Articolo metodologico

Atimico Rat modello per la valutazione di Engineered legamento crociato anteriore Innesti

DOI:

10.3791/52797

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26 marzo 2015

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1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles, 2Department of Bioengineering, University of California Los Angeles

In questo articolo

Sommario

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I modelli animali sono strumenti importanti per la valutazione degli innesti di ingegneria tissutale. Questo articolo presenta il protocollo per la preparazione di un innesto polimerico biodegradabile elettrofilato per l'uso nell'ingegneria tissutale del legamento crociato anteriore, nonché un protocollo chirurgico per l'impianto in un modello di ratto.

Abstract

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La rottura del legamento crociato anteriore (LCA) è una lesione legamentosa comune che spesso richiede un intervento chirurgico perché il LCA non guarisce bene senza intervento. Le attuali strategie di trattamento includono la ricostruzione dei legamenti con autotrapianto o allotrapianto, che hanno ciascuno i propri limiti associati. Pertanto, c'è interesse nella progettazione di un innesto di ingegneria tissutale da utilizzare nella ricostruzione del LCA. Descriviamo la fabbricazione di un innesto polimerico elettrofilato per l'uso nell'ingegneria tissutale ACL. Questo innesto di policaprolattone è biocompatibile, biodegradabile, poroso ed è composto da fibre allineate. Poiché per valutare un tale innesto è necessario un modello animale di questo tipo, questo articolo descrive un modello intra-articolare di ratto atimico di ricostruzione del LCA che può essere utilizzato per valutare innesti ingegnerizzati, compresi quelli seminati con cellule xenogeniche. Vengono presentati i risultati rappresentativi dei test istologici e biomeccanici a 16 settimane dopo l'intervento, con gli innesti testati immediatamente dopo l'impianto e gli ACL nativi controlaterali che fungono da controlli. Il presente studio fornisce un modello animale riproducibile con cui valutare gli innesti di LCA di ingegneria tissutale e dimostra il potenziale di un approccio di medicina rigenerativa al trattamento della rottura del LCA.

Introduzione

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Rottura del legamento crociato anteriore (LCA) è uno dei più comuni lesioni legamentose del ginocchio 1. Perché la rottura del LCA è in grado di guarire senza intervento chirurgico, le limitazioni nelle attività della vita quotidiana e la partecipazione a sport di auto oltre 175.000 pazienti di sottoporsi ad intervento chirurgico ogni anno 2, con un costo stimato di un miliardo di dollari l'anno 3. Attualmente, sia autologo o allogenico tendine viene utilizzato per la ricostruzione del legamento. Anche se gli alti tassi di successo possono essere realizzati sia con autologo e allogenico sostituzione, gravi complicanze sono associate con queste opzioni di ricostruzione 4. Tessuto autologo è associata a morbilità del sito donatore ed è limitata dell'offerta, in particolare nei casi di re-rotture o lesioni multi-legamentosa. D'altra parte, il tessuto allotrapianto è collegata con l'integrazione dell'innesto ritardato, risposta infiammatoria avversa, rischio teorico infettiva, e supp limitataly 5. Sintetici innesti non degradabili sono stati sviluppati negli anni 1970 e 1980, ma sono stati ostacolati dalla rottura prematura trapianto, reazioni del corpo estraneo, osteolisi, e sinovite 6. Come risultato di questi gravi problemi, non esistono attualmente innesti sintetici disponibili per uso clinico negli Stati Uniti.

A causa di queste limitazioni con opzioni innesto esistenti e ai recenti sviluppi nel campo della biologia, ingegneria e medicina rigenerativa, c'è stato un grande interesse per una soluzione di ingegneria tessutale per ACL innesto. Strategie di ingegneria tissutale attuali impiegano materiali biologici e sintetici degradabili per consentire di crescita interna del tessuto ospite, evitando le limitazioni associate con materiale sintetico permanente dell'impianto 7.

Policaprolattone (PCL) è un polimero biodegradabile che è approvato dalla FDA per un certo numero di applicazioni mediche, tra cui barriera adesione e medicazione 8, che è stato used in una vasta gamma di applicazioni tra cui vascolare, osso, cartilagine, nervi, pelle, e l'ingegneria dei tessuti dell'esofago 5,9-16. Biocompatibilità favorevole, relativamente lunga in-vivo emivita, un'adeguata resistenza meccanica, ed elevata elasticità contribuisce alla popolarità di questo polimero in ingegneria dei tessuti. In un modello di roditore di guarigione delle ferite, impiantato PCL elettrofilate ha dimostrato di essere non-immunogenico e integrare nel tessuto locale, senza reazioni avverse 13. L'immagine SEM di elettrofilate PCL è mostrato in Figura 1.

Con corrente FDA regolamentazione norme, l'efficacia e la sicurezza in entrambi i modelli piccoli e grandi animali sarebbe richiesto per un PCL o qualsiasi altro progettato innesto ACL a muoversi in studi clinici negli Stati Uniti. Inoltre, le condizioni in vivo spesso può aumentare le proprietà di un trapianto di tessuto ACL in vitro di ingegneria. Un modello di ratto di ricostruzione del LCA autologo con flessore digitorum lungo del tendine è stato descritto in precedenza, in cui l'ACL nativo è stato reciso, femore e tibia tunnel sono stati perforati e l'innesto è stato approvato e fissato in posizione con sutura 17-22. In questo articolo, descriveremo una modifica di questo modello per la valutazione delle sostituzioni ACL ingegnerizzati piuttosto che per ricostruzione basata autograft-(Figura 2).

Anche se esistono molti modelli animali per l'ingegneria dei tessuti del legamento, il ratto è vantaggioso rispetto ai modelli più grandi per una serie di motivi. Questi vantaggi comprendono più facile allevamento e maneggevolezza, un minor numero di considerazioni etiche, e ridotto 17,23 costo. Inoltre, il modello di ratto è stato ampiamente utilizzato come modello per la rigenerazione tissutale ortopedici, tra cui la cartilagine, tendini, ossa e del tessuto ingegneria 24. In particolare, ratti nudi atimici sono stati scelti a causa della loro mancanza di cellula-mediata risposta immunitaria 25, consentendo l'eventuale fissaggio ocellule del donatore xenogeniche f in questo modello per migliorare ulteriormente l'innesto ingegnerizzato in futuro. In questo metodo di carta, descriviamo la fabbricazione e l'impianto chirurgico di un acellulare, biodegradabile trapianto polimero in un modello di ratto atimico di ricostruzione del LCA.

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Protocollo

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NOTA: Tutti gli interventi chirurgici su animali sono stati approvati dal personale e veterinaria comitato uso locale prima di iniziare gli esperimenti.

1. Preparazione di elettrofilate policaprolattone Ponteggi

  1. Pesare e sciogliere estere grado medicale poli terminato (ε-caprolattone) in granuli in 1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo per creare un 10% w / w soluzione del polimero PCL. Lasciate che il mescolare soluzione con un piatto mescolare per almeno 3 ore per garantire una soluzione omogenea.
  2. Electrospin la soluzione PCL per creare un bracciale di fibre PCL altamente allineati per ponteggio fabbricazione.
    1. Preparare la configurazione electrospinning in cappa con il ventilatore sempre acceso. Questo consiste in una grande scatola acrilica che servirà come mezzo vuoto isolato per il processo electrospinning e ha punti di ingresso per la soluzione di fonte PCL azionato da una sorgente di tensione, la raccolta mandrino a motore, e una porta di vuoto. Pulire il Acrylibox c accuratamente con etanolo e coprire tutte le superfici con fogli parafilm per rimuovere eventuali impurità che possono compromettere la qualità del prodotto elettrofilate.
    2. Caricare circa 3 ml della soluzione di cui sopra in una siringa da 10 ml con un ottuso chiuso 18 G, 1 ½ pollice ago. Rimuovere eventuali bolle d'aria spingendo la siringa up. Soluzione serratura in una pompa a siringa programmabili. Inserire l'ago attraverso un piccolo foro nella scatola acrilica lasciando circa ½ pollice dell'ago all'esterno della scatola acrilica per fissaggio del filo sorgente di tensione.
    3. Utilizzare un 30 millimetri di rotazione mandrino del tornio, come il collettore per le fibre PCL altamente allineate; coprire il mandrino ermeticamente con una sottile striscia di lamina di alluminio. Bloccare il mandrino nel motore sul lato opposto della scatola circa 15 cm dalla siringa.
    4. Inserire il tubo di plastica nella porta del vuoto e collegarlo alla fonte di vuoto cappa. Accendere la sorgente di vuoto e coprire la scatola acrilico con un coperchio.
    5. Set la velocità di infusione della pompa a siringa programmabili a 2,5 ml / hr. Attivare il motore per azionare il mandrino a 3.450 rpm e collegare il cavo positivo della sorgente di tensione alla punta dell'ago all'esterno della scatola utilizzando un coccodrillo.
    6. Una volta che l'infusione della soluzione PCL è iniziata, attivare il generatore di tensione e regolato ad una tensione di funzionamento 20 kV.
    7. Infondere la soluzione per 12 min per creare un bracciale omogenea da 0,5 ml della soluzione di PCL.
      NOTA: In media, ogni bracciale ha materiale elettrofilate sufficiente a creare due fogli sei nastri, che possono essere utilizzati per creare un totale di tre ponteggi a quattro strati.
  3. Il laser ha tagliato il bracciale PCL per formare più piccoli fogli su un VersaLaser Cutter 2.3 operato a livello basso-vuoto, 10,0 keV tensione atterraggio, 6,4 millimetri distanza di lavoro, e il diametro della sonda di 3.0.
    NOTA: In questo esempio, un disegno assistito da computer è stato utilizzato per istruire la taglierina per produrre più fogli di 1,5 mm x 35 mm x 150 micron con scaffolduniformemente distribuito 150 micron fori del diametro a 15% dell'area dei pori.
  4. Plasma etch i ponteggi PCL utilizzando un detergente al plasma per indurre idrofilia della superficie PCL con l'accelerazione di ioni. Impostare il vuoto a 450 mTorr e il trattamento dei ponteggi per 30 secondi alla massima potenza (29,6 W).
  5. Bagnare i ponteggi in etanolo al 70% in un ambiente sterile.
  6. Rivestire le singole scaffold di collagene per facilitare l'adesione cellulare e la proliferazione in vivo.
    1. Creare una soluzione di rivestimento di collagene diluendo un 8: soluzione sterile 2,5 su Purecol collagene 3 mg / ml soluzione standard, 10x PBS e 0,1 N NaOH 1: 1 9 in 1x PBS a 4 ° C. Mescolare accuratamente per garantire la soluzione di omogeneità.
    2. Coat individuo 1,5 millimetri x 35 mm x 150 micron scaffold con una pellicola sottile strato di soluzione di collagene sopra. Lasciare asciugare per 24 ore in un ambiente sterile.
  7. Utilizzando 5-0 suture Vicryl, impilare e apporre quattro singoli 1,5 millimetri x 35 mm x 150 micron ponteggiutilizzando un Krackow punto di creare un finale spessore di 0,6 mm, a più livelli, impalcatura di collagene rivestite che è pronto per l'impianto.

2. Rat Chirurgia Protocol

  1. Indurre l'anestesia mettendo topo in camera di inalazione e la consegna 2% isoflurano con 2 L / min di ossigeno. Confermare il ratto sia adeguatamente anestetizzato applicando una pressione Hind piede e valutare per qualsiasi risposta.
  2. Sul tavolo posteriore non sterile, iniettare per via sottocutanea 25 mg / kg ampicillina e 0,03 mg / kg buprenorfina.
  3. Applicare pomata oftalmica per gli occhi. Agganciare la pelliccia dal arti posteriori operativo e preparare il sito chirurgico con tre scrub alternati di clorexidina e il 70% di etanolo.
  4. Trasferire il ratto al tavolo operatorio, su un tappetino riscaldato per prevenire l'ipotermia. Ogiva sicura, e mantenere l'anestesia attraverso la procedura con il 2% isoflurano in 2 L / min di ossigeno, cono consegnato. Telo in modo sterile, lasciando l'arto operativa esposta.
  5. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, prima confermare adeguata anesthetization dalla mancanza di una risposta Hind pressione del piede.
  6. Effettuare una 2 cm un'incisione mediale verticale al ginocchio, centrato a livello della rotula. Ritrarre la pelle lateralmente fino a quando l'incisione è centrata sopra il ginocchio.
  7. Utilizzare un bisturi per fare una artrotomia mediale pararotulea tagliando semplicemente mediale alla rotula e si estende prossimalmente al livello della giunzione muscolo del quadricipite e distalmente al livello del tendine rotuleo sulla tubercule tibiale. Fare attenzione a non tagliare i rotulei o quadricipite tendini.
  8. Rotula uscita lateralmente da una incisione verticale 1 cm attraverso l'capsula ginocchio appena lateralmente al tendine rotuleo.
  9. Assicurarsi che il ginocchio è esteso. Prendete un paio di forbici fini e passare sotto la rotula da laterale a mediale. Stendere le forbici un paio di volte in modo che il meccanismo estensore può essere tradotto in entrambi i lati.
  10. Mentre flettendo tegli ginocchio, tradurre la rotula lateralmente per esporre l'interno del ginocchio. Assicurare la visualizzazione della gola intercondiloidea e condili femorali. Usando un bisturi, transetto l'ACL e PCL nella tacca.
  11. Carico trapano elettrico con un k-fili 1,6 mm. Posizionare punta k-wire sull'origine ACL nella gola intercondiloidea. Praticare superolaterally e visualizzare il punto di uscita sulla parte laterale del femore, rimuovere qualsiasi tessuto molle, se necessario, con un bisturi. Passare il filo k in e fuori un paio di volte a garantire libero il passaggio per l'innesto.
  12. Posizionare il filo k sull'impronta ACL sul piatto tibiale. Praticare anterolaterally e visualizzare il punto di uscita sulla tibia prossimale antero-laterale. Utilizzare bisturi per cancellare tessuti molli come necessario in modo che il punto in cui il filo k esce tibia è completamente visualizzato.
  13. Passare un ago accorciato Keith (lungo idealmente non più di 2 centimetri) attraverso il tunnel osso femorale. Infilare le due estremità di sutura da un'estremità dell'innesto attraverso l'occhio del Keith ago. Utilizzare l'ago per tirare una estremità dell'innesto attraverso il tunnel femorale.
  14. Ripetere la fase prima di passare l'altra estremità dell'innesto attraverso il tunnel tibiale.
  15. Utilizzare 4-0 Vicryl sutura per fissare la fine femorale dell'innesto di periostio o di altri tessuti molli circostanti con un punto figura di otto. Tensione manualmente l'innesto con il ginocchio in estensione. Fissare la fine tibiale dell'innesto a periostio o altri tessuti molli circostanti con un punto figura di otto.
  16. Utilizzare una forbice per tagliare l'eccesso innesto su entrambe le estremità, lasciando 1-2 mm su ciascuna estremità passato il punto figura di otto.
  17. Estendere il ginocchio e ridurre la rotula. Utilizzando 4-0 Vicryl, posizionare un singolo punto figura-di-otto per chiudere la capsula articolare mediale, impedendo sublussazione laterale della rotula.
  18. Chiudere la pelle con un running sottocuticolare 5-0 monocryl o Vicryl sutura, con attenzione a non suturare il muscolo sottostante o avere alcun sutura visibile una volta che la pelle è chiuso.
  19. Injeratti ct sottocutanea con buprenorfina ogni 12 h per un totale di tre giorni dopo l'intervento. Controllare sito chirurgico per qualsiasi drenaggio o deiscenza della ferita al momento dell'iniezione. Zoppicando e qualche gonfiore sono normali nei primi giorni dopo l'intervento chirurgico, ma prontamente risolvere eventuali problemi post-operatori, in collaborazione con il personale veterinario. L'animale può essere di ritorno per l'edilizia sociale a 2 settimane dopo l'intervento, quando incisioni chirurgiche sono completamente guariti.

3. Raccolta dati Protocol

  1. Al momento del sacrificio, asphyxiate ratti singolarmente in una camera chiusa CO 2 seguito da toracotomia.
  2. Raccolto entrambi gli arti chirurgicamente ricostruite e controlaterale separando in dell'anca.
    1. Per gli arti ricostruiti, rimuovere tutti i tessuti molli, incluso il legamento crociato posteriore ed i resti del chirurgicamente perturbato ACL native, dalla dissezione multa per isolare solo il femore, la tibia, e l'innesto.
    2. Per gli arti controlaterali, rimuovere tutti i tessuti molli tranne il ACL native come pure il femore e tibia mediante dissezione fine.
    3. Utilizzare un utensile rotante come Dremel, per rimuovere tutto ma ¾ a 1 cm di osso da ciascuna estremità del complesso femore-graft-tibia.
    4. Durante questo processo e per tutto il test biomeccanici, regolarmente e frequentemente spruzzare le regioni legamentose con soluzione fisiologica per prevenire l'essiccamento del ginocchio raccolto che possono alterare i risultati falsamente.
  3. Per l'analisi istologica, risolvere ogni ginocchio singolarmente in soluzione paraformaldeide 4% a 25 ° C per 48 ore. Successivamente, immergere il ginocchio in una soluzione di reagente per Immunocal completa decalcificazione; questo processo dipende dal contenuto calcifici del campione e può richiedere fino a cinque giorni. Controllare singoli campioni al giorno per valutare i progressi come decalcificazione incompleta può abbassare la qualità del campione. Una volta completata, eseguire sezionamento, il montaggio di diapositive, e la colorazione, se lo desideri.
  4. Perform test biomeccanici per valutare la capacità funzionale del legamento ingegneria tessutale.
    1. Fissare il femore e tibia avvolgendo separatamente 28 G filo d'acciaio galvanizzato intorno alla epifisi di ogni osso. Questo per evitare che i dati di test biomeccanici imprecisi di rottura per trazione prematura del campione all'osso piuttosto che al legamento di interesse.
    2. Pot femore in una miscela di cemento polimetilmetacrilato (PMMA) dell'osso. Per fare questo, miscelare i due componenti del cemento e utilizzare immediatamente la miscela viscosa per fissare femore nel metallo, che stringe completamente i diafisi dell'osso nel piatto cementato con l'epifisi e legamento divisoria sporgenti liberamente. Lasciare spontanea polimerizzazione radicalica per trasformare gradualmente i componenti viscosi misti ad un materiale pastoso e infine in una matrice solida indurita.
      NOTA: Questo processo richiede diversi minuti e può essere controllata valutandone manualmente la temperatura di un bolo realizzatoil cemento residuo; la temperatura deve aumentare temporaneamente durante la reazione di polimerizzazione esotermica e regrediscono a RT dopo la solidificazione del materiale.
    3. Ripetere la stessa procedura di cui sopra per cementare tibia, tranne mantenendo il legamento del ginocchio a 20 ° di flessione per prove meccaniche ideale.
    4. Montare il complesso femore-graft-tibia cementata su un apparecchio per prove di trazione, e preparati a carico di registrazione e lo spostamento in funzione del tempo dall'inizio della tensione al fallimento. In questo esempio, abbiamo utilizzato un modello di Instron 5564 con una cella di carico 1 kN.
    5. Pre-tensionamento dell'innesto a 2 N ad una velocità di rampa di 0,5 N / min e quindi verificare l'innesto al fallimento ad una velocità di deformazione di 0,5 mm / sec. Durante il processo, assicurarsi che il legamento non riesce a metà sostanza e che il femore e tibia osseo sono sicuri e non prematuramente in mancanza, che potrebbe erroneamente valutare le proprietà biomeccaniche del legamento testato.
    6. Usare il carico-spostamento generatacurve per calcolare il carico di rottura e la rigidità del legamento testato.

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Risultati

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Nella nostra esperienza di 92 interventi chirurgici di ratto da un singolo chirurgo, tempo medio operatorio dall'incisione al completamento della ferita era 16,9 min, con una deviazione standard di 4,7 min. Al momento del sacrificio, ratti pesati 356 ± 23 g. Tutti i ratti hanno tollerato la chirurgia bene, e con esperienza senza complicazioni. Subito dopo l'intervento chirurgico, i ratti sono stati notati a sopportare il peso sull'estremità operativa, ma hanno mostrato una leggera zoppia. Di una settimana do...

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Discussione

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Lesioni ACL sono una condizione comune in chirurgia ortopedica sportiva, con opzioni limitate per la ricostruzione, al momento presente. Per sviluppare un sostituto tissutale appropriate per LCA che permetterà la rigenerazione in vivo, è necessario un modello animale adatto. In questo studio, la realizzazione di un innesto ingegnerizzato biodegradabile è descritto, così come il suo impianto in vivo utilizzando un modello riproducibile di ricostruzione del LCA in ratti atimici. Questo modello può essere...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare Gabriel Arom e Michael Yeranosian per i loro contributi tecnici alla iterazioni precedenti di questo progetto. Questo progetto è stato finanziato dalla OREF Clinico Scientist Training Grant (NL), HH Lee Surgical Research Grant (NL), Veterans Administration BLR & D Merit recensione 1 I01 BX00012601 (DM) e muscoloscheletrico Trapianto Foundation Young Investigator Award (FP).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Polimero medical grade a terminazione esterea di poli(ε-caprolattone), forma granulare (PM = 110.000)figure-materials-1 Lactel Absorbable PolymersPolimero sintetizzato su misura al peso molecolare desiderato
1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanoloSigma-Aldrich105228Solvente per il polimero PCL
Ago bevel 18 G x 1½"BD Medical305196
Pompa per siringa programmabile per infusione/estrazione remotaHarvard Apparatus702101
VersaLaser VLS2.30 Incisore laserMicrogeo USAVLS2.30
Pulitore al plasma espanso 115 VHarrick PlasmaPDC-001Marcatura al plasma appena prima del rivestimento con collagene per la modifica della superficie
Soluzione standard di collagene PureCol, 3 mg/mlAdvanced Biomatrix5015-APreparare una soluzione 8:1:2,5 di PureCol, PBS 10x e NaOH 0,1 N 1:9 in PBS 1x
Chirurgica riassorbibile, 5-0 VicrylHenry Schein1086471
Chirurgica riassorbibile, 4-0 VicrylHenry Schein6540072
Forbici anatomiche a punta acuta (dritte; 4,5 pollici)Fisher Scientific8940
Cloridrato di buprenorfinaSigma-AldrichB9275Utilizzare 0,03 mg/kg sia intraoperatoriamente che postoperatoriamente per il controllo del dolore
Ampicillina, iniettabileHenry Schein1185678Utilizzare 25 mg/kg per via sottocutanea durante la procedura
Pin di Kirschner, 1,6 mmSpectrum SurgicalSI040062
Ago di Keith, dritto 1½"Delasco Dermatology Lab & SupplyKE-112
Soluzione decalcificante ImmunocalFisher ScientificNC9491030
Cemento osseo in resina acrilica Opticryl (PMMA) (monomero e polimero)US Dental DepotOPTICRYL 100410 
Macchina per prove di trazione Instron Modello 5564Instron5564Qualsiasi apparecchiatura per prove di trazione comparabile è adatta

Riferimenti

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