Attivazione reattiva Gliosi<em&gt; In Vivo</em&gt; Da un Forebrain Stab Injury

Sommario

Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per produrre una ferita da taglio al proencefalo nei topi adulti. La coltellata induce una grave gliosi reattiva e la formazione di cicatrici gliali che possono essere successivamente esaminate con i metodi standard di immunoistochimica.

Abstract

A seguito di una lesione al SNC, gli astrociti subiscono un'ampia gamma di cambiamenti biochimici, morfologici e molecolari collettivamente indicati come astrogliosi reattiva. Gli astrociti reattivi esercitano effetti sia infiammatori che protettivi che inibiscono e promuovono, rispettivamente, la riparazione neurale. I meccanismi alla base delle diverse proprietà funzionali dell'astrogliosi reattiva non sono ben compresi. Raggiungere una maggiore comprensione di questi meccanismi è fondamentale per lo sviluppo di strategie terapeutiche per il trattamento del SNC danneggiato. Qui dimostriamo un metodo per innescare l'astrogliosi reattiva nel prosencefalo del topo adulto utilizzando una lesione da taglio del proencefalo. Questo modello di lesione è semplice, affidabile e richiede solo un dispositivo stereotassico e una lama di bisturi per produrre la lesione. L'uso delle lesioni da taglio come modello di lesione nel proencefalo è ben consolidato e suscettibile di studi che affrontano un'ampia gamma di esiti neuropatologici, come la degenerazione neuronale, la neuroinfiammazione e le interruzioni della barriera ematoencefalica (BEE). Pertanto, il modello di coltellata del proencefalo funge da potente strumento che può essere applicato per un'ampia gamma di studi sulla risposta del SNC al trauma.

Introduzione

Una delle principali sfide per lo sviluppo di terapie efficaci per il trattamento del SNC danneggiato è una comprensione incompleta dei complessi eventi multicellulari che vengono innescati dal trauma. Gli astrociti reattivi stanno ottenendo sempre più riconoscimenti come bersaglio promettente per nuove terapie¹. Sebbene storicamente considerati ostili alla riparazione neurale, gli astrociti reattivi sono ora riconosciuti come componenti critici di una complessa risposta neuroprotettiva multicellulare che include l'attenuazione dei processi infiammatori e la limitazione del danno secondario e della neurodegenerazione^2-6. Sebbene le caratteristiche neuropatologiche della gliosi reattiva siano state a lungo ben definite, i meccanismi cellulari e molecolari che regolano la gliosi reattiva e la vasta gamma di conseguenze a valle rimangono poco compresi. Comprendere i meccanismi che guidano la gliosi reattiva, così come i successivi eventi cellulari e molecolari, è un passo importante verso lo sviluppo di strategie volte a promuovere le proprietà neuroprotettive della gliosi reattiva, attenuandone gli effetti dannosi.

Qui dimostriamo un metodo per indurre una grave astrogliosi reattiva nel proencefalo di topi adulti utilizzando una ferita da taglio. A differenza di altri modelli di lesione cerebrale traumatica (TBI), come l'impatto corticale controllato (CCI) o la lesione a percussione fluida (FPI), che richiedono attrezzature specializzate per produrre una lesione, la pugnalata del proencefalo richiede solo un dispositivo stereotassico per stabilizzare la testa e una lama di bisturi n. 11. Pertanto, il modello di lesione da taglio del proencefalo è più ampiamente accessibile a un'ampia gamma di laboratori che non hanno accesso ai dispositivi specializzati necessari per creare una lesione FPI o CCI. Il metodo qui descritto consente ai ricercatori di innescare in modo affidabile e riproducibile una robusta risposta alla gliosi per studiare i successivi eventi cellulari e molecolari. Una volta recuperati dall'intervento chirurgico, gli animali che hanno ricevuto una coltellata al proencefalo possono sopravvivere per periodi prolungati senza la necessità di cure specialistiche e possono essere restituiti alla colonia per studi acuti, intermedi o cronici. Sebbene meno traducibile clinicamente rispetto ai modelli FPI o CCI di trauma cranico, una lesione del proencefalo prodotta da una ferita da taglio funge da modello sperimentale semplice ma utile per studiare i meccanismi biologici di base alla base della gliosi reattiva e di altri eventi neuropatologici a seguito di traumi al SNC.

Protocollo

Adulti (3-4 mesi) topi maschi su un misto C57BL / 6 di fondo sono stati utilizzati in questo protocollo. Gli animali sono stati tenuti al 12 hr luce / buio ciclo, e consentito l'accesso gratuito al cibo e all'acqua. Tutte le procedure eseguite in questo protocollo sono stati condotti secondo protocolli approvati dalla University Istituzionale cura e l'uso degli animali Comitato Drexel.

1. Preparazione Area Chirurgica

1. Disinfettare tavolo operatorio con il 70% di etanolo, quindi coprire l'intera panchina chirurgica con assorbenti e organizzare strumenti chirurgici adiacente stereotassica.
2. Impostare attrezzature stereotassico senza braccio manipolatore. Disporre il rilievo di riscaldamento sul stereotassica e impostato a 37 ° C. Evitare il surriscaldamento l'animale mettendo un piccolo pezzo di carta assorbente o tampone chirurgica tra l'animale e il rilievo di riscaldamento.
3. Utilizzando le forbici in autoclave, tagliare piccoli pezzi di Gelfoam autoclavato in una piastra di Petri sterile contenente soluzione fisiologica sterile allo 0,9% fino a ready all'uso.
   Nota: Mantenere ambiente di lavoro sterile, utilizzando strumenti in autoclave e rifornimenti chirurgici sterili. Re-sterilizzare gli strumenti chirurgici durante la procedura o in tra gli animali mediante immersione in uno sterilizzatore tallone per 10-15 secondi, a seconda delle necessità. Mantenere guanti puliti durante l'intera procedura sfregando le mani con il 70% di etanolo, se necessario, da disinfettare.

2. Prepping mouse per Chirurgia

1. Rimuovere mouse dalla gabbia di casa e pesare (g).
2. Posizionare il mouse nella camera di induzione isoflurano e ossigeno impostata su 2 L / min e vaporizzatore isoflurano a 5 per indurre un piano chirurgico di anestesia, circa 3-5 minuti. Monitor per la respirazione rallentata e l'immobilizzazione. Verificare che il mouse sia completamente sedato con la reflex pizzico piedi.
3. Quando il mouse è completamente sedato, metterli in telaio stereotassico, fissare il naso nel cono naso, che è collegato con un tubo alla isoflurano. Inserire barre di orecchio in canale uditivo e stringere, garantendo la testa è stabile.
4. Radere la testa da un orecchio all'altro, e da mezzo agli occhi di dietro le orecchie.
5. Sterilizzare la pelle con alternanza di salviette di alcol isopropilico e soluzione betadine iodio, 3 volte ciascuno.
6. Applicare lacrime artificiali per entrambi gli occhi per evitare che si secchi durante la procedura chirurgica.

3. Procedura chirurgica

1. Monitorare la profondità dell'anestesia pizzicando la punta o la coda. Il topo è nel piano chirurgica appropriata quando non vi è alcuna risposta, e la respirazione è lenta e uniforme.
2. Effettuare una incisione cutanea parasagittale da appena dietro gli occhi per quasi tra le orecchie in un unico movimento ferma con una lama n ° 11 bisturi. Spostare la pelle da parte e la clip a destra con pinza emostatica.
3. Cancella cranio di membrana sovrastante con il lato opaco del bisturi n ° 11 e il cotone punta applicatori. Facoltativamente, pulire il cranio con cotone applicatore capovolto immerso in soluzione salina allo 0,9%. Lasciare asciugare completamente.
4. Noiing un piccolo righello, segnare il bordo anteriore del craniotomia a 1 millimetro caudale alla sutura coronale, e il bordo sinistro del craniotomia a 1 mm lateralmente alla sutura sagittale (figura 1), con un pennarello indelebile. Quindi contrassegnare il bordo destro e caudale della craniotomia a 4 mm dal suture sagittali e coronali, rispettivamente (Figura 1).
5. Utilizzando una punta 0,5 millimetri, cominciare a fare craniotomia perforando lentamente seguendo il marcatore contorno permanente. Fare attenzione a non sfondare il cranio completamente. Premere delicatamente sul pezzo isolato di osso parietale con n ° 5 pinze, aree di debolezza darà modo alla pressione. Quando l'osso assottigliata è sufficientemente debole per tutto il perimetro, il pezzo di osso è pronto per la rimozione.
   NOTA: Se la difficoltà esperienze investigatore rimuovendo l'osso in un unico pezzo, questo suggerisce che l'osso non era sufficientemente diluito durante la perforazione. Si consideri la foratura ulteriormente il cranio nelle successive animali al facilitafacile rimozione te del pezzo dell'osso.
6. Usando una siringa da 10 ml munito di ago G 23, applicare una piccola quantità di soluzione fisiologica 0,9% per assorbire l'osso isolata e zona forata.
7. Fissare il braccio manipolatore all'apparecchiatura stereotassica. Collegare un nuovo n ° 11 bisturi al titolare sonda con il lato tagliente della lama rivolta verso rostralmente.
   NOTA: Sebbene i tessuti rostrale e caudale sperimentano gli spigoli smussati e della lama, rispettivamente, il danno meccanico indotto dalla ferita penetrante è comparabile in tutta l'estensione della lesione. Osserviamo differenze apprezzabili caratteristiche principali di gliosi reattiva tra cui upregulation di espressione GFAP o la proliferazione, tra le sezioni rostrali e caudale.
8. Tenendo il braccio manipolatore di mezzo, sollevare con cautela l'osso isolato con 5/45 pinze ad angolo. Inserire la punta della pinza nella parte dell'osso isolata e ascensore, utilizzando la leva per tirare fuori il pezzo di osso lasciato in uno fulil movimento l.
   NOTA: Fare attenzione a non colpire il cervello o turbare la dura sotto il cranio.
9. Prendete un piccolo pezzo di schiuma gel assorbibile imbevuto e posizionare sul cervello scoperto per evitare che si secchi e assorbire il sangue che potrebbero essere presenti.
10. Una volta che la schiuma di gel è a posto, oscillare il braccio manipolatore in posizione e regolare lama centro craniotomia sopra la schiuma gel. Rimuovere la schiuma gel e abbassare la lama fino a quando la punta tocca la dura, senza pungere la dura. Mark dorsale / ventrale coordinate utilizzando il nonio sul braccio verticale della stereotassico.
11. Utilizzando il braccio manipolatore, abbassare lentamente la lama precisamente da 3 mm nel cervello. Ciò si ottiene utilizzando le marcature nonio sul braccio manipolatore. Lasciare lama per rimanere sul posto per 5-10 secondi. Portare il braccio stereotassica con attacco lama rostrale a caudale tre volte permettendo la lama per raggiungere i confini rostrale e caudale della craniotomia prima di passare alla opposifine te.
    NOTA: La dura non viene rimosso prima di inserire la lama. In contrasto con la dura madre ratto, che è ~ 80 micron di spessore ^7, la dura mouse è considerevolmente più sottile (spessore di pochi strati di cellule) e non produce una resistenza apprezzabile bisturi durante l'inserimento. Utilizzare una nuova lama di bisturi per ogni mouse per garantire che ogni animale riceve una lesione coerente.
12. Lentamente sollevare il braccio stereotassico, rimuovere la lama dal cervello. Dopo la rimozione della lama, immediatamente posto un altro pezzo di Gelfoam sulla superficie del cervello per assorbire qualsiasi eccesso di sangue o fluido.
13. Nel frattempo, smontare il braccio stereotassica e smaltire la lama n ° 11 bisturi. Una volta emorragia si è fermata, rimuovere il Gelfoam.
14. Chiudere la ferita sutura la pelle con sutura non riassorbibile, come ad esempio Ethilon o prolene. Le suture devono essere rimossi 9-10 giorni dopo l'intervento.
15. Ritorna il mouse per la sua gabbia di casa, e lasciare il mouse per recuperare lentamente su un heating pad e monitor per eventuali segni di sofferenza. Il risveglio dall'anestesia isofluorane indotta si verifica in genere entro 2-5 minuti dopo la rimozione dal isofluorane. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha riconquistato recumbancy sternale.
16. Somministrare 0,5-1 ml di soluzione di Ringer lattato per via sottocutanea per garantire idratazione.

Cura 4. post-chirurgico

1. Seguire da vicino gli animali dopo l'intervento fino al recupero dall'anestesia, prima di tornare alla colonia.
   1. Per ridurre il dolore e il disagio post-operatorio, amministrare 0,05-0,1 mg / kg buprenorfina per iniezione ip immediatamente dopo la procedura.
   2. Osservare gli animali per 2-3 giorni dopo l'intervento per gravi segni di sofferenza, come i movimenti limitati, la mancanza di cura, o la perdita di peso. Eutanasia animali che dimostrano uno qualsiasi di questi segni di sofferenza e rimuovere dallo studio.
2. Per esaminare istopatologia dei tessuti lesi, eutanasia animali da stanDard perfusione intracardial.
   1. Brevemente, anestetizzare animali con un sovradosaggio di ketamina / xilazina, quindi intracardiaca perfuso con 15-20 ml di NaCl allo 0,9%, o fino a quando il fegato è liberata di sangue, seguiti da 60 ml di 4% paraformaldeide a conclusione dell'esperimento.
3. Sezionare cervelli e post-correzione per 2-4 ore in paraformaldeide al 4% prima del trasferimento a una soluzione di saccarosio al 30%. Cervelli sezione su un criostato a 40-60 micron, e il processo di procedure istologiche o immunoistochimiche standard, oppure come descritto in Garcia ^8,9.

Risultati

Dato che gli animali sottoposti a questa procedura non richiedono periodi sopravvivenza specializzati cura post-operatorio, brevi o time-lungo termine sono facilmente incorporati nello studio, a seconda delle necessità di indagare patologie acute o croniche a seguito di infortunio. Caratteristiche principali di gliosi reattiva, come l'up-regolazione di GFAP e l'ipertrofia del soma, si può osservare come già 2-3 giorni dopo un trauma. La fase di picco della proliferazione di astrociti reattivi è nei giorni 3-5 se...

Discussione

E 'fondamentale che il cranio o dura sottostante non vengano danneggiati durante la perforazione. Utilizzare una leggera pressione durante la perforazione al fine di garantire il cranio non è forato. Inoltre, si deve prestare attenzione mentre si solleva il pezzo del cranio per garantire la dura non è decollato con l'osso.

L'infortunio prosencefalo pugnalata qui descritto modelli una ferita penetrante al SNC. Anche se meno clinicamente traducibile di modelli TBI come la FPI e CCI...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Stereotax	Harvard Apparatus	726049
Micro trapano ad alta velocità	Harvard Apparatus	724950
lama per bisturi in acciaio inossidabile, #11	MedVet	JOR581S
5/45 pinze angolate	Fine Science Tools	11251-35
Spugna Gelfoam 12 cm x 7 mm	Fisher	NC9841478
Rb anti-GFAP	DAKO	Z033429-2	Diluizione - 1:20.000 (campo chiaro); 1:1.000 (fluorescenza)
Shp anti-BrdU	Abcam	ab1893	Diluizione - 1:20.000 (campo chiaro); 1:500 (fluorescenza)
Capra biotinilata anti-coniglio	Vector Laboratories	BA-1000	Diluizione - 1:400 (campo chiaro)
Coniglio biotinilato anti-pecora	Vector Laboratories	BA-6000	Diluizione - 1:400 (campo chiaro)
Alexafluor 488 capra anti-coniglio	Technologies	A-11008	Diluizione - 1:400 (campo chiaro)
Alexafluor 568 asino anti-pecora	Life Technologies	A-21099	Diluizione - 1:1.000 (fluorescenza)
DAPI Nucleic Acid Stain	Life Technologies	D3571	Diluizione - 1:1.000 (fluorescenza)
Cresyl Violet Acetate	Sigma Aldrich	C5042-10G	Diluizione - 1% (campo chiaro)

Life