Ex vivo ERG può essere utilizzato per registrare l'attività elettrica delle cellule retiniche direttamente da retine intatte isolate di animali o esseri umani. Dimostriamo qui come i comuni sistemi ERG in vivo possano essere adattati per registrazioni ERG ex vivo al fine di sezionare l'attività elettrica delle cellule retiniche.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Un segnale di elettroretinogramma in vivo (ERG) è composto da diversi componenti sovrapposti provenienti da diversi tipi di cellule retiniche, nonché da rumore proveniente da fonti extra-retiniche. Ex vivo ERG fornisce un metodo efficiente per sezionare la funzione delle cellule retiniche direttamente da una retina isolata intatta di animali o occhi di donatori. Inoltre, l'ERG ex vivo può essere utilizzato per testare l'efficacia e la sicurezza di potenziali agenti terapeutici sul tessuto retinico di animali o esseri umani. Mostriamo qui come i sistemi ERG in vivo disponibili in commercio possano essere utilizzati per condurre registrazioni ERG ex vivo da retine di topo isolate. Combiniamo le unità di stimolazione luminosa, elettronica e riscaldamento di un sistema standard in vivo con portacampioni progettato su misura, sistema di perfusione a gravità controllata e schermatura elettromagnetica del rumore per registrare simultaneamente segnali ERG ex vivo a basso rumore da due retine con il software di acquisizione incluso in commercial in vivo Sistemi. Inoltre, dimostriamo come utilizzare questo metodo in combinazione con trattamenti farmacologici che rimuovono specifici componenti ERG al fine di sezionare la funzione di alcuni tipi di cellule retiniche.
Introduzione
Elettroretinogramma (ERG) è una tecnica ben consolidata che può essere utilizzato per registrare l'attività elettrica della retina innescata dalla luce. Il segnale ERG è generato principalmente dalle variazioni di tensione causate da correnti radiali (lungo l'asse dei fotorecettori e cellule bipolari) scorre nello spazio extracellulare resistivo della retina. Il primo segnale ERG è stato registrato nel 1865 dal Holmgren dalla superficie di un occhio di pesce 1. Einthoven e Jolly 1908 2 diviso la risposta ERG all'insorgenza di luce in tre differenti onde, denominato a-, b-, e c-onde, che sono ormai noti per riflettere principalmente l....
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Protocollo
Tutti i protocolli sperimentali sono stati in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato istituzionale Animal Studies presso la Washington University.
1. Impostazione perfusione e Campione di laboratorio
- Preparare la soluzione per perfusione retina fresco il giorno dell'esperimento. Utilizzare acqua distillata e deionizzata. Utilizzare una delle seguenti tre soluzioni.
- Preparare Bicarbonato contenenti 'soluzione (1 L): 1 bottiglia di Ames' Ames media e 1,9 g di NaHCO 3,
- Preparare la soluzione di Locke (in mM): 112.5 NaCl....
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Risultati
Abbiamo registrato risposte flash di tipo selvaggio adattata al buio (WT) C57BL / 6 retine topo seguendo i protocolli sperimentali sopra descritte ed illustrate in figura 1 utilizzando diverse soluzioni standard di perfusione (Figura 2). Le forme d'onda di risposta e la cinetica e sensibilità bastoncelli apparsi simili in Ames 'e mezzi di Locke (Figura 2A e B). D'altra parte, in soluzione di Ringer HEPES-buffered (senza bicarbonato o 5% CO <.......
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Discussione
Dimostriamo qui i passaggi critici per l'ottenimento di alta qualità ex registrazioni vivo ERG contemporaneamente da due retine isolate del mouse utilizzando componenti in vivo del sistema ERG insieme ad un ex vivo adattatore ERG. In questo studio abbiamo perfusione entrambe le retine da animali con la stessa soluzione (sia Ames ', Locke o Ringer), ma è anche possibile perfusione ogni retina con una soluzione diversa per esempio, a scopo di test di droga. I pass.......
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Dichiarazioni
Washington University di St. Louis ha un accordo di licenza con Xenotec, Inc. e può ricevere una royalty dalla vendita dell'adattatore ex vivo.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH sovvenzioni EY019312 e EY021126 (vjk), EY002687 al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive presso la Washington University, e da Research per prevenire la cecità.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| In vivo Sistema ERG | OcuScience | HMsERG | www.ocuscience.us/id77.html |
| In vivo Sistema ERG | LKC Technologies | UTAS-E 3000 | www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html |
| Ex adattatore vivo | OcuScience | Ex VIVO ERG adapter | www.ocuscience.us/id107.html |
| Microscopio per dissezione | North Central Instruments | Leica M80 | Può utilizzare qualsiasi marca |
| emettitore IR | Opto Diode Corp. | OD-50L | www.optodiode.com |
| Prowler Visori notturni | B.E. Meyers Electro Optics | D4300-I | Prodotto di livello militare. |
| Filtro rosso | Rosco Laboratories | Roscolux #27 Medio Rosso | Può essere utilizzato al posto del sistema IR |
| Luce frontale rossa | OcuScience | ERGX011 | www.ocuscience.us/catalog/i29.html |
| Microscissors | WPI, Inc. | 500086 | www.wpiinc.com/ |
| Dumont pinzette #5 | WPI, Inc. | 14101 | |
| Lame di rasoio | Microscopia elettronica Scienze | 72000 | www.emsdiasum.com |
| Scala | Metler Toledo | AB54-S/FACT | a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Può utilizzare qualsiasi marcaMisuratore di |
| pH ed elettrodo | Beckman Coulter | pHI 350 | Può utilizzare qualsiasi marca |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Può utilizzare qualsiasi marca |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60129 | Può utilizzare qualsiasi marca |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63020 | 1.0 M soluzione |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21114 | 1.0 M soluzione |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | Può utilizzare qualsiasi marca |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Può utilizzare qualsiasi marca |
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich | S6297 | Può utilizzare qualsiasi marca |
| Ames medium | Sigma-Aldrich | A1420 | Può utilizzare qualsiasi marca |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | B0750 | Può utilizzare qualsiasi marca |
| DL-AP4 | Tocris Bioscience | 101 | Può utilizzare qualsiasi marca |
| Acido succinico sale disodico | Sigma-Aldrich | 224731 | Può utilizzare qualsiasi marca |
| Acido L-glutammico | Sigma-Aldrich | G2834 | Può utilizzare qualsiasi marca |
| D-(+)-Glucosio | Sigma-Aldrich | G7528 | Può utilizzare qualsiasi marca |
| Terreno di coltura Leibovitz L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | Può utilizzare qualsiasi marca |
| di vitamine MEM | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| aminoacidi MEM | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| Carbogen | Airgas | UN3156 | 5% CO2 |
Riferimenti
- Armington, J. C. The Electroretinogram. , Elsevier Science & Technology Books. (1974).
- Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43(1908).
- Granit, R.
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Ristampe e permessi
