Traffico Receptor modula la segnalazione e la cellula di risposta ai ligandi ed è, a sua volta, sensibile alle condizioni di cellulari, tra cui la segnalazione ligando-indotta. Qui, descriviamo una tecnica potente e flessibile per la valutazione quantitativa farmaco-indotta traffico recettoriale utilizzando immunomarcatura e analisi colocalizational.
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Articolo metodologico
Rilevamento delle modifiche droga indotte recettore post-internalizzazione Tratta di Analisi Colocalizational
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il traffico intracellulare dei recettori è un insieme di processi complessi e altamente controllati. Il traffico recettoriale modula la segnalazione e la risposta cellulare complessiva ai ligandi ed è, a sua volta, influenzato da condizioni intra- ed extracellulari, inclusa la segnalazione indotta dal ligando. Ottimizzato per l'uso con cellule in coltura monostrato, ma estendibile a fette di tessuto flottanti, questo protocollo utilizza l'immunomarcatura e l'analisi colocalizzativa per tracciare i cambiamenti nel traffico dei recettori intracellulari a seguito di interventi cronici/prolungati e acuti, compreso il trattamento farmacologico esogeno. Dopo il trattamento farmacologico, le cellule vengono doppiamente marcate per il recettore e per i marcatori per i compartimenti intracellulari di interesse. La microscopia confocale sequenziale viene quindi utilizzata per acquisire fotomicrografie a due canali di singole cellule, che vengono sottoposte ad analisi computerizzata di colocalizzazione per produrre punteggi quantitativi di colocalizzazione. Questi punteggi sono normalizzati per consentire il raggruppamento di repliche indipendenti prima dell'analisi statistica. Possono anche essere elaborate micrografie fotografiche rappresentative per generare figure illustrative. Qui, descriviamo una tecnica potente e flessibile per valutare quantitativamente il traffico di recettori indotti.
Introduzione
Recettori, soprattutto G recettori accoppiati alle proteine (GPCR), sono regolarmente vittime della tratta intracellulare, da e verso la superficie cellulare 1. Questi processi complessa orchestrati e strettamente controllate dettano complementi recettori disponibili cellule 'e regolano l'attività del recettore temporali, la desensibilizzazione, e risensibilizzazione 2-4. È importante sottolineare che questi processi sono sensibili agli ambienti cellulari tra cui l'attività del recettore indotta da farmaci o di inattività. Cioè, le azioni di ligandi dei recettori possono alterare traffico intracellulare di tali recettori, alterando....
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Protocollo
Nota: Questo protocollo è ampiamente compatibile con vari modelli monostrato placcato cellule / tessuti cultura, i regimi di trattamento di droga, e gli obiettivi in materia di etichettatura. Così in uso, molti parametri specifici variano in base al design sperimentale. Qui, i riferimenti a questi parametri definiti dall'utente sono generici. Esempio condizioni, usati per ottenere i risultati rappresentativi, sono riportate in corsivo.
1. Soluzioni
- Preparare tampone di lavaggio mescolando 0.1M Tris-Buffered ipertonica (300 mm) Saline e 0,05% polisorbato 20; pH 7.4 a RT.
- Preparare tampone di bloccaggio. Per 0,05 ....
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Risultati
Utilizzando questa tecnica, è possibile quantificare i cambiamenti nel recettore traffico post-internalizzazione seguenti due trattamenti farmacologici cronici / prolungata e acuta. Dopo trattamenti farmacologici, di fissazione, e l'etichettatura, ad alta risoluzione fotomicrografie due canali vengono acquisite di ogni cellula di interesse. Immagini rappresentative possono essere combinati con falsi colori colocalization per generare figure illustrative (Figura 1). Analisi colocalizational successiv.......
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Discussione
Abbiamo ottimizzato questo protocollo per l'analisi delle colture primarie di neuroni adulti gangli delle radici dorsali (neuroni sensoriali primarie). Può anche essere utilizzato, con poche o nessuna modifica, per le cellule in coltura monostrato placcato ampiamente. L'analisi colocalizational è possibile anche in fette di tessuto e di altre tali preparati 11, tuttavia i componenti di trattamento farmacologico e il fissaggio del tessuto / preparazione non sarebbe appropriato.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da CIHR (MOP394808) e una sedia di ricerca del Canada a CMCEWO è stato il destinatario di una borsa di studio post-laurea da NSERC.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Cloruro di sodio | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Acido cloridrico | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumina da siero bovino | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatina da pesce d'acqua fredda skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Piastre per colture cellulari: 24 pozzetti | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 cerchi Vetro di copertura per microscopio | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Fosfato di sodio monobasico | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodio Fosfato bibasico | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldeide | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Pinze - Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Anticorpo anti-DOR di coniglio | MyBioSource | MBS316175 | Utilizzato a 1:1.500 |
| Anticorpo anti-Rab5 di topo | Sigma Aldrich | R7904 | Utilizzato a 1:750 |
| Anticorpo anti-Rab11 di topo | Millipore | 05-853 | Utilizzato in 1:500 |
| Anticorpo anti-LAMP1 di capra | Santa Cruz | SC8098 | Utilizzato in 1:750 |
| Anticorpo coniugato anti-coniglio asino Alexa 488 | Life Technologies | A-21206 | Utilizzato in 1:200 a 1:2.000 |
| Anticorpo coniugato anti-topo di capra Alexa 594 | Life Technologies | A-11005 | Utilizzato in 1:200 a 1:2.000 |
| Asino anti-capra Alexa 594 anticorpo coniugato | Life Technologies | A-11058 | Utilizzato da 1:200 a 1:2.000 |
Riferimenti
- Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Trafficking of G protein-coupled receptors. Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).
- Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. T....
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Ristampe e permessi
