Rene Murine Tecnica trapianto

Sommario

L'obiettivo di questo manoscritto è descrivere i passaggi necessari per eseguire un trapianto di rene in un topo, prestando particolare attenzione ai dettagli dell'anastomosi arteriosa.

Abstract

La prima tecnica di trapianto di rene di topo è stata pubblicata nel 1973¹ dal laboratorio Russell. Sebbene ci siano voluti alcuni anni prima che altri laboratori diventassero esperti e utilizzassero questa tecnica, ora è ampiamente utilizzata da molti laboratori in tutto il mondo. Un significativo perfezionamento della tecnica originale che utilizzava l'aorta del donatore per formare l'anastomosi arteriosa al posto dell'arteria renale è stato sviluppato e riportato nel 1993 da Kalina e Mottram ² con un ulteriore progresso proveniente dallo stesso laboratorio nel 1999 ³. Sebbene si possa diventare esperti in questo modello, una ricerca in letteratura rivela che molti laboratori sperimentano ancora un'alta percentuale di perdita di innesto a causa di trombosi arteriosa. Descriviamo qui una tecnica che è stata ideata nel nostro laboratorio che riduce notevolmente il trombo arterioso riportato da altri ^4,5. Ciò si ottiene formando una cuffia del tallone e della punta dell'aorta infra-renale del donatore che facilita un'anastomosi più ampia e un flusso sanguigno più diretto nel rene.

Introduzione

Dal 1973 il modello di trapianto di rene nei topi è stato un valido strumento di ricerca, ma problemi tecnici hanno ostacolato la sua diffusione. Nel corso degli anni numerosi lavori sono stati pubblicati in dettaglio i miglioramenti / perfezionamenti a questa procedura. Come modello di principalmente vascolarizzato trapianto di organo solido questa procedura è probabilmente secondo solo al modello di trapianto di cuore eterotopico che è stato anche ideato dal laboratorio di Russell nel 1973 ^6. Entrambi i modelli si prestano alla ricerca sulle risposte di rigetto allogenico, lo sviluppo di ritardata funzionalità del trapianto e danno da ischemia riperfusione.

Uno dei problemi più comuni da segnalare con trapianto renale è relativamente alta incidenza di trombosi arteriosa ^4,5,7 che abbiamo anche sperimentato nel nostro laboratorio. Pertanto abbiamo deciso di effettuare una revisione della letteratura di formazione di trombi e forse trovare la causa di questo problema tecnico e di elaborare anche unapossibile soluzione. La causa più probabile di trombosi è il percorso alquanto tortuosa sangue prende dall'aorta destinatario, nell'aorta renale donatore poi all'arteria renale donatore. Questo percorso provoca turbolenza nella arteria renale che può portare all'attivazione delle piastrine e formazione di trombi. Sulla base delle recenti osservazioni e una ricerca di letteratura ^8-14 siamo arrivati ​​a una nuova tecnica che ha ridotto la trombosi a 0%.

La tecnica qui descritta varia da tecniche precedentemente riportati nella formazione di un bracciale tallone e punta arteriosa che strutture migliorate flusso sanguigno e riduce notevolmente la formazione di trombi. Il polsino è formata dividendo dell'aorta infra-renale attraverso la faccia della ostio arterioso renale con un angolo inferiore a ⁴⁵ ° rispetto all'asse longitudinale dell'aorta (Figura 1A e 1B). Ciò si traduce in un bracciale circa 2mm di lunghezza. Una patch Carrel venoso è formata da sezionare la rvena Enal nella IVC aumentando il diametro del bracciale. Il donatore addominale dell'aorta polsino tacco e punta infra-renale è end-to-side anastomizzata all'aorta addominale destinatario e la vena renale donatore / patch IVC è end-to-side anastomizzata al destinatario addominale vena cava inferiore (IVC) . L'uretere viene poi introdotto in ed ancorata alla vescica come descritto da Han et al ^3.

Per questo studio i trapianti non trattati con soli tempi di ischemia calda (es., Senza di ischemia fredda) si confrontano. In questo caso ischemia calda si riferisce al tempo dalla cessazione del flusso di sangue attraverso il rene donatore (passo 1.11) e riperfusione del graft nel ricevente (passo 2.11 sotto). Ischemia fredda si riferisce al tempo che il rene non è perfuso e si mantiene in celle frigorifere fino all'inizio della procedura di impianto.

Protocollo

Tutti i topi sono stati acquistati da The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME), e sono stati alloggiati in condizioni di libero patogeni presso l'Università del Colorado Denver, Facility Barbara Davis Animal Center secondo Linee Guida NIH e con l'approvazione della University of Colorado Denver IACUC.

1. Trapianto renale Harvest

1. Sterilizzare tutti gli strumenti, indossare guanti sterili durante tutta la procedura e mantenere un campo sterile. Eseguire tutti gli interventi chirurgici con l'uso di un microscopio operatorio.
2. Rimuovere chirurgicamente reni topo donatore da (kg IP 60mg /) donatori pentobarbital-anestetizzati. Accertare profondità dell'anestesia da punta pizzico, e osservare la frequenza respiratoria.
3. Agganciare la pelliccia quindi immobilizzare il mouse da vincoli a 4 vie. Preparare la pelle con iodio-povidone e drappeggio il mouse in modo sterile.
4. Fare un 2 centimetri linea mediana verticale incisione addominale e entrare nella cavità addominale. Ritrarre l'intestino superiormente ed esternare laal petto. Mantenere l'intestino avvolto in una garza sterile umido durante tutta la procedura.
5. Identificare i grossi vasi addominali e mobilitare, identificare eventuali rami lombari e sia cauterizzare o legare con 10/0 sutura in nylon.
6. Immediatamente distale vasi renali sinistra stuzzicare la vena cava inferiore (IVC) e aorta addominale (AA) a parte per via smussa su circa 2mm. Legare con 10/0 nylon e dividere piccolo arterioso e rami venosi dai vasi renali.
7. Ora separare la vena renale dalla arteria renale attentamente per via smussa di queste strutture. Questo consente la creazione accurata di una patch Carrel all'estremità prossimale della vena renale, che verrà utilizzata per formare una anastomosi end-to-side ai destinatari IVC.
8. Identificare, legare e sezionare i vasi surrenali sinistra. Questo consente l'accesso all'aorta surrenale e una sutura di seta 6-0 è collocato intorno l'aorta in preparazione per legatura, ma non legato in questo momento.
9. Mobilitare il rene, i vasi e dell'uretere dalla plancia circostante. Ruotare il rene a destra e legare / dividere i rami posteriori. Quindi tornare il rene di sinistra.
10. Ora dirigere l'attenzione per l'uretere. Senza scomodare l'ilo renale liberare l'uretere dal circostante plancia facendo attenzione a preservare i vasi ureterali. Dividere l'uretere a livello del dotto deferente. Il rene è ora pronto per il recupero.
11. Iniettare lentamente 300 unità di eparina nel distale IVC heparinizing così il donatore. Fissare la sutura di seta 6-0 disposte intorno al AA surrenale e profumato rene sinistro tramite l'aorta addominale distale con 0.8ml di soluzione di eparina salina (100 U / ml).
12. Una volta che la perfusione ha cessato creare una patch Carrel venoso immediatamente per eliminare il riflusso nel rene. Ritrarre la vena renale verso il rene rivelando l'AA e dell'arteria renale sotto.
13. Dividere l'aorta adiacente dell'arteria renale creando un tacco ee bracciale come mostrato in Figura 1. Rimuovere i reni, vasi e dell'uretere dal donatore.
14. Rimuovere il rene direttamente a un destinatario pre-preparati (0 min tempo di ischemia fredda) o conservati a 4 ^{° C in} una soluzione di scelta per un tempo predeterminato fino al momento dell'impianto. Eutanasia donatori di exsanguanation e dislocazione cervicale. Il tempo totale per il recupero del rene del donatore è di circa. 15-20 min.

2. Rene tecnica di impianto

1. Anestetizzare il mouse destinatario con pentobarbital (60 mg / kg IP dose iniziale, 25 mg dose supplementare / kg IP se richiesto). Accertare profondità dell'anestesia da punta pizzico, e osservare la frequenza respiratoria. Clip della pelliccia quindi immobilizzare il mouse da vincoli a 4 vie e applicare pomata oftalmica per gli occhi. Preparare la pelle con iodio-povidone e drappeggio il mouse in modo sterile.
2. Fare un 2 centimetri linea mediana verticale incisione addominale e entrare nella cavità addominale. Ritrarre l'intestinosuperiormente e externalize al petto. Mantenere l'intestino avvolto in una garza sterile umido durante tutta la procedura.
3. A questo punto eseguire una nefrectomia destra. Legare l'arteria e la vena renale con 6-0 punti di sutura in seta. Accise distale rene per le suture. Legare l'uretere con 6-0 seta e poi dividere prossimale al rene.
4. Isolare l'aorta addominale e vena cava inferiore (IVC) sotto i vasi renali. Mettere 4-0 legami di cotone attorno l'aorta e vena cava inferiore superiore poi inferiore al sito anastomosi. Identificare e legare eventuali vasi lombari all'interno del campo con 10-0 sutura in nylon.
5. Annodare i legami di cotone, prima l'inferiore, seguito dal superiore. In questo modo viene mantenuta del sangue nell'aorta rendendo il aortotomy facile.
6. Formare la aortotomy con un ago 30G per entrare nel lume dell'aorta. Estendere l'incisione con sottili forbici micro ad una lunghezza di circa 2 mm.
7. Effettuare la fine anastomosi lato della cuffia aortico donatore tacco e punta al'aorta destinatario nel seguente modo. Inserire un 10-0 nylon soggiorno suture stitch nell'aorta donatore e all'angolo inferiore dell'incisione nell'aorta destinatario e cravatta.
8. Posizionare un secondo 10-0 nylon opposto al primo nell'aorta donatore e l'angolo superiore dell'incisione in aorta addominale e cravatta. Fare una linea sutura continua da superiore a inferiore nella parete laterale dell'aorta e legare contro la permanenza punto precedentemente posizionato. Poi suturare la parete mediale in modo esecuzione e cravatta.
9. Effettuare la fine anastomosi lato della vena renale donatore al ricevente IVC nel seguente modo. Forare il IVC con un ago 30G ed estendere l'incisione con sottili forbici micro. Legare la vena renale donatore verso l'angolo inferiore della incisione nel IVC con 10-0 di nylon. Fare una linea di sutura che corre tra la vena renale e l'IVC e cravatta.
   NOTA: E 'di vitale importanza che tutto spessore passa l'ago di sutura tra cui il adventit vascolareia e l'intima sono raggiunti. Eversion dei bordi assicura anche che c'è intima-to-intima contatto, che aiuta nella chiusura e guarigione delle anastomosi. Mentre un agente di coagulazione emostatico può essere utile per ridurre le perdite, si raccomanda che un chirurgo invece contare su una buona tecnica.
10. Assicurarsi che le anastomosi sono "puliti". Vale a dire, che le pareti opposte, non sono catturati durante il posizionamento di punti. Questo provocherà un restringimento significativo di fluire che si tradurrà in un innesto fallito e, in casi estremi arto posteriore paralisi.
    NOTA: Un altro fattore estremamente importante è garantire che la tensione delle linee di sutura anastomotica anche ottimale. Troppo lenta e non ci saranno perdite irreversibili, troppo stretto e stenosi di fluire si tradurrà. Se sul lato arterioso questo si tradurrà in scarsa perfusione dell'innesto, se sul lato venoso comporterà un rene congestionata.
11. Rilasciare il distale flusso venoso 4-0 cotone tie ristabilire. Una volta emostasi del venonoi anastomosi è stata osservata gradualmente allentare la prossimale pareggio 4-0 in cotone e osservare la anastomosi arteriosa per l'emostasi.
12. Rimuovere le fascette di cotone dal mouse una volta entrambe le anastomosi sono considerati sicuri. Pierce vescica con un ago 20 G creando due fori.
13. Far passare la punta delle pinze curve attraverso i fori e tirare l'uretere donatore attraverso la vescica con la pinza con l'estremità prossimale dell'uretere essere ancorato alla parete della vescica con due 10-0 suture in nylon. Tagliare la lunghezza in eccesso dell'uretere sporge dal secondo foro permettendo l'uretere ritragga all'interno della vescica e chiudere il foro con due 10-0 suture in nylon.
14. Ritorna l'intestino all'addome. Chiudere la parete addominale in due strati con 5-0 sutura di seta in modo esecuzione.
15. Somministrare un bolo 1,0 ml di soluzione sterile, caldo normale soluzione fisiologica nell'addome come rianimazione fluido alla chiusura, e iniettare 0,8 ml di soluzione fisiologica normale per via sottocutanea nel post-operatorio. Nessun altro Supportigiocare cinque misure durante l'intervento sono obbligatori.
16. Recuperare l'animale su una coperta di riscaldamento. Tempo totale dell'impianto è di circa. 35-45 min. Somministrare analgesici come buprenorfina, 0,05 mg / kg, SC, 0,1-0,2 ml all'inizio della procedura e ogni 6-12 ore per 72 ore post-op.

3. controlaterale Nefrectomia

1. A seconda dei requisiti di protocollo, diversi giorni dopo la procedura di impianto, eseguire una nefrectomia controlaterale sotto anestesia isoflurano (5% isoflurano inalato per induzione, 1,5-2,0% per la manutenzione).
2. Inserire la cavità addominale e ritrarre delicatamente l'intestino al diritto degli animali. Esporre il rene sinistro e sezionare smussato dalla fascia circostanti.
3. Legare l'arteria renale, vena e dell'uretere con 6-0 punti di sutura in seta e poi asportare il rene sopra le suture e rimuovere il rene. Tempo operatorio totale è di circa. 10 min.

4. Graft Assessment

1. Misura siero Creatinove utilizzando il metodo del picrato alcalino (reazione Jaffe).

Risultati

Questa tecnica chirurgica consente sia per i semplici studi di sopravvivenza / rigetto dell'organo o protocolli sperimentali piuttosto complessi. Nelle figure di seguito dimostriamo i vantaggi di utilizzare questo miglioramento tecnica anastomosi arteriosa. Utilizzando questa tecnica abbiamo ridotto significativamente l'incidenza di trombosi arteriosa dal 35% allo 0%, aumentando così la produttività. Abbiamo usato questa tecnica per oltre un anno con lo stesso risultato trombosi 0% mantenuto. La Figura ...

Discussione

Padroneggiare questa tecnica di trapianto è difficile, ma una volta realizzato, è uno strumento di ricerca molto potente. Il paziente chirurgo / ricercatore sarà ricompensato dalla cura dei dettagli e la coerenza della tecnica, che è la chiave per padroneggiare qualsiasi procedura chirurgica, a maggior ragione nei piccoli modelli animali. Le difficoltà tecniche di padroneggiare il trapianto di rene di topo sono molte pieghe, ed è molto probabile che l'esperienza in altri modelli di piccole dimensioni trapianto anima...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Strumento	Roboz #	Fine Science Tools #	Arosurgical #
Pinza per microdissezione diritta #5	RS-5015	11295-51
Pinza per microdissezione curva #7	RS-5047	11297-00
Pinza per	RS-5137	11052-10
Forbici per microdissezione Vannas, corte	RS-5610		09.140.08
Forbici per microdissezione, dritte, affilate, lunghe		11.602.11
Porta aghi con manico a molla micro	11.549.15
	per zanzare diritta	91308-12
Forbici per microdissezione, diritte, smussate	RS-5962	14078-10
Forbici per microdissezione, curve, smussate	RS-5981	14079-10
Micro divaricatore	RS-6540
Vassoio portastrumenti, 10" x 6 ½ ” x ¾ "	RT-1350S
Sutura in seta, 5/0, bobina da 22,5 m	18020-50
		Applicatori in
BD 1cc insulina, #329424		Fisher-brand, #23-400-100
			di iodio povidone
PDI, #B40600
4/0 Cravatte
Cotone domestico autoclavato con strumenti