Cosa fare e cosa non fare nella preparazione di Muscle criosezioni per l'analisi istologica

Sommario

Qui dimostriamo i metodi più efficaci per il congelamento, l'inclusione, la criosezione e la colorazione delle biopsie muscolari per evitare il congelamento degli artefatti.

Abstract

Valutazione istologica delle biopsie muscolari ha servito come uno strumento indispensabile per la comprensione dello sviluppo e la progressione della patologia di malattie neuromuscolari. Tuttavia, al fine di fare ciò, cura adeguata deve essere presa quando asportare e conservare tessuti per ottenere la colorazione ottimale. Un metodo di conservazione del tessuto comporta fissa tessuti in formaldeide e poi incorporare con la cera di paraffina. Questo metodo mantiene la morfologia bene e consente la memorizzazione a lungo termine a temperatura ambiente, ma è pesante e richiede una gestione di sostanze chimiche tossiche. Inoltre, i risultati di fissazione formaldeide in antigene cross-linking, che richiede protocolli di recupero antigene per immunocolorazione efficace. Al contrario, sezionamento congelati non richiede fissazione e mantiene quindi biologica dell'antigene conformazione. Questo metodo fornisce anche un netto vantaggio in breve tempo di girarsi, il che rende particolarmente utile in situazioni che necessitano di una rapida valutazione istologica come intraoperativa biopsie chirurgiche. Qui si descrive il metodo più efficace di preparazione biopsie muscolari per la visualizzazione con diverse macchie istologiche ed immunologiche.

Introduzione

L'esame di istologia muscolare gioca un ruolo fondamentale nella comprensione dei diversi tipi di malattie neuromuscolari ^1-4. Quando combinato con altre tecniche, permette ai ricercatori di avere una migliore idea della manifestazione e la progressione della patologia e possono anche essere essenziale per valutare l'efficacia di un intervento terapeutico ^5-10. Tuttavia, per essere precisi, i tessuti devono essere conservati in modo appropriato in modo da preservare lo stato fisiologico immediatamente prima escissione. Ciò richiede grande attenzione durante la rimozione, la conservazione, il sezionamento, e la colorazione.

Protocollo

1. Tissue Raccolta e congelamento dei tessuti muscolari

1. Euthanize il mouse con un sovradosaggio di isoflurano (2-cloro-2- (difluorometossi) -1,1,1-trifluoro-etano). Eseguire questo passaggio in una cappa aspirante e utilizzare un metodo di contenimento secondario, come un essiccatore o una campana di vetro contenente un batuffolo di cotone imbevuto di isoflurano.
2. Confermare la morte con fermezza spremitura zampa. Utilizzare un metodo secondario dell'eutanasia come dislocazione cervicale.
3. Bagnare il pelo con il 70% di alcool per ridurre l'incollaggio di ciocche di capelli sciolti sui muscoli. Sbucciare la pelle di dosso l'art....

Risultati

Il set-up per la raccolta e il congelamento dei tessuti può essere visto in Figura 1. Tessuti asportati devono essere memorizzati su una garza imbevuta di PBS per evitare l'essiccazione (Figura 1A). Quando vengono selezionati i tessuti da utilizzare per l'analisi istologica devono essere immersi in OCT e disposti su stampo crio nell'orientamento corretto e più vicino alla lunghezza fisiologica possibile per garantire morfologia accurata (Figura 1B). Slurry d.......

Discussione

Istologia e immunoistochimica sono stati utilizzati come strumenti chiave per comprendere la manifestazione e la progressione della patologia in vari disturbi neuromuscolari. Classicamente, biopsie muscolari sono stati fissati prima di formaldeide e poi integrati con paraffina. Mentre fissazione formaldeide conserva l'architettura dei tessuti e permette lo stoccaggio dei tessuti e il trasporto a temperatura ambiente, è inattiva anche enzimi e proteine ​​legami crociati che richiedono ulteriori misure per raggiungere.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Criostato	Leica CM 1850	Leica Microsystems Inc.	Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., telefono dell'ufficio 1-800-248-0123 Alternativa: Richard Allen Scientific
Microscopio	Nikon Eclipse 50i	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Telefono: 1-631-547-8500 Alternativa: Olympus
Software di analisi delle immagini	Nikon Imaging Software Basic Research	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Telefono: 1-631-547-8500 Alternative: Immagine J, Metamorph
Isoflurano	14043-220-05	JD Medical Dist. Co., Inc.	1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A.
OTTOBRE	4583	Sakura Inc.	Torrence, CA 90501 U.S.A. Fonte alternativa: Leica Microsystem
Freeze It	23-022524	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific
Stampo in tessuto monouso	22-363-554	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific
Colorfrost plus slides	9991001	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific
Acetone	650501-4L	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific
Alcol etilico	HC-1300-1GL	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific
2-metilbutano	M 32631-SL	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific
Xylene	HC-7001GA	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific
Cytoseal 280	8311-4	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific
Hematoxylin Gill #3	CS402-1D	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific
Eosin 6766007		Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific