Il silenziamento genico da parte di siRNA rappresenta una comoda strategia sperimentale per analizzare le funzioni biologiche dipendenti da BRCA2 con implicazioni immediate per comprendere meglio la biologia del cancro. Viene presentato un metodo per silenziare in modo efficiente BRCA2, insieme alla procedura sperimentale per rilevare e quantificare i cambiamenti nell'espressione della proteina BRCA2 mediante immunoblotting in linee cellulari umane.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
In questo articolo
Sommario
Abstract
Silenziamento della proteina BRCA2 soppressore del tumore e la sua individuazione da analisi biochimiche convenzionali rappresentano una grande sfida tecnica a causa delle grandi dimensioni della proteina BRCA2 umana (circa 390 kDa). Riportiamo modifiche di protocolli di trasfezione e immunoblotting siRNA standard per tacere BRCA2 umano e rilevare proteina BRCA2 endogena, rispettivamente, nelle linee di cellule epiteliali umane. Passaggi chiave includono un alto siRNA rapporto reagente di trasfezione e due successivi turni di siRNA trasfezione all'interno dello stesso esperimento. Utilizzando queste e altre modifiche al protocollo standard che costantemente raggiungere oltre il 70% silenziamento del gene BRCA2 umano come giudicato da immunoblotting con anticorpi anti-BRCA2. Inoltre, denaturazione dei lisati cellulari a 55 ° C invece che nel tradizionale 70-100 ° C e altre ottimizzazioni tecniche della procedura immunoblotting consentono di individuare proteina BRCA2 intatta anche when molto basse quantità di materiale di partenza sono disponibili o quando i livelli di espressione della proteina BRCA2 sono molto basse. Silenziamento efficiente di BRCA2 nelle cellule umane offre una valida strategia per interrompere la funzione BRCA2 in cellule con BRCA2 intatte, comprese le cellule tumorali, per esaminare nuovi percorsi molecolari e funzioni cellulari che possono essere interessati da mutazioni BRCA2 patogeni nei tumori. L'adattamento di questo protocollo per tacere e l'analisi di altre proteine "grandi" come BRCA2 efficiente dovrebbe essere facilmente realizzabile.
Introduzione
Il BRCA2 (Breast Cancer suscettibilità gene-2) gene codifica per una proteina soppressore del tumore che gioca un ruolo cruciale nella riparazione del DNA rotture del doppio filamento regolando la funzione dell'enzima recombinase Rad51 1. BRCA2 è stato anche coinvolto nella modulazione della trascrizione e nel controllo del ciclo cellulare 2. Mutazioni germinali nel gene BRCA2 inducono un autosomica dominante suscettibilità cancro al seno e alle ovaie nelle donne e il cancro alla prostata negli uomini, nonché la predisposizione di altri tipi di cancro 3,4. Tuttavia, nonostante l'aumento del rischio di svilupp....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Preparare le soluzioni di siRNA
- Risospendere 5 nmol di strapazzate (Ctrl) e 5 nmol di BRCA2 siRNA pellet secchi in 100 ml di acqua RNase-free (concentrazione siRNA finale: 50 micron). Questo è lo stock siRNA e deve essere conservato a -20 ° C in 10 microlitri aliquote.
- Prendete una aliquota di 10 ml dal magazzino siRNA e aggiungere 40 ml di acqua RNase-free per ottenere la soluzione di lavoro 10 micron siRNA. Questa diluizione deve essere conservata a -20 ° C fino al momento dell'uso.
NOTA: La soluzione di lavoro siRNA non deve essere sottoposto a congelamento / scongelamento più di 3 volte.
....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Prima di procedere con un saggio biologico / biochimico per esaminare l'effetto di silenziamento BRCA2 sulle funzioni cellulari, il primo passo è per confermare la specificità del silenziamento utilizzando un siRNA criptato (non-targeting siRNA) fianco a fianco con BRCA2 siRNA (Figura 1A ). E 'importante eseguire una seconda tornata di siRNA trasfezione con un elevato rapporto siRNA / trasfezione per ottenere un'elevata efficienza di silenziamento BRCA2. In effetti, l'e.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
A causa mutazioni germinali del gene BRCA2 piombo ad un aumentato rischio di diversi tipi di cancro, tra cui il cancro al seno maschile e femminile, il cancro ovarico, il cancro alla prostata, cancro al pancreas, e il melanoma 3,4, sono state avviate una serie di studi per comprendere la funzione biologica della proteina BRCA2. La maggior parte di questi studi sono genetiche a base principalmente a causa di difficoltà tecniche analizzando una proteina gigante come BRCA2. Il metodo descritto qui di si.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni FIRB-Merit RBNE08YFN3_005 e RBNE08HWLZ_012 e dal Ministero dell'Economia e delle Finanze italiano al CNR per il progetto "FaReBio di Qualità".
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BRCA2 siRNA | Dharmacon | L-003462-00 | SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA |
| Ctrl siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | Reagente RNAiMAX per pool di lipofectamina non mirato ON-TARGETplus |
| Life Technologies | 13778075 | Reagente di trasfezione | |
| OPTI-MEM I Siero ridotto Medium | Life Technologies | 31985-070 | Terreno per procedura di trasfezione |
| NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel prefabbricato | Life Technologies | EA0378 | Gel per elettroforesi proteica |
| NuPAGE LDS Tampone del campione | Life Technologies | NP0007 | Reagente per elettroforesi delle proteine |
| NuPAGE Agente riducente del campione (10x) | Life Technologies | NP0004 | Reagente per l'elettroforesi delle proteine |
| NuPAGE Antiossidante | Life Technologies | NP0005 | Reagente per l'elettroforesi delle proteine |
| HiMark Standard delle proteine Life | Technologies | LC5699 | Marker prestainato per gel elettroforesi |
| XCell SureLoc Mini-Cell System | Life Technologies | EI0002 | Apparecchiatura per elettroforesi/trasferimento di proteine |
| NuPAGE Tris-Acetato SDS Running Buffer | Life Technologies | LA0041 | Reagente per Western blotting |
| Membrana PVDF | Millipore | IPVH00010 | Reagente per Western blotting |
| NuPAGE Transfer Buffer | Life Technologies | NP0006-1 | Reagente per Western blotting |
| BRCA2 H-300 coniglio anticorpo policlonale | Santa Cruz Biotechnology | sc-8326 | diluizione 1:300 |
| Anticorpo monoclonale beta-tubulina | Sigma Aldrich | T4026-100UL | 1:1.000 diluizione |
| Latte scremato in polvere | Sigma Aldrich | 70166 | Reagente per Western blotting |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | Reagente per Western blotting |
| SuperSignal West Pico/Femto Substrato chemiluminescente | Pierce Thermo Scientific | 34080/34096 | Sistema di chemiluminescenza |
| PNT1A cellule | SIGMA Aldrich (per ECACC) | 95012614 | PNT1A epitelio prostatico umano normale immortalato con cellule SV40 |
| Nthy | SIGMA Aldrich (per ECACC) | 90011609 | Nthy-ori 3-1 Linea cellulare umana, cellule epiteliali follicolari tiroidee |
| Proliferazione cellulare Kit I (MTT) | Roche | 11465007001 | Kit per saggi di proliferazione cellulare |
Riferimenti
- Thorslund, T., West, S. C. BRCA2: a universal recombinase regulator. Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).
- Yoshida, K., Miki, Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer Sci. 95<....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
