Articolo metodologico

Ablazione specifiche Hepatocyte in Zebrafish allo Studio biliare-driven Liver Regeneration

DOI:

10.3791/52785

⸱

20 maggio 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology, McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per aiutare a valutare i meccanismi molecolari alla base della rigenerazione epatica guidata dalle vie biliari del pesce zebra, abbiamo stabilito un modello di danno epatico in cui gli epatociti che esprimono nitroreduttasi vengono geneticamente ablati dopo il trattamento con metronidazolo. In questo protocollo, descriviamo come manipolare, monitorare e analizzare abilmente l'ablazione degli epatociti e la rigenerazione epatica indotta dalle vie biliari.

Abstract

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Il fegato ha una grande capacità di rigenerarsi. Gli epatociti, le cellule parenchimali del fegato, può rigenerare in uno di due modi: rigenerazione epatica hepatocyte- o biliare-driven. In rigenerazione del fegato epatociti-driven, epatociti rigeneranti sono derivati ​​da epatociti preesistenti, mentre, nella rigenerazione biliare-driven, epatociti rigeneranti sono derivati ​​da cellule epiteliali biliari (BECS). Per la rigenerazione del fegato epatociti-driven, ci sono ottimi modelli di roditori che hanno significativamente contribuito alla attuale comprensione della rigenerazione epatica. Tuttavia, non esiste tale modello roditore per la rigenerazione epatica biliare-driven. Recentemente abbiamo riportato su un modello di danno epatico zebrafish in cui BEC ampiamente danno luogo a epatociti sul grave perdita degli epatociti. In questo modello, gli epatociti sono specificamente asportate da un mezzo di farmacogenetica. Qui vi presentiamo in dettaglio i metodi per l'ablazione epatociti e di analizzare il processo di rigenerazione epatica BEC-driven.Questo modello di ablazione specifici epatociti può essere ulteriormente utilizzato per scoprire i meccanismi molecolari e cellulari alla base della rigenerazione epatica biliare-driven. Inoltre, questi metodi possono essere applicati agli schermi chimici per identificare piccole molecole che aumentano o sopprimono rigenerazione epatica.

Introduzione

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Il fegato è un organo altamente rigenerativa. Durante la rigenerazione del fegato, rigenerante epatociti, le cellule parenchimali del fegato, sono derivati ​​da epatociti preesistenti (rigenerazione del fegato epatociti-driven) o BEC (rigenerazione epatica biliare-driven) 1,2. Danno epatico solito provoca la proliferazione di epatociti preesistenti; tuttavia, quando la proliferazione degli epatociti è compromessa, BEC può contribuire agli epatociti 2-4. Queste due modalità di rigenerazione epatica sono clinicamente significativi. Dopo la rimozione chirurgica di una porzione di fegato umano (ad esempio, a causa di tumori epatici o donatori di fegato vivi), epatociti nel fegato residuo proliferano per recuperare la massa epatica persa. Al contrario, nei pazienti con malattie epatiche gravi, epatociti proliferazione è notevolmente compromessa, in modo che BECs o cellule progenitrici epatiche (LPC) sembrano contribuire a epatociti rigeneranti 5,6. Il modello di epatectomia roditore 2/3 parziale, in cuiepatociti proliferano a recuperare la massa epatica perso, ha contribuito in modo significativo l'attuale comprensione di epatociti-driven rigenerazione epatica 7,8. Tuttavia, non esiste un modello roditore valido che epatociti rigeneranti sono derivati ​​principalmente da BEC. Sebbene diversi modelli di tossina roditori fegato hanno portato all'identificazione di biliare-driven rigenerazione epatica 2-4, recenti studi lineage tracing in topi indicano un contributo minimo di BEC per rigenerare epatociti in questi modelli 9,10. Alcuni dei modelli di pregiudizio roditori fegato, tra cui epatectomia parziale 11-13 e paracetamolo indotto danni al fegato 14,15, sono state applicate a zebrafish e ha portato alla identificazione di nuovi geni o percorsi implicati nella rigenerazione epatica. Tuttavia, epatociti-driven, ma non BEC-driven, la rigenerazione del fegato si verifica in questi modelli danno epatico zebrafish. Pertanto, un modello di danno epatico romanzo in cui BEC contribuiscono ampiamente a regeneratepatociti zione è necessario per una migliore comprensione della rigenerazione epatica BEC-driven.

Gli obiettivi generali del modello di ablazione epatociti qui descritte sono (1) per generare un modello di danno epatico nel quale BEC contribuiscono ampiamente a epatociti rigeneranti, e (2) chiarire i meccanismi molecolari e cellulari alla base di rigenerazione epatica BEC-driven. Abbiamo ipotizzato che la gravità del danno determina la modalità di rigenerazione epatica; quindi, abbiamo previsto che la rigenerazione epatica biliare-driven avrebbe avviato su gravi lesioni degli epatociti. Per verificare questa ipotesi, abbiamo sviluppato un modello danno epatico zebrafish generando una linea transgenica, Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931, che altamente esprime nitroreduttasi batterica (NTR) fusa con proteina fluorescente ciano (PCP) sotto il fabp10a specifiche epatociti promoter. Poiché NTR converte il profarmaco non tossico, metronidazolo (Mtz), in un farmaco citotossico, che l'ablazione solo destinato NTR-cellule che esprimono 16-18, in questo caso, gli epatociti. Manipolando la durata del trattamento Mtz, il grado di epatociti ablazione può essere controllato. Utilizzando questo modello, abbiamo recentemente riportato che su di una grave perdita epatociti, BEC ampiamente danno luogo a rigeneranti epatociti 19, che è stato ulteriormente confermato da altri due studi indipendenti 20,21. Pertanto, rispetto al suddetto roditori e modelli danno epatico zebrafish, il nostro modello ablazione epatociti è più vantaggiosa per studiare la rigenerazione epatica BEC-driven.

Questo protocollo descrive la procedura per eseguire esperimenti di rigenerazione del fegato utilizzando il modello di epatociti di ablazione zebrafish. Questo modello sarà opportuno per determinare i meccanismi alla base di rigenerazione epatica biliare-driven e per schermi chimici per identificare piccole molecole in grado di reprimere o aumentare la rigenerazione del fegato.

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Protocollo

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Zebrafish sono state sollevate e allevati secondo procedura standard; Esperimenti sono stati approvati dalla University of Pittsburgh Istituzionale Animal Care and Use Committee.

1. Preparazione di embrioni / larve

  1. Per condurre accoppiamenti a tempo, impostare adulti maschi e femmine Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931 pesci hemizygous o omozigoti O / N e inserire un divisore tra di loro. Rimuovere questo divisore il mattino seguente quando si desidera accoppiamento. Raccogliere gli embrioni da sforzare l'acqua con un colino a maglia fine di plastica.
  2. Girare il filtro a testa in giù e risciacquare la superficie a rete con un bel flusso di acqua uovo erogata da un flacone. Trasferire 100 embrioni in una capsula di Petri 100 mm con 25 ml di acqua uovo. Mantenere non più di 100 embrioni per capsula di Petri e aumentare a 28 ° C.
  3. Per inibire la pigmentazione, aggiungere feniltiourea (PTU) nelle capsule di Petri prima di 10 ore dopo la fecondazione (HPF), ed aumentare embryos / larve fino a 80 HPF. La concentrazione finale di PTU è 0,2 mM. ATTENZIONE: PTU è tossico. Utilizzare in conformità con le linee guida appropriate di gestione.
  4. Anestetizzare le larve aggiungendo 3-amino etil estere benzoico (Tricaine), ad una concentrazione finale di 0,016%, nelle piastre di Petri. Quindi, utilizzando un microscopio a epifluorescenza, larve sorta CFP-positivi. Utilizzare larve con una dimensione del fegato simile e scartare quelli con un fegato più piccolo o più grande.
    NOTA: qualsiasi larve CFP-positivi, indipendentemente dall'intensità, può essere utilizzato perché non c'è differenza nel grado di epatociti ablazione tra le larve emizigote e omozigote. ATTENZIONE: tricaine è tossico. Utilizzare in conformità con le linee guida appropriate di gestione.
  5. Rimuovere l'acqua uovo contenente Tricaine e aggiungere acqua uovo integrato con 0,2 PTU mm. Tenere il embrioni / larve a 28 ° C.

2. Mtz Trattamento

  1. Preparare fresco soluzione Mtz 10 mM sciogliendo 0,171 g di polvere in 1 MtzAcqua uovo 00 ml integrato con 0,2% PTU mM DMSO e 0,2. Per sciogliere completamente la Mtz, mescolare la soluzione a temperatura ambiente, con una rapida agitazione per 20-30 minuti. Per aiutare solubilizzare Mtz e per migliorare Mtz permeazione in larve, aggiungere DMSO durante la preparazione Mtz. ATTENZIONE: l'esposizione prolungata o un aumento della concentrazione di Mtz è tossico. Utilizzare in conformità con le linee guida appropriate di gestione.
  2. Separare le larve in gruppi di controllo e sperimentali per il trasferimento di numero desiderato di larve in due diversi 100 mm piatto di Petri o un piatto multi-bene. Per il gruppo sperimentale, mantenere le larve in 10 soluzione Mtz mM; per il gruppo di controllo, tenerli in acqua uovo contenente 0,2% DMSO.
  3. Coprire le piastre o capsule di Petri contenenti la soluzione Mtz con un foglio di alluminio per evitare che la foto-inattivazione di Mtz, e incubare a 28 ° C. La durata del trattamento Mtz dipende dallo stadio larvale e la linea transgenica.
  4. Per osservare simile grave ablazione epatociti nella Tg (fabp10a: CFP-NTR) linea, trattare le larve con la soluzione da Mtz da 3,5 giorni dopo la fecondazione (dpf) (per una durata di 36 ore) e da 5 dpf (per una durata di 24 ore).

3. Analisi delle vie biliari-driven rigenerazione del fegato

  1. Alla fine del periodo di ablazione, rimuovere la soluzione Mtz dalle piastre. Lavare le larve Mtz trattati aggiungendo 25 ml di acqua uovo. Agitare la piastra 2-3 volte per lavare le larve prima di gettare l'acqua uovo. Ripetete per tre volte e poi immergere le larve di nuovo in acqua uovo. Per evitare edema cardiaca e morte larvale nelle larve Mtz trattati, aggiungere una minore concentrazione di Tricaine, ad una concentrazione finale di 0,008%, per immobilizzare le larve.
  2. Per l'analisi del fegato, esaminare la dimensione del fegato delle larve Mtz trattati sotto un microscopio a epifluorescenza con il filtro della PCP. Valutare i livelli di ablazione epatociti in base alle dimensioni del fegato relative: grande (non ablazione; 0-10% larve), medio (parzialmente ablated; 10-20%), e molto piccola (completamente ablated; 80-90%).
  3. Rimuovere le larve con fegati non ablazione o parzialmente ablazione. Tenere larve solo con un minuscolo fegato, che è indicativo di grave ablazione epatociti. Per l'analisi del fegato presso la rigenerazione 0 punto tempo hr (R0h), raccogliere le larve dopo Mtz washout e CFP ordinamento. In caso contrario, mantenere le larve ordinati in acqua uovo integrato con 0,2 PTU mm, fino pronto per la raccolta.
  4. Trasferire larve raccolte in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e sostituire l'acqua uovo con la soluzione di fissaggio del 3% formaldeide in tampone PEM. Incubare la provetta su un rotatore O / N a 4 ° C.
  5. Sostituire la soluzione di fissaggio con 1 ml di PBSDT e ruotare il tubo contenente le larve sul rotatore per 5 min.
  6. Trasferire le larve fissato in una capsula di Petri 100 millimetri contenente PBSDT e usando pinze, rimuovere manualmente tuorlo e pinne pettorali sotto un microscopio da dissezione. Trasferire fino tp 20 larve sezionato in una provetta da 1,5 ml.
  7. Sostituisci soluzione PBSDT con 1 ml di soluzione di blocco e Rock il tubo su un rotatore a temperatura ambiente per 2 ore.
  8. Sostituire soluzione bloccante con 100 ml di soluzione bloccante contenente anticorpi primari. Lentamente rock il tubo su un rotatore O / N a 4 ° C.
  9. Rimuovere la soluzione di anticorpo primario e lavare con PBSDT 5 volte per 10 minuti ogni volta. Quindi aggiungere 100 ul di soluzione bloccante contenente anticorpi secondari e rock su un rotatore a temperatura ambiente per 2 ore.
  10. Lavare 5 volte con PBSDT per 10 minuti ogni volta a RT da dondolo su un rotatore.
  11. Orientare le larve lateralmente su un vetrino e aggiungere una goccia di mezzo di montaggio. Coprirli con cura con un vetro di copertura e sigillare il vetro di copertura con un lucidatore del chiodo. Ora, è pronto per la microscopia confocale.

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Risultati

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Trattamento Mtz per 36 ore (A36h, A sta per l'ablazione) 3,5-5 dpf ridotto drasticamente le dimensioni del fegato (Figura 1B). Dopo Mtz washout, considerato come l'inizio della rigenerazione epatica (R), forte fabp10a: CFP-NTR e fabp10a: espressione DsRed riapparso in 30 ore (Figura 1B). La rete biliare intraepatica, valutata mediante espressione di Alcam che è presente nella membrana di BECs 22, inizialmente crollata ma fu ripristinata al 54 hr post-washout...

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Discussione

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Grave, ma non mite, epatociti ablazione suscita rigenerazione epatica biliare-driven. Pertanto, dopo il trattamento Mtz e washout, è importante esaminare la dimensione del fegato delle larve Mtz trattato, che può essere valutata intrinseca CFP fluorescenza dal fabp10a: CFP-NTR transgene. Poiché una piccola percentuale di larve Mtz trattati visualizzerà non ablazione (0-5%) o parzialmente ablato (10-20%) fegati, è essenziale per risolvere e solo analizzare le larve con un piccolo fegato, che è indicativo di grav...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano i dottori Hukriede e Tsang per le discussioni. M.K. è stato sostenuto da una borsa di formazione NIH (T32EB001026). Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dell'American Liver Foundation, della March of Dimes Foundation (5-FY12-39) e del NIH (DK101426) a D.S.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Estere etilico (Tricaina) dell'acido benzoico 3-amminoicoin polvere Sigma-AldrichA5040Fare lo 0,4% (15 mM) di tricaina : Portare 0,4 g di tricaina a 100 ml con acqua d'uovo. Regolare a pH 7. 
Dimetil solfossido (DMSO)Sigma-AldrichD8418
MetronidazoloSigma-AldrichM1547
Triton X-100Sigma-AldrichT8532
FormaldeideSigma-Aldrich252549
Solfato di calcio diidratoSigma-AldrichC3771
N-Feniltiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629
Supporti di montaggio (Vectashield)Vector LaboratoriesH-1000
100 x 15 mm piastra di PetriDenville Scientific Inc.Smalto trasparente M5300
Fisher Scientific50949071
pinze finiFine Science Tools11251-20Dumont #5 
vetrinoFisher Scientific12-544-1
vetrino coprioggettiFisher Scientific12-540-A e 12-542-A18 x 18 mm
zn-5 (topo anti-Alcam)ZIRCzn-51:10 diluizione
capra anti-Hnf4aSanta Cruzsc-6556 (C-19)1:50 diluizione
ratto anti-RFPAllele BiotechnologyACT-CM-MRRFP101:300 diluizione
AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L)Jackson laboratories705-605-147Diluizione 1:500
AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)InvitrogenA21240Diluizione 1:500
Cy3 donkey anti-ratto IgGJackson laboratories712-165-1501:500 diluizione
microscopio LeicaMicrosystemsS6F
microscopio a epifluorescenzaLeica MicrosystemsM205FA
microscopio confocaleCarl ZeissLSM700
acqua d'uovo0,3 g/L di sali marini ' Oceano istantaneo' e 0,5 mM CaSO4 in acqua distillata.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
[intestazione]
10X PBS25.6 g Na2HPO4· 7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Portare a 1 L con acqua distillata. Regolare il pH 7.  Autoclave per 20 min a 121°C.
1X PBSDT0,2% Triton X-100 e 0,2% DMSO in 1 X PBS.
tampone30,2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Portare a 1 L con acqua distillata. Regolare il pH 7.
SoluzioneMescolare 1 ml di siero di cavallo inattivato termicamente con 9 ml di 1X PBSDT.
PEM bloccante

Riferimenti

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