Articolo metodologico

In Situ rilevamento di batteri all'interno dei tessuti in paraffina utilizzando una sonda DNA Digossina marcato targeting 16S rRNA

DOI:

10.3791/52836

⸱

21 maggio 2015

 ,  ,  , 
1Department of Oral Microbiology and Immunology, School of Dentistry and Dental Research Institute, Seoul National University

In questo articolo

Sommario

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Qui è stato descritto un metodo per localizzare i batteri all'interno di tessuti inclusi in paraffina utilizzando sonde di DNA mirate all'rRNA 16S marcate con DIG. Questo protocollo può essere applicato per studiare il ruolo dei batteri in varie malattie come la parodontite, i tumori e le malattie immunitarie infiammatorie.

Abstract

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La presenza di batteri all'interno dell'epitelio tascabile e del tessuto connettivo sottostante nelle biopsie gengivali di pazienti con parodontite è stata segnalata utilizzando vari metodi, tra cui la microscopia elettronica, l'immunoistochimica o l'immunofluorescenza utilizzando anticorpi specifici per i batteri e l'ibridazione fluorescente in situ (FISH) utilizzando una sonda oligonucleotidica marcata con fluorescenza. Tuttavia, questi metodi non sono ampiamente utilizzati a causa di limitazioni o difficoltà tecniche. Qui è stato introdotto un metodo per localizzare i batteri all'interno di tessuti inclusi in paraffina utilizzando sonde di DNA marcate con DIG. I tessuti inclusi in paraffina sono la forma più comune di tessuti bioptici disponibili nelle banche di patologia. I batteri possono essere rilevati in modo specie-specifico o universale. I segnali batterici vengono rilevati come forme discrete (cocco, bastoncello, forma fusiforme e pelosa) di batteri o forme disperse. La tecnica consente di ottenere altre informazioni istologiche: gli epiteli, il tessuto connettivo, gli infiltrati infiammatori e i vasi sanguigni sono ben distinti. Questo metodo può essere utilizzato per studiare il ruolo dei batteri in varie malattie, come la parodontite, i tumori e le malattie immunitarie infiammatorie.

Introduzione

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I batteri svolgono un ruolo nell'eziologia di varie malattie orali come la parodontite, pulpite, pericoronite, cellulite e osteomielite. Per comprendere il ruolo dei batteri nella patogenesi della malattia e per monitorare l'effetto dei trattamenti, localizzazione di batteri all'interno del tessuto è importante. La presenza di batteri all'interno del tessuto gengivale di pazienti con periodontite è stato dimostrato utilizzando vari metodi, tra cui la microscopia elettronica 1,2, immunoistochimica e immunofluorescenza usando specifici anticorpi batteri-3-7 e ibridazione in situ fluorescente (FISH) 8 utilizzando un fluorescence- sonda oligonucleotide etichettato mira 16S rRNA. Tuttavia, questi metodi non sono ampiamente utilizzati a causa di limitazioni o difficoltà tecniche. Rispetto anticorpi, sonde destinate 16S rRNA sono facili da produrre e realizzare specie specificità. FISH ha dimostrato di essere un ottimo strumento per la visualizzazione di bacteria nei loro ambienti naturali, come la placca biofilm. Tuttavia, l'applicazione di FISH a campioni di tessuto è limitata a causa di autofluorescenza di varie componenti del tessuto. Ad esempio, il forte autofluorescenza di globuli rossi spesso ostacola l'applicazione della tecnologia di fluorescenza ai tessuti infiammati quando coinvolgono sanguinamento 9.

Per localizzare batteri all'interno dei tessuti gengivali infiammati, quindi, un metodo di ibridazione in situ usando un digossigenina (DIG) sonda di DNA -labeled è stato sviluppato e applicato con successo 10,11. Qui un protocollo dettagliato per la localizzazione di batteri nei tessuti inclusi in paraffina utilizzando P. gingivalis sonde eubatteriche specifico d'e universali è stata descritta. È particolarmente focalizzato sulla standardizzazione del metodo in modo che risultati simili possono essere riprodotti in altri laboratori. Questo protocollo permette la localizzazione dei batteri all'interno del loro contesto istologica e il resuLTS sono altamente riproducibili. Il protocollo descritto può essere utilizzato per localizzare batteri sia in modo specie-specifico o universale in vari tessuti. La sonda universale è particolarmente utile per rilevare batteri nelle malattie polimicrobiche e studiare un potenziale ruolo dei batteri nelle malattie dove il ruolo di batteri specifici non è noto.

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Protocollo

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1. Preparazione della sonda

  1. Amplificazione PCR della sonda
    1. Per la P. Sonda gingivalis -specific, amplificare un frammento di DNA 343 bp di P. gingivalis 16S rRNA mediante PCR utilizzando DNA genomico di P. gingivalis e le seguenti primer: 5'TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 'e 5'AGIRE CGT ATC GCC CGT TAT TC-3' 10. Eseguire amplificazioni con le seguenti condizioni ciclo: 35 cicli a 95 ° C per 30 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 1 min 20 sec seguita da un'estensione di 5 min a 72 ° C 10,11.
    2. Amplificare la sonda eubatterica con un 70-bp frammento di DNA (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG
      TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 ') sintetizzato come oligonucleotide ed i seguenti primer: 5'-CTG CAG GTR CMT GGY-3' e 5'-GTT AGG GCG CTC GTT-3 '11. Eseguire amplificazioni con le seguenti condizioni ciclo: 40 ciclia 9 4 ° C per 30 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 1 min 20 s seguita da un'estensione 5 min a 72 ° C 11,12.
    3. Precipitare i prodotti di PCR (≥500 microlitri) aggiungendo 3 M acetato di sodio (pH 5.2) e 100% etanolo (a 10: 1: 2) e incubando a -20 ° C per 2 ore.
    4. Centrifugare la miscela a 14.000 xg per 15 min, risospendere il pellet in 100 ml di tampone TE, e misurare la concentrazione di DNA dalla densità ottica a 260 nm.
  2. DIG-etichettatura utilizzando un sistema di etichettatura e il rilevamento kit DNA DIG
    1. Mescolare 3 ug della sonda con acqua ad un volume finale di 15 microlitri.
    2. Denaturare il DNA a 95 ° C per 10 minuti e raffreddare rapidamente sul ghiaccio.
    3. Aggiungere 2 ml di 10x hexanucleotide mix, 2 ml di dNTP etichettatura mix, e 1 ml di Klenow enzima per 15 ml di DNA denaturato.
    4. Mescolare e incubare a 37 ° C per 24 ore a 48 ore e interrompere la reazione mediante riscaldamento a 65 ° C.
  3. Controllare la sensibilità della sonda DIG marcato utilizzando una etichettatura e Detection Kit DNA DIG
    1. Caricare manualmente 1 ml di diluizioni seriali della sonda di controllo positivo previste nel kit e 1 ng di sonda DIG marcato sulla membrana di nylon e asciutto per 5 minuti a temperatura ambiente.
    2. Brevemente immergere la membrana in tampone 2x SSC (0,3 M NaCl, 30 mM citrato di sodio, pH 7,0) e incubare la membrana a 80 ° C per 1 ora per immobilizzare il DNA.
    3. Brevemente immergere la membrana in tampone acido maleico (MAB, 0,1 M di acido maleico, 0,15 M di NaCl, pH 7,5) e incubare con DIG anti-fosfatasi alcalina (AP) anticorpale coniugata diluito (1: 5.000) in 6 ml di soluzione di blocco, previsto nel kit a temperatura ambiente per 30 min.
    4. Lavare la membrana con MABT (MAB contenente 1% Tween 20) e applicare 40 microlitri della soluzione NBT / BCIP mescolato con 2 ml di tampone di rilevamento (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl 2, pH 9,5) sulla Membrana per 1 min. Se la sensibilità della sonda marcata ènon soddisfacente, ripetere i punti da 1.1.3 a 1.3.4.
    5. Misurare la concentrazione di DNA della sonda marcata (OD260) e regolare la concentrazione di 100 ng ml -1.
  4. Controllare la specificità della sonda marcata con DIG
    1. Denaturare campioni di DNA genomico (25 ng 3 microlitri -1 per ogni campione) da varie specie batteriche, tra il batterio bersaglio dalla sonda specifica, a 95 ° C per 10 minuti e raffreddare rapidamente sul ghiaccio.
    2. Caricare manualmente il DNA denaturato sulla membrana di nylon e asciugare per 20 minuti a RT.
    3. Brevemente immergere la membrana in tampone 2x SSC e incubare la membrana a 80 ° C per 2 ore per immobilizzare il DNA.
    4. Bloccare la membrana con una soluzione di saturazione a temperatura ambiente per 1 ora.
    5. Diluire la sonda 1 ng ml -1 in tampone di ibridazione, denaturare le sonde diluito, e applicare sulla membrana.
    6. Incubare la membrana a 45 ° C per 1 ora.
    7. Lavare la membrana a trevolte con tampone 2x SSC.
    8. Brevemente immergere la membrana in MAB.
    9. Incubare con anticorpo anti-DIG AP-coniugato diluito (1: 2.000) in 6 ml di soluzione bloccante a temperatura ambiente per 1 ora.
    10. Lavare la membrana con MABT e applicare 40 microlitri della soluzione NBT / BCIP mescolato con 2 ml di tampone di rilevamento.
    11. Quando la sonda non raggiunge la specificità previsto, aumentare la temperatura di ibridazione fino si osserva la specificità.

2. In Situ Ibridazione

Nota: per evitare l'asciugatura dei campioni e dei reagenti, eseguire tutte le incubazioni in una camera umidificata foderato con carta da cucina bagnato.

  1. De-paraffinization e reidratazione di sezioni di tessuto
    1. Preparare 4 micron sezioni di tessuto di spessore dai blocchi inclusi in paraffina. Formalina, paraformaldeide e fissativo a base di zinco sono compatibili con questo protocollo.
    2. Preparare tutti i reagenti con acqua DEPC-trattata.
    3. Diapositive calore in un forno a secco a 60 ° C per 30 min e incubare vetrini a temperatura ambiente per 30 min.
    4. Immergere i vetrini in 100% xilene per 5 minuti tre volte; utilizzare xilene fresco ogni volta.
      Nota: Effettuare questa procedura de-ceretta in una cappa.
    5. Immergere i vetrini in etanolo al 100% per 5 minuti due volte, con l'etanolo nuovo ogni volta, e reidratare i campioni in serie il 90%, 80% e le soluzioni di etanolo 70% per 5 minuti ciascuno.
    6. Immergere i vetrini in acqua DEPC trattati per 1 min e lavare i vetrini in DEPC trattati con PBS (pH 7.4) per 6 min.
  2. Pretrattamenti di sezioni di tessuto
    1. Immergere i vetrini in acido cloridrico 0,1 N per 20 minuti e lavare i vetrini in acqua DEPC trattati per 30 sec.
    2. Disegnare una barriera idrofobica campioni utilizzando una penna cera circostante.
      Nota: Le dimensioni della barriera idrofoba dipende dalle dimensioni dei campioni. Pertanto, i volumi dei reagenti usati nei seguenti passaggi variano a seconda delle dimensioni dei provini ma devono riempire il hybarriera drophobic (50 ml per i piccoli campioni e 400 ml per i grandi campioni).
    3. Trattare campioni con 50 a 400 ml di proteinasi K (da 1 a 10 mcg ml -1 in DEPC trattati con PBS) in un forno a secco a 37 ° C per 30 minuti e lavare i vetrini in DEPC trattati 1x PBS per 1 min.
    4. Immergere i vetrini in paraformaldeide al 4% in DEPC trattati con PBS per 10 minuti, poi lavare i vetrini in DEPC trattati con PBS per 1 min.
    5. Immergere i vetrini in 0,1 M trietanolammina-HCl (pH 8.0) contenente 0,5% di anidride acetica per 20 minuti e lavare i vetrini in acqua DEPC trattati per 30 sec.
  3. Ibridazione con sonda e lavaggio
    1. Immergere i vetrini in tampone SSC 2x per 20 min.
    2. Diluire la sonda a 1 ng ml -1 a tampone di ibridazione (4x SSC, il 50% [vol / vol] formammide, la soluzione di 1x Denhardt, il 10% [peso / volume] destrano solfato, 0.1% [peso / volume] solfato di sodio dodecil, 0,4 mg ml -1 sperma di salmone DNA). Per i controlli negativi, mescolare la sonda marcata conun 10-fold quantità in eccesso di sonda non marcata.
    3. Denaturare le sonde diluito e applicare 50 a 400 ml su sezioni di tessuto. Posizionare un vetrino sul vetrino e sigillare con smalto.
    4. Diapositive calore in macchina PCR a 90 ° C per 10 minuti e incubare vetrini in una camera umidificata O / N a 45 ° C o la temperatura ottimale determinato al punto 1.4.11.
    5. Raffreddare i vetrini a 4 ° C per 30 min, rimuovere vetrini ed immergere i vetrini in tampone SSC seriale come seguenti: 4x SSC per 10 minuti, pre-riscaldato (45 ° C) 2x SSC per 20 minuti, 2x SSC per 10 min, e 0.2x SSC per 10 min.
  4. Detection con anticorpo anti-DIG AP-coniugato
    1. Lavare i vetrini in MABT per 5 min.
    2. Blocco con 50 a 400 ml di soluzione 1% Tween 20 blocco per 20 min.
    3. Aggiungere 50 a 400 ml di anticorpo anti-DIG-AP diluito in soluzione bloccante (1: 1.000) anld incubare a 37 ° C per 90 min.
    4. Lavare i vetrini in MABT per 10 min.
    5. immergere i vetrini in tampone rilevamento contenente 1% Tween 20 per 5 min.
    6. Trattare con 50 a 400 μ di 1 levamisolo mM (in tampone rilevamento contenente 1% Tween 20) per 5 minuti per inattivare fosfatasi alcalina endogena.
    7. Distribuire 50 a 400 microlitri della soluzione premiscelata NBT / BCIP (diluito in tampone di rilevamento a 1: 100) su ciascun campione e incubare vetrini in una camera umidificata a temperatura ambiente per 2 o 3 ore finché il segnale sviluppato è soddisfacente.
    8. Risciacquare i vetrini con acqua deionizzata per fermare la visualizzazione e applicare 50 a 400 ml di 0,05% [wt / vol] verde metile come una macchia contatore a 37 ° C per 10 min.
    9. Risciacquare i vetrini con acqua deionizzata, disidratare in etanolo al 100%, ed immergere in xilene.
    10. Applicare 80 ml di soluzione di montaggio su ogni vetrino e coprire con coprioggetto.

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Risultati

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La figura 1 mostra puntino assorbente di sonde DIG-marcate rispetto con la sonda di controllo positivo fornito nel kit per determinare la loro sensibilità. Il 343 bp P. Sonda gingivalis -specific è 25 volte più sensibile rispetto alla sonda eubatterica 70 bp. La figura 2 mostra l'ibridazione in situ dei tessuti gengivali ottenuti da pazienti con parodontite cronica per il rilevamento di P. gingivalis e eubatteri. I segnali batteriche, mostrati in viol...

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Discussione

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Qui un protocollo per localizzare i batteri all'interno dei tessuti inclusi in paraffina utilizzando una sonda di DNA DIG marcato è stato descritto. La sonda obiettivi dei DNA o RNA molecole batterica gene 16S rRNA, e le sonde 16S rRNA-mirate può essere progettato come entrambe le specie-specifico o universale. L'ibridazione specifica del P. Sonda gingivalis -specific a P. gingivalis ma non ad altri batteri orali è stato mostrato in precedenza 10. Al contrario, la sonda euba...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione (2013R1A1A3005669) dal National Research Foundation di Corea e una borsa di studio (HI13C0016) del coreano Salute Technology R & S del progetto, Ministero della Salute e del Welfare.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anidride aceticaSigma6404
50% destrano solfato soluzioneMilliporeS4030
50X Denhardt' s soluzioneSigmaD2532
DEPCKitP159220
DIGRoche11 093 657 910
FormamideSigmaF9037
ImmEdge™ PennaDakoH-400
LevamisoleVectorSP-5000
Cloruro di magnesioSigma246964
Acido maleicoSigmaM0375
Verde metileSigmaM6776
ParaformaldeideSigmaP1648
PermountFisherSP15-500
Soluzione di DNA spermatozoi di salmoneInvitrogen#15632-011
Cloruro di sodioSigmaS9625
Citrato di sodioDuksanD1420
Sodio dodecil solfatoAmresco227
Trietanolammina-HClSigma90279
Tris-HClResearch organics3098T
di marcatura e rilevamento del DNA Sigma

Riferimenti

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