Articolo metodologico

Misurazione della extracellulare Ion Flussi Utilizzando il ionoselettivo autoreferenziale microelettrodo Tecnica

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DOI:

10.3791/52782

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3 maggio 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis, 2Departamento de Biologia, Centro de Biologia Molecular e Ambiental, Universidade do Minho, 3Department of Neurology and Center for Neuroscience, University of California, Davis Imaging of Dementia and Aging Laboratory, 4Department of Ophthalmology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis

In questo articolo

Sommario

I trasportatori nelle membrane cellulari consentono la segregazione differenziale degli ioni attraverso le membrane cellulari o gli strati cellulari e svolgono un ruolo cruciale durante la fisiologia, la riparazione e la patologia dei tessuti. Descriviamo il microelettrodo autoreferenziale iono-selettivo che consente la misurazione di flussi ionici specifici in singole cellule e tessuti in vivo.

Abstract

Le cellule ottenute da animali, piante e cellule singole sono racchiusi da una barriera chiamato la membrana cellulare che separa il citoplasma dall'esterno. Strati cellulari come epiteli formano anche una barriera che separa l'interno dall'esterno o diversi compartimenti di organismi multicellulari. Una caratteristica fondamentale di queste barriere è la distribuzione differenziale di ioni attraverso le membrane cellulari o strati di cellule. Due proprietà consentono questa distribuzione: 1) membrane e epiteli mostrano permeabilità selettiva di ioni specifici; 2) gli ioni sono trasportati attraverso le pompe attraverso le membrane cellulari e strati di cellule. Queste proprietà giocano un ruolo cruciale nel mantenimento della fisiologia dei tessuti e fungono da segnalazione spunti dopo i danni, durante la riparazione, o in condizioni patologiche. L'auto-riferimento microelettrodo ionoselettivo consente misurazioni di flussi specifici di ioni come calcio, potassio o sodio a livelli cellulari e tissutali singoli. Il microelettrodo contiene un cocktail ionoforo che èselettivamente permeabile ad uno ione specifico. La soluzione di riempimento interna contiene una concentrazione insieme di ione di interesse. Il potenziale elettrico del microelettrodo è determinata dalla concentrazione fuori dello ione. Poiché la concentrazione di ioni varia, il potenziale del microelettrodo cambia in funzione del log della attività ionica. Quando spostato avanti e indietro vicino a una fonte o affondare dello ione (cioè in un gradiente di concentrazione dovuto al flusso di ioni) il potenziale microelettrodo oscilla ad una ampiezza proporzionale al flusso di ioni / gradiente. L'amplificatore amplifica il segnale microelettrodo e la produzione è registrata sul computer. Il flusso di ioni può essere calcolata dalla legge di Fick della diffusione usando le fluttuazioni potenziale dell'elettrodo, l'escursione di microelettrodo, e altri parametri quali la mobilità ionica specifico. In questo articolo, si descrive nel dettaglio la metodologia per misurare flussi ionici extracellulari con il autoreferenziale microelettrodi uno ione-selettivod presentare alcuni risultati rappresentativi.

Introduzione

Tutte le cellule animali sono circondate da una membrana a doppio strato lipidico che separa il citoplasma dall'ambiente esterno. La cella mantiene un potenziale di membrana elettrico, negativa all'interno, dal trasporto attivo di ioni 1. Il potenziale di membrana è una fonte di energia accumulata che la cellula può utilizzare per operare vari dispositivi molecolari nella membrana 2. I neuroni e le altre cellule eccitabili hanno grandi potenziali di membrana. Rapid apertura dei canali del sodio crolla il potenziale di membrana (depolarizzazione) e produce il potenziale di azione che viene trasportato lungo la lunghezza del neurone 2. Oltre a questi cambiamenti rapidi elettrici, molti tessuti e organi generare e mantenere significativi potenziali elettrici a lungo termine. Ad esempio, la pelle e dell'epitelio corneale generare e mantenere potenziali trans-epiteliali e correnti elettriche extracellulari pompando direzionale di ioni (soprattutto sodio e cloruro) 3.

tenda "> Mentre misure di corrente elettrica endogena extracellulare utilizzando la sonda vibrante 4-6 e le misurazioni dei potenziali di membrana o trans-epiteliali utilizzando il sistema microelettrodo 7-10 consentire la misurazione dei parametri elettrici di membrane cellulari e strati di cellule epiteliali, non danno indicazione della specie ionici coinvolti.

Microelettrodi con ionophore selettivo in grado di misurare la concentrazione di ioni in soluzione specifica. Gradienti ionici o flusso possono essere misurati con due o più elettrodi in posizioni diverse. Tuttavia, la deriva della tensione intrinseca di ciascuna sonda sarebbe diversa, causando misurazioni imprecise o anche il rilevamento di un gradiente che non era presente. Un singolo elettrodo utilizzato in modalità "auto-riferimento" in cui si muove a bassa frequenza tra due punti risolve questo problema. Ora il flusso di ioni può essere visto sullo sfondo di una deriva del segnale relativamente lento e stabile (vedere Figura 3B).

Il sistema di misurazione sensibile agli ioni utilizza microelettrodi autoreferenziali ionoselettivi di rilevare piccoli flussi extracellulari di ioni nei pressi di tessuti o cellule singole. Il sistema è costituito da un amplificatore che elabora il segnale dal microelettrodo e un motore passo-passo micro e guidatore a controllare il movimento del microelettrodo. Il microelettrodo ione-selettivo e l'elettrodo di riferimento che chiude il circuito sono collegati all'amplificatore tramite un headstage preamplificatore (Figura 1A). Software determina i parametri del movimento microelettrodo (frequenza, distanza) e registra anche l'uscita dell'amplificatore. Il motore passo-passo controlla il movimento tramite un microelettrodo micropositioner tridimensionale. Una bassa frequenza di oscillazione microelettrodi ione-selettivo è stato sviluppato nel 1990 per misurare il flusso di calcio specifica 11. Così come il calcio, cocktail ionofori accessibili in commercio sono ora disponibili a fare microelectrodes sensibile al sodio, cloruro, potassio, idrogeno, magnesio, nitrato, ammonio, fluoruro, litio o mercurio.

Fondamentalmente, la tecnica microelettrodo ionoselettivo autoreferenziale converte l'attività di uno ione specifico disciolto in una soluzione in un potenziale elettrico, che può essere misurata con un voltmetro. Il cocktail ionoforo è un liquido immiscibile fase (organica, lipofila) con proprietà a scambio ionico. L'ionoforo complessi selettivamente (binding) ioni specifici reversibilmente e li trasferisce tra la soluzione acquosa contenuta nel microelettrodo (elettrolita) e la soluzione acquosa in cui è immerso il microelettrodo (Figura 1D). Questo trasferimento di ioni porta un equilibrio elettrochimico e una variazione di potenziale elettrico tra il microelettrodo e l'elettrodo di riferimento è misurata dal voltmetro. La tensione è proporzionale al logaritmo dell'attività ione specifico secondo l'Nernst equation consentendo il calcolo della concentrazione di ioni (Figura 2A e B).

Attualmente, alcuni sistemi permettono la misurazione del flusso ionico usando un concetto o principio simile. Ad esempio, l'elettrodo tecnica di scansione ionoselettivo (SIET) 12,13 o il (MIFE) tecnica microelettrodo Ion Flux Stima sviluppata da Newman e Shabala 14-16 sono disponibili in commercio e ampiamente utilizzati dalla comunità di ricerca al fine di determinare ione specifico fondenti si verificano a membrana e tessuti cellulari attraverso una varietà di animali, piante e modelli a cella singola vita. Microelettrodi ionoselettivi sono stati utilizzati per misurare l'idrogeno, il potassio e il flusso di calcio attraverso le radici delle piante 17, flux cloruro nel ratto arterie cerebrali 18 e in tubetti pollinici 19, flusso di idrogeno in cellule retiniche pattino 20, flusso di calcio nelle ossa del mouse 21, ione vari flussi di ife fungine e 22 in ra 23 della cornea, e, infine, il flusso di calcio durante ferita singola cellula di guarigione 12,24. Si veda anche la seguente recensione per informazioni dettagliate sul ionoselettive autoreferenziali microelettrodi 25.

Il seguente articolo descrive in dettaglio come preparare ed eseguire la misurazione di flussi ionici endogeni extracellulari utilizzando l'autoreferenziale tecnica microelettrodi ionico selettivo a livello di singola cellula.

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Protocollo

1. Ion-selettivi autoreferenziale microelettrodo Preparazione

  1. Preparazione di microelettrodo ione-selettivi
    1. Tirare calore sottili capillari borosilicato a parete senza filamento (diametro esterno 1,5 mm 1,12 millimetri di diametro interno) con un estrattore microelettrodo.
      Nota: questo dà consigli 3-4 micron di diametro. Punte piccole hanno resistenza superiore che rende microelettrodi più sensibili al rumore elettronico ed è anche associato ad una risposta più lenta ad una variazione della concentrazione di ioni. Informazioni utili si possono trovare nel documento pubblicato da Smith et al. 26.
    2. Silanizzata gli elettrodi per rendere idrofoba la superficie interna per favorire la ritenzione del cocktail ionoforo lipofilo. Posizionare i microelettrodi in un rack metallo e calore O / N in stufa a> 100 ° C per asciugarlo. Il rack è una piastra metallica con due millimetri fori di diametro forato parte fino in fondo. Posizionare gli elettrodi nei fori punta verso l'alto con una da 250 ml gcoppa lass su di loro.
    3. Al mattino, spegnere il forno e indossando guanti isolanti, rimuovere con attenzione il rack di metallo con gli elettrodi e coppa in atto. Chiudere la porta del forno per trattenere il calore.
    4. Indossare lattice o nitrile, camice da laboratorio e occhiali di protezione. Con una plastica pipetta Pasteur, una goccia di soluzione di silanizzazione che alla base di ciascun elettrodo (mantenere il becher in luogo, utilizzare il beccuccio per l'accesso pipetta). La soluzione silanizzazione viene vaporizzato dalla piastra calda e silanizes l'interno degli elettrodi. Utilizzare una cappa aspirante chimico per questa fase. Posizionare i rack / bicchiere / elettrodi in forno caldo per qualche ora per permettere qualsiasi soluzione silanizzazione residuo di evaporare.
      Nota: per motivi di sicurezza, non accendere il forno indietro. Collocare un'etichetta sul forno indicare che non deve essere acceso in quanto può contenere vapori nocivi e infiammabili.
    5. Dopo il raffreddamento, memorizzare i microelettrodi in una memoria microelettrodo barattolo inside essiccatore bicchiere con 400 g di essiccante. Microelettrodi possono essere conservati così per molte settimane.
      Nota: Un metodo alternativo è descritto silanizzazione in Smith et al 26.
    6. Back-riempire il microelettrodo con 50 a 100 microlitri (una lunghezza di circa 1 cm) di una soluzione contenente 100 mM dello ione da misurare (vedi Tabella 1 e Figura 1B). Utilizzare una plastica Pasteur calore pipetta monouso tirato in un becco Bunsen per una multa filamento. Sciacquare la pipetta in dH 2 O in seguito per evitare il blocco.
      Nota: In alternativa, regolare la concentrazione di ioni della soluzione riempimento per abbinare la concentrazione di ioni nella soluzione esterna 27.
    7. Osservare il microelettrodo sotto un microscopio da dissezione per garantire l'assenza di bolle d'aria.
      1. Se le bolle sono presenti rubinetto microelettrodo leggermente con un'unghia mentre si tiene l'elettrodo in verticale (punta verso il basso) e / o spingere la bollas la punta applicando contropressione usando una siringa modificato con un tubo in silicone sostituire l'ago.
    8. Tip-riempire il microelettrodo con 15-20 nl (una lunghezza di 30-50 micron) di specifici ioni ionophore cocktail (vedi tabella 1). Mettere una piccola goccia di ionophore cocktail sul lato corto di un vetrino da microscopio. Osservare la punta microelettrodo sotto un microscopio da dissezione e spostarlo verso il vetrino da microscopio fino alla punta microelettrodo tocca il cocktail ionoforo solo per circa mezzo secondo. Disegnare il cocktail ionoforo nel microelettrodo dalla pressione capillare.
      Nota: evitare una lunga colonna di ionophore cocktail come questo aumenta la resistenza elettrica della sonda che può rendere sensibili alle interferenze elettroniche (rumore) e rallenta anche il tempo di risposta.
    9. Montare il microelettrodo in un supporto microelettrodo dritto con un oro 1 millimetri connettore maschio e AgCl (Ag +) filo (Figura 1B).
    10. Fissare il supporto microelettrodo allo stadio testa montata su un computer controllato tridimensionale micropositioner elettronico (Figura 1A).
    11. Posizionare la punta microelettrodo in misura soluzione appropriata per il campione da misurare (soluzione salina fisiologica, terreno di coltura, etc.) per consentire il microelettrodo si stabilizzi per un ora o due, o anche durante la notte.
  2. Preparazione dell'elettrodo di riferimento
    1. Elettrodi di riferimento (Figura 1C) sono gli stessi capillari come sopra. Tagliare il capillare con una matita diamante in cinque centimetri di lunghezza e fuoco lucidato a ciascuna estremità per 1-2 secondi in una fiamma Bunsen.
    2. Riempire questi elettrodi con ~ 200 ml di una soluzione di NaCl 3 M, CH 3 CO 2 K (acetato di potassio) o KCl con 2% di agarosio. Scegliere la soluzione a seconda dello ione da misurare (l'elettrodo di riferimento non deve contenere lo ione da misurare; vedere Tabella 1). Mescolarel'agarosio e la soluzione e calore per quasi bollire in un forno. Mescolare per sciogliere l'agarosio (la soluzione va chiaro).
    3. Attaccare l'elettrodo di riferimento a un Pasteur pipetta di plastica e disegnare la soluzione calda nel capillare.
    4. Eliminare l'elettrodo nella fredda 3 M NaCl, CH 3 CO 2 K o soluzione KCl e conservare in questa soluzione 3 M in tubi sigillati prima dell'uso. Eliminare eventuali elettrodi di riferimento con le bolle d'aria.
    5. Montare l'elettrodo di riferimento in un supporto microelettrodo retta pellet (pre-riempita con 3 M soluzione) con AgCl (Ag +) all'interno ed un oro 2 millimetri connettore maschio (Figura 1C) e fissare l'elettrodo e supporto su un micro-posizionatore manuale montato su un supporto magnetico.

2. Ion-selettivi autoreferenziale microelettrodo Calibrazione

  1. Preparare soluzioni taratura contenenti lo ione di interesse come nella soluzione di riferimento; vedi Tabella 1 . Staffa la concentrazione che è nella soluzione campione sarà in (es terreni di coltura, soluzione salina fisiologica). Cioè, una soluzione di calibrazione deve contenere una concentrazione inferiore di ioni che nella soluzione di misura, e uno superiore.
    1. Ad esempio, utilizzare salina contenente 1 mM di K +. Alla staffa questa concentrazione, sciogliere KCl polvere in acqua deionizzata ad una concentrazione di 10, 1 e 0,1 mM in diluizioni seriali. Utilizzare queste soluzioni di taratura. In alternativa, utilizzare almeno due di queste soluzioni.
  2. Immergere il microelettrodo ione-selettivo e l'elettrodo di riferimento in ciascuna soluzione di taratura e lasciare che il valore di tensione stabilizzi per 1 a 3 min prima di registrare la tensione corrispondente utilizzando il software dedicato (vedi Tabella 1).
  3. Poiché il software salva i dati (uscita dell'amplificatore) come un file txt, copiare i dati in un file di foglio di calcolo. Tracciare l'uscita microelettrodo (mV) contro il logaritmo dellala concentrazione molare di ioni (Figura 2A).
  4. Applicare una regressione lineare e calcolare il Nernst pendio, intercettare e valore R 2. Accettare il microelettrodo se la pendenza di Nernst è 58 ± 11 mV / decade per gli ioni monovalenti e 29 ± 11 mV / decade per ioni bivalenti (per cationi, la pendenza Nernst è positivo, per anioni è negativo). Inoltre, buone microelettrodi dovrebbero avere una forte correlazione lineare (R 2> 0.9; Figura 2B).
    Nota: L'uscita mV dell'amplificatore usato qui dà lettura mV con un guadagno di dieci volte. I valori devono essere diviso per un fattore di dieci.
  5. Utilizzare la formula di regressione lineare per convertire l'uscita grezza mV del microelettrodo in concentrazione di ioni reale (Figura 2B).

3. La convalida della tecnica microelettrodo ionoselettivo

  1. Preparazione di una sorgente artificiale
    1. Capillari sorgenti artificiali sono le stesse come capillarisopra. Calore tirare il capillare con un estrattore microelettrodo come al punto 1.1.1.
    2. Backfill questi capillari con 200 ml di una soluzione di NaCl, KCl 1 M, CaCl 2 2 H 2 O o pH 4 buffer. Scegliere la soluzione sorgente artificiale seconda ione da misurare (vedi Tabella 1).
      Nota: in alternativa, tirare elettrodi con grande diametro della punta (~ 20 micron) e mancia riempire con le stesse soluzioni, ma contenente 0,5-1% agarosio (agarosio impedirà qualsiasi flusso di massa di soluzione).
    3. Montare capillare sorgente artificiale su un micromanipolatore ed immergerlo nella soluzione usata per misurare il flusso dello ione nei campioni. Lasciare la sorgente artificiale nella soluzione per 30 minuti per 1 ora per permettere la stabilizzazione del gradiente.
  2. Convalida del microelettrodo ionico selettivo
    1. Immergere il microelettrodo ionoselettivo circa un centimetro di distanza dal capillare sorgente artificiale nella soluzione utilizzata per misure il flusso di ioni sui campioni e chiudere il circuito con l'elettrodo di riferimento come prima. Che il valore di tensione stabilizzi per 1 a 3 min prima di registrare la tensione corrispondente utilizzando il software dedicato per 1 a 2 min. Questo valore corrisponde al valore del tampone (in letteratura indicato anche come riferimento, sfondo o valore di bianco).
    2. Spostare il microelettrodo ionoselettivo a circa 5 micron dalla sorgente artificiale e lasciare che il valore di tensione stabilizzi per 1 a 3 min prima di registrare la tensione corrispondente utilizzando il software per 1 a 2 min.
    3. Ripetere la procedura sopra posizionando il microelettrodo selettivo ione a 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 e 1280 micron lontano dal capillare sorgente artificiale.
    4. Estrarre i dati come un file txt e copiare i valori in un foglio di calcolo.
  3. Calcolare la concentrazione di ioni corrispondente ai valori mV nello stesso modo come per i valori di calibrazione. Tracciare il valore.
    Note: Se un flusso di ioni è presente, il microelettrodo rileva una differenza di concentrazione di ioni tra le due posizioni (Figura 3B). Se la sorgente artificiale contiene più ioni della specie misurati rispetto alla soluzione, la concentrazione dovrebbe essere superiore vicino alla fonte di lontano, convalidando la capacità del microelettrodo ione-selettivo, per rilevare correttamente la direzione di un flusso di ioni (in questo caso efflusso, per un dissipatore artificiale, con una concentrazione di ioni specifico inferiore misura media, dovrebbe essere afflusso).
    1. Calcolare il flusso ionico usando la legge di Fick di diffusione: J = c μ (dc / dx) dove c è la concentrazione di ioni nella soluzione (mol cm -3), μ è la mobilità ionica (mol cm N -1 sec -1) e dc è la differenza di concentrazione a distanza dx (cm) (Figura 2C). Dati flusso di ioni di solito sono presentati in pmol cm -2 s-1 O nmol cm -2 s -1.
      Nota:.. Un metodo alternativo di calcolo flusso di ioni descritto da Smith et al 26 può essere utilizzato. Differenze principali includono l'uso del coefficiente di diffusione anziché la mobilità ionica e la sottrazione del flusso sfondo ione (anche tensione deriva o fattore di correzione) calcolata dalla misura del flusso di ioni in soluzione salina senza campione.
    2. Tracciare la media dei flussi ionici di ogni passo contro la distanza dalla sorgente (Figura 2D). Allontanandosi dalla sorgente, osservare una diminuzione esponenziale del valore di flusso convalidare la capacità del microelettrodo ione-selettivi per rilevare diversa grandezza dei flussi ionici.
    3. Effettuare la convalida sorgente artificiale volta per ogni ione specifico destinato ad essere registrata per convalidare il corretto direzione e la grandezza misurazioni con un grande segnale-nRapporto Oise.
      Nota: Ion misurazione del flusso del buffer senza campioni risulta il livello di fondo o rumore. Tipicamente, la misura del buffer non presenta alcuna chiara fluttuazione della concentrazione di ioni conduce a molto piccolo flusso che mostra direzioni variabili.

4. Preparazione della camera di misurazione

Nota: Prima di esperimenti, si consideri il campione da misurare e come il campione deve essere montato e immobilizzato per misure microelettrodi.

  1. Per Xenopus laevis misurazioni ovociti tagliati da 1 cm quadrato di una rete di 800 micron di nylon (maglia Nitex) e colla in un piatto di plastica Petri (Figura 1E).

5. Ion Flux misura

  1. Misurare la concentrazione di ioni presenti nel buffer utilizzato per eseguire le misurazioni sul campione nello stesso modo come per la soluzione di calibrazione. X. ovociti laevis richiedono Modified Ringer Mark (MMR). Dissolve NaCl, KCl, CaCl, MgCl e HEPES in acqua deionizzata per raggiungere una concentrazione finale di (mM): 100 NaCl, KCl 2, 2 CaCl, 1 MgCl e 5 HEPES. Regolare il pH del tampone a 7,5 usando NaOH.
  2. Posizionare il campione nella camera di misura e portare il microelettrodo ionoselettivo vicino al campione (circa 10 micron di distanza) utilizzando il micropositioner per definire la posizione di chiusura del microelettrodo (Figura 3A).
  3. Avviare l'escursione bassa frequenza (0,3 Hz) (100 micron) del microelettrodo tra la posizione di chiusura ed una posizione di distanza dal campione (distante) utilizzando il software dedicato. Assicurarsi che il movimento del microelettrodo è perpendicolare alla superficie del campione.
    Nota: L'escursione del microelettrodo può essere impostato sul software. Grande escursione aumenta il gradiente di lettura permettendo una facile individuazione di piccoli flussi durante il tempo di misurazione allunga l'intervallo di campionamento e diminuisce la risoluzione temporale. Vedere Figura 3A per un esempio.
  4. Avviare la registrazione tramite il software. Il microelettrodo ferma in ogni punto ed il potenziale elettrico in mV è registrato sul computer. Ottenere misurazioni per almeno 2 minuti, consentendo la stabilizzazione del segnale. Per gli esperimenti time-lapse brevi, registrano potenziali variazioni in corrispondenza della posizione di interesse per tutto il corso del tempo.
  5. Estrarre i dati come un file txt e copiare i valori in un foglio di calcolo.
  6. Calcolare la concentrazione di ioni corrispondente ai valori mV nello stesso modo come per i valori di calibrazione. Tracciare il valore.
    Nota: Se un flusso di ioni è presente, il microelettrodo rileva una differenza di concentrazione di ioni tra le due posizioni (Figura 3B).
  7. Calcolare il flusso ionico usando la legge di Fick di diffusione come prima (fase 3.3.1).
  8. Ripetere la misura tampone prima di misurare un nuovo campione e ripetere la procedura di misura del flusso e di calcolo per ogni nuovocampione.

6. Analisi statistica dei dati e presentazione

  1. Verificare gli effetti indipendenti della posizione e / o del tempo su flussi ionici sotto la condizione di controllo che utilizzano un modello ANCOVA con effetti misti 28.
    Nota: L'analisi della covarianza (ANCOVA) è un modello lineare generale che mescola regolare ANOVA e regressione, consentendo misure sia categoriali e continui a essere utilizzati come variabili indipendenti. Inoltre, in presenza di errori correlati indotti da misure ripetute per effetti nidificati individuali ed eventuali, modelli ad effetti misti vengono utilizzati per modellare stime accurate sia effetti fissi e casuali.
  2. Calcola confronti a coppie con Student t-test tra i livelli di gruppo con correzione di Bonferroni per test multipli 28.
  3. Generare grafici a scatole per riassumere misure di flusso di ioni a seconda della posizione e del tempo. Includere valori di p dalla t Student coppie descrittosopra (Figura 3D) e indicare i livelli di significatività dei valori p come segue: *: p <0.05; **: P <0.01; ***: P <0.001 29

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Risultati

Abbiamo precedentemente dimostrato che l'influsso di calcio compare dopo singola cellula ferendone 24. Abbiamo quindi chiesto se gli altri flussi ionici si verificano su di ferimento singola cellula. Abbiamo usato la X. laevis ovocita, un modello consolidato per singola cella la guarigione delle ferite 30-34 e registrazione elettrofisiologica 24,35-39. È interessante notare, gli ioni potassio sono più concentrati all'interno X. laevis ovociti (circa 110 mm)

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Discussione

Le fasi più critiche per la misurazione successo flussi ionici extracellulari in vivo sono: la riduzione del rumore, la corretta realizzazione dell'elettrodo microelettrodi ionoselettivi e riferimento, e il posizionamento del campione e due elettrodi.

Per minimizzare il rumore, il sistema di registrazione dovrebbe essere collegato a terra (massa) gabbia di Faraday preferibilmente con un (isolamento dalle vibrazioni) Tavolo metallo con ripiano che è anche collegata a terra. Inolt...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione della National Science Foundation MCB-0951199, e in parte dalla sovvenzione NIH EY01910, dalle sovvenzioni del California Institute of Regenerative Medicine RB1-01417 e dalla sovvenzione della Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) SFRH/BD/87256/2012.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
IonAmp   BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAnessunamplificatore creato dal BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Un sistema simile può essere acquistato da " La funzione XBL è importante" (http://www.xuyue.org/) o da " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) o da Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
IonAmp32   BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAnessunosoftware creato da BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Un sistema simile può essere acquistato da " La funzione XBL è importante" (http://www.xuyue.org/) o da " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) o da Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Preamplificatore per stadio principale  BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAINA116BSR Voltage Follower INA116, progettato dal BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Un sistema simile può essere acquistato da " La funzione XBL è importante" (http://www.xuyue.org/) o da " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) o da Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
MicroStep Driver  BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAnessunotre driver MicroStep sono necessari per il posizionamento X, Y e Z; creato dal BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Un sistema simile può essere acquistato da " La funzione XBL è importante" (http://www.xuyue.org/) o da " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) o da Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Microposizionatore manuale   Mondo Strumenti di Precisione Modello KITE-RUn sistema simile può essere acquistato da Elettronica applicabile(http://www.applicableelectronics.com/)
Supporto magnetico     World Precision InstrumentsModello M10Un sistema simile può essere acquistato da Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Tabella di isolamento dalle vibrazioni   Newport Inc.        Modello VW-3036-OPT-023040Sistema simile può essere acquistato da Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Parte di tre microposizionatori dimensionali: staffa angolare, 90 gradi, facce scanalateNewport Inc.        Modello 360-90L'assemblaggio dei tre microposizionatori dimantionnal richiede anche tre motori rotativi elettrici per il controllo X, Y, Z, braccio di montaggio MPH-1 con montante ad angolo regolabile MCA-2 e vari connettori Newport e viti da avvitare sulla tavola vibrante
Parte del microposizionatore a tre dimensioni: Peg-Joining Dovetail Stage 0,5 pollici X TravelNewport Inc.        460PD-Xnessuno
Parte di tre microposizionatori dimensionali: Stadio lineare a montaggio rapido, 0,5 pollici XY TravelNewport Inc.460A-XYnessuno
Capillari in vetro borosilicato a parete sottile Kwik-Fil senza filamento Mondo Strumenti di Precisione TW150-4nessuno
Estrattore di elettrodi Narishige  PC-10nessuno
Rack in metalloRealizzato internamentenessunoPortaelettrodo in metallo realizzato internamente praticando fori larghi 2 mm e mezzo centimetro distanziati in una base rettangolare di 10 cm per 15 cm in acciaio
FornoQLModello 10 Forno da laboratorionessuno
Soluzione di silanizzazioneSigma-Aldrich85126Pericoloso, maneggiare come raccomandato dal fornitore 
Piastra Petri in vetro; PyrexFisher Scientific316060nessuno
Barattolo per elettrodi/micropipetteWorld Precision Instruments E215nessuno
Essiccatore in vetroFisher Scientific08-595EContiene essiccante Drierite (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Metti la vaselina sulla guarnizione per renderla ermetica.
Pipetta Pasteur in plastica Fisher Scientific11597722nessuno
Bruciatore BunsenFisher ScientificS97329nessuno
Vetrino per microscopioSigma-AldrichS8902nessuno
Supporto per microelettrodo drittoWarnerInstruments QSW-A15Pcon connettore maschio dorato da 1 mm e filo Ag/AgCl
Supporto per microelettrodo dritto World Precision InstrumentsMEH3Scon un pellet AgCl(Ag+) all'interno e un connettore maschio in oro da 2 mm.
6 cm piastra PetriVWR60872-306nessuno
Rete NitexDynamic Aqua-Supply Ltd.NTX750nessuno
Colla; Loctite epoxyVWR500043-451Miscelare la colla e l'indurente in parti uguali in una navicella di pesatura in plastica e mescolare accuratamente. Si fissa rapidamente ma lascia in RT per 24 ore per una polimerizzazione completa
Acqua deionizzata Sigma-Aldrich99053nessuno
Cloruro di sodioSigma-AldrichS7653nessuno
Cloruro di potassioSigma-AldrichP9333nessuno
Cloruro di calcioSigma-AldrichC1016nessuno
Cloruro di magnesioSigma-AldrichM8266nessuno
HepesSigma-AldrichH3375nessuno
Sodio IdrossidoneSigma-AldrichS8045nessuno
Acetato di potassioSigma-AldrichP1190nessuno
AgarosioSigma-AldrichA9539nessuno

Riferimenti

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