. KY3901 colonie striati su Luria Bertaini (LB) piastra agar incubata a 30 ° C per 2-3 giorni. Scegli una colonia e utilizzare un'ansa sterile per aggiungerlo a 250 ml di brodo LB in un pallone di coltura sconcertato e incubare in un incubatore agitazione a 225 rpm a 30 ° C.
• Lasciare circa 24 ore di crescita per ottenere cellule in fase esponenziale fine / inizio stazionarie per esperimenti di infezione fagi. Monitorare lo stato di crescita batterica strettamente per evitare che le cellule di entrare nel centro di stato di crescita stazionaria ....

Risultati

Per dimostrare la riproducibilità della tecnica di arricchimento migliorata per fagi Arthrobacter, 30 diversi campioni di terreno sono stati utilizzati in tempi e luoghi diversi durante la primavera e l'estate del 2014. Di questi campioni di suolo 30 fagi Arthrobacter unici sono stati ottenuti da 22 campioni di terreno raccolti utilizzando questo arricchimento procedura. La procedura standard di arricchimento prodotto fagi unici da 3 degli stessi campioni di suolo. I campioni di arricchimento posso.......

Discussione

Nonostante i molti precedenti tentativi di isolare i fagi in grado di infettare gli host Arthrobacter, abbiamo avuto poco successo utilizzando le procedure di arricchimento standard. Il metodo generalizzato di arricchimento batterica sviluppato e adattato da van Twest e Kropinski ¹⁰ per arricchire fagi da campioni ambientali resta la base per la maggior parte delle procedure di arricchimento. Prove da studi precedenti suggeriscono che i metodi di placcatura diretta hanno prodotto placche rilevabili s.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
LB Brodo in polvere	Fisher	BP9722-2	È meglio ordinarli all'ingrosso.
Agar Fisher granulato		BP1423-2	È meglio ordinarli all'ingrosso.
Filtri per siringa da 0,22 um	Fisher	09-719A
Filtri buchner da 0,22 um	Fisher	430320	È possibile ottenere più di 50 ml di liquido sostituendo accuratamente il tubo di ricezione.
Eppendorf Provette	Fisher	05-408-129
Pipette da 5 ml individuali	Fisher	13-678-11D
Provette coniche da 50 ml	Fisher	76002844
Provette coniche da 15 ml	Fisher	76002845
Pipette da 10 ml singole	Fisher	13-676-10J
Pipette da 25 ml singole	Fisher	13-676-10K
Carta da filtro qualitativa Whatman	Fisher	1001-824