Articolo metodologico

Simultaneo Ex vivo Test funzionale di due retine per In vivo Sistema Elettroretinogramma

DOI:

10.3791/52855

⸱

6 maggio 2015

 , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Washington University in St. Louis

In questo articolo

Sommario

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Ex vivo ERG può essere utilizzato per registrare l'attività elettrica delle cellule retiniche direttamente da retine intatte isolate di animali o esseri umani. Dimostriamo qui come i comuni sistemi ERG in vivo possano essere adattati per registrazioni ERG ex vivo al fine di sezionare l'attività elettrica delle cellule retiniche.

Abstract

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Un segnale di elettroretinogramma in vivo (ERG) è composto da diversi componenti sovrapposti provenienti da diversi tipi di cellule retiniche, nonché da rumore proveniente da fonti extra-retiniche. Ex vivo ERG fornisce un metodo efficiente per sezionare la funzione delle cellule retiniche direttamente da una retina isolata intatta di animali o occhi di donatori. Inoltre, l'ERG ex vivo può essere utilizzato per testare l'efficacia e la sicurezza di potenziali agenti terapeutici sul tessuto retinico di animali o esseri umani. Mostriamo qui come i sistemi ERG in vivo disponibili in commercio possano essere utilizzati per condurre registrazioni ERG ex vivo da retine di topo isolate. Combiniamo le unità di stimolazione luminosa, elettronica e riscaldamento di un sistema standard in vivo con portacampioni progettato su misura, sistema di perfusione a gravità controllata e schermatura elettromagnetica del rumore per registrare simultaneamente segnali ERG ex vivo a basso rumore da due retine con il software di acquisizione incluso in commercial in vivo Sistemi. Inoltre, dimostriamo come utilizzare questo metodo in combinazione con trattamenti farmacologici che rimuovono specifici componenti ERG al fine di sezionare la funzione di alcuni tipi di cellule retiniche.

Introduzione

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Elettroretinogramma (ERG) è una tecnica ben consolidata che può essere utilizzato per registrare l'attività elettrica della retina innescata dalla luce. Il segnale ERG è generato principalmente dalle variazioni di tensione causate da correnti radiali (lungo l'asse dei fotorecettori e cellule bipolari) scorre nello spazio extracellulare resistivo della retina. Il primo segnale ERG è stato registrato nel 1865 dal Holmgren dalla superficie di un occhio di pesce 1. Einthoven e Jolly 1908 2 diviso la risposta ERG all'insorgenza di luce in tre differenti onde, denominato a-, b-, e c-onde, che sono ormai noti per riflettere principalmente l'attività dei fotorecettori, cellule bipolari ON, e dell'epitelio pigmentato cellule, rispettivamente 3-8. ERG può essere registrato dagli occhi di animali o esseri umani (in vivo) anestetizzati, dalla preparazione isolato occhio 9, attraverso isolato retina intatto (ex vivo) 3,10-15 o attraverso strati della retina specifici con i microelettrodi (localeERG) 4,16. Di questi, in vivo ERG è attualmente il metodo più usato per valutare la funzione della retina. Si tratta di una tecnica non invasiva che può essere usato per scopi diagnostici o per seguire la progressione di malattie retiniche negli animali o pazienti. Tuttavia, in vivo registrazioni ERG producono un segnale complicato con diversi componenti sovrapposti, spesso contaminato da rumore extraocular fisiologico (ad esempio, la respirazione e l'attività cardiaca).

ERG locale può essere utilizzato per registrare il segnale attraverso strati specifici della retina ma è il più invasivo e ha il segnale-rumore più basso (SNR) rispetto alle altre configurazioni di registrazione ERG. ERG locale è anche tecnicamente impegnativo e richiede costose attrezzature (ad esempio, microscopio e micromanipolatori). Transretinal ERG dal intatto, isolato retina (ex vivo ERG) offre un compromesso tra in vivo e metodi ERG locali permettendo stabile e high SNR registrazioni da retine intatte di animali o esseri umani 17. Recentemente, questo metodo è stato utilizzato con successo per studiare l'asta e cono fotorecettori funzione in mammiferi, primati e umani retine 18-20. In aggiunta, a causa dell'assenza di dell'epitelio pigmentato in ex vivo retina, il componente c-onda positiva del segnale ERG viene rimosso e un componente importante negativo lento PIII è rivelato nelle ex vivo registrazioni. Il componente lenta PIII è stato dimostrato che provengono dalla attività delle cellule glia Müller nella retina 21-23. Così, ex vivo metodo ERG potrebbe essere utilizzato anche per studiare le cellule Müller nella retina intatto. Diversi studi hanno anche dimostrato che ex vivo registrazioni ERG potrebbero essere utilizzati per misurare la concentrazione di agenti farmacologici in giro per la retina 24 e testare la sicurezza e l'efficacia dei farmaci 25-27.

Commerciale multipla sistemi in vivo sono disponibili eutilizzato in molti laboratori che non hanno necessariamente vasta elettrofisiologia sfondo. Al contrario, ex vivo dispositivi non sono stati disponibili fino a poco 17 e come risultato solo pochi laboratori sono attualmente in corso vantaggio di questa tecnica potente. Sarebbe utile per effettuare registrazioni ex vivo ERG disponibile per più laboratori per far avanzare le nostre conoscenze sulla fisiologia della retina e la patologia, e di sviluppare nuove terapie per le malattie accecante. Dimostriamo qui un dispositivo semplice ed economico ex vivo ERG 17 e mostriamo come può essere utilizzato in combinazione con diversi sistemi disponibili in commercio in vivo ERG per registrare la segnalazione Rod- e cono-mediata (a- e b-onde) e la funzione di cellule Müller (lenta PIII) da intatte retine di topo wild-type.

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Protocollo

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Tutti i protocolli sperimentali sono stati in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato istituzionale Animal Studies presso la Washington University.

1. Impostazione perfusione e Campione di laboratorio

  1. Preparare la soluzione per perfusione retina fresco il giorno dell'esperimento. Utilizzare acqua distillata e deionizzata. Utilizzare una delle seguenti tre soluzioni.
    1. Preparare Bicarbonato contenenti 'soluzione (1 L): 1 bottiglia di Ames' Ames media e 1,9 g di NaHCO 3,
    2. Preparare la soluzione di Locke (in mM): 112.5 NaCl, 3.6 KCl, 2,4 MgCl 2, 1.2 CaCl 2, 10.0 HEPES, 20.0 NaHCO 3, 3.0 Na succinato, 0,5 Na glutammato, 0,02 EDTA, e 10,0 di glucosio, 0,1% vitamine MEM e ammino Acidi
    3. Preparare soluzione tamponata HEPES Ringer (in mM): NaCl 133,3, KCl 3,3, 2,0 MgCl 2, 1.0 CaCl 2, 10.0 glucosio, 0,01 EDTA, 12.0 HEPES, pHregolato a 7,5 con ~ 5,8 ml di 1 M NaOH, aggiungere 0,72 g / L Leibovitz mezzo di coltura L-15. Usare 20 - 50 mM DL-AP4 e 50 - 100 pM BaCl 2 per isolare la risposta fotorecettore con qualsiasi mezzo di perfusione.
  2. Preparare la soluzione per elettrodi 28 (in mM): NaCl 140,0, KCl 3.6, 2.4 MgCl 2, 1.2 CaCl 2, 3, HEPES 0,01 EDTA e aggiustare il pH a 7,4-7,5 con NaOH. Soluzione elettrodo può essere conservata a temperatura ambiente per diversi mesi.
  3. Preparare e testare il supporto del campione.
    1. Incollare il nero / carta grigia filtro in cima alle cupole della parte inferiore del titolare del campione (vedi Figura 1A). Distribuire accuratamente bicomponente 5 min colla epossidica intorno ai bordi delle cime piane delle cupole. Se necessario, farlo al microscopio dissezione.
    2. Attendere che la colla è quasi asciutto (circa 4 min) e premere la carta filtro cupole utilizzando un elemento piatta. Carta da filtro colla almeno un giorno prima dell'esperimento. Ilcarta da filtro può essere utilizzato più volte, ma deve essere sostituito dopo un mese di registrazioni. Usa il 70% di etanolo per pulire accuratamente cupole da eventuali residui di colla prima di installare la carta sostitutiva.
    3. Riempire i canali degli elettrodi con soluzione elettrodo cercando di evitare le bolle d'aria e vite elettrodi pellet chiusa con un adattatore filettato nei canali elettrodi (vedi figure 1 A e B). Collegare i superiore e inferiore pezzi del supporto del campione con quattro viti e riempire le linee di perfusione con soluzione elettrodi.
    4. Misurare la resistenza e la tensione tra i conduttori di ciascuna coppia di elettrodi con un multimetro (Figura 1B). La resistenza deve essere inferiore a 100 Ωk e la tensione sotto 10 mV se i canali sono senza bolle e gli elettrodi sono in buone condizioni.
  4. Versare 400-700 ml di supporti perfusione nella bottiglia. Indipendente altri 300 ml da utilizzare nella dissezione di retine e sstrappò in un frigorifero. Impostare il tubo di perfusione nel blocco scambiatore di calore e posizionare il blocco preriscaldato sulla piastra di riscaldamento (vedi Figura 1D).
  5. Racchiudere la bottiglia con un tappo che ha collegamenti di CO 2 / O 2 gas (se si usa Ames 'o Locke) e per le tubazioni perfusione (Figura 1D). Preriscaldare la bottiglia con il supporto a 37 o C e posizionarlo sulla piastra di riscaldamento o sulla parte superiore dell'unità stimolazione luminosa in bagnomaria a 37-39 ° C 17.
    1. Prime linee di perfusione di riempimento d'supporti perfusione di avviare il flusso di gravità-driven.
      1. Nel sistema LKC, posizionare la bottiglia sulla parte superiore dell'unità stimolatore 17 per fornire un flusso gravitazionale significativo che viene poi regolata da regolatori di portata senza essere influenzato dal livello di riduzione della soluzione di perfusione nella bottiglia durante l'esperimento.
      2. Nel sistema di Ocuscience, posizionare il pbottiglia erfusion all'interno della gabbia di Faraday per minimizzare il rumore e posizionare linee di uscita lungo perfusione del portacampioni (vedi passo 2.8) ben al di sotto del livello del portacampioni (e bottiglia perfusione) per aumentare l'azionamento gravitazionale della soluzione. Schermare le linee di uscita e collegare lo schermo a terra dell'amplificatore per evitare l'accoppiamento del rumore elettromagnetico al segnale ERG.
  6. Regolare la perfusione di 3 - 5 ml / min utilizzando regolatori di portata. Collegare 5% di CO 2/95% O 2 gas da una bombola con una corretta regolazione e regolare la portata per garantire gorgoglio costante dei mezzi di comunicazione nella bottiglia attraverso una pietra d'aria.

Preparazione 2. campione

  1. Montare gli strumenti di dissezione pulite e nitide compreso microscissors straight-lame, uno o due 45 o pinzette, lama di rasoio e un pezzo rettangolare di carta da filtro.
  2. Versare circa 200 ml di perfu freddosoluzione sione in un grande piatto Petri in modo che tutta la parte inferiore del supporto del campione (comprese le cupole) può essere immerso nella soluzione. Questo passaggio diventa importante quando si monta la retina sui cupole (vedi punto 2.6). Sebbene alcune soluzioni sono progettate per essere saturo di CarboGen (5% CO 2/95% O 2), questo non è essenziale ai fini di dissezione e non è stato fatto negli esperimenti qui descritti.
  3. Per un tipico esperimento, tenere gli animali in 12/12 ore scuro ciclo / luce e buio si adattano per 6-12 ore prima delle registrazioni. Euthanize l'animale da CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale sotto fioca luce rossa e fare tutte le seguenti procedure previste fioca luce rossa o IR (usare, ad esempio, il filtro rosso davanti alla sorgente luminosa del microscopio).
    1. Estrarre gli occhi con l'ausilio di una pinzetta e metterli nei media. Inserire un occhio per volta su un piccolo pezzo di carta (ad esempio, carta da filtro regolare) e fare comeilluminato approssimativamente il livello di ora serrata tenendo l'occhio con una pinzetta (questo è fatto di fuori della soluzione qui).
  4. Tagliare lungo la serrata (o più vicino all'equatore dell'occhio) con microscissors e rimuovere la cornea e la lente. Posizionare l'oculare nei media freddo nella grande capsula di Petri e ripetere la stessa procedura con l'altro occhio.
  5. Tagliare una piccola incisione dall'alto della tazza occhio verso il nervo ottico, mantenendo la forbice tra la retina e sclera per mantenere la retina intatto possibile. Grip sclera da entrambi i lati dell'incisione utilizzando due pinzette e tirare le pinzette distanti per staccare la retina.
    1. Tagliare il nervo ottico e tentare di isolare la retina con una quantità minima di contatto fisico alla superficie distale. RPE sarà principalmente staccare automaticamente dalla retina durante il processo di dissezione. È più importante evitare disturbo meccanico della retina che per eseguire ladissezione rapidamente, generalmente retine può essere incubato almeno 30 min in soluzione senza effetti significativi sulle proprietà di risposta.
  6. Montare le retine sulle cupole del supporto del campione (Figura 1C). Immergere la parte inferiore del supporto del campione nella scatola di Petri con la retina sezionato. Scorrere la retina, fotorecettori lato (la superficie convessa della retina isolata) verso l'alto, sopra la cupola e sollevare il supporto del campione in modo che la retina attacca sulla carta da filtro. Ripetere la procedura per l'altro retina.
  7. Asciugare con cura la piastra porta per evitare interferenze elettriche tra la retina, così come il rumore e il segnale shunt. Portacampione anelli O-ring intorno cupole parte inferiore per impedire soluzione fuoriuscita tra il fondo e le parti superiori del titolare, nonché per aiutare l'isolamento elettrico dei fotorecettori e cellule gangliari lati dei singoli retine. Fissare la parte superiore del supporto con le quattro viti (Figura 1B) e riempire i canali di perfusione con soluzione di perfusione utilizzando una siringa e un ago.
  8. Trasferire il titolare del campione accanto al blocco scambiatore di calore e collegare le linee di ingresso e di uscita di perfusione al titolare del campione (Figura 1D). Collegare gli elettrodi all'amplificatore ERG (top elettrodi collegano alla terra / meno pin nel amplificatore) e collegare l'unità stimolatore / di controllo sul supporto del campione utilizzando un adattatore o far scorrere la piastra elettrica nell'unità stimolatore a seconda di quale in vivo Sistema ERG è utilizzato.

3. Registrazioni

  1. Configurare le impostazioni dell'amplificatore e di stimolo utilizzando il software del sistema in vivo. Impostare la frequenza di acquisizione di un valore compreso tra 1 e 10 kHz e filtrazione passabasso a 300 Hz. Non utilizzare il filtro passa-alto. Utilizzare 60 Hz (o 50 Hz in Europa) segnare il filtro, se necessario.
  2. Record di base senza stimolazione luminosa e lo spiritoh stimolazione dim (ad es., la luce verde di -35 dB o 0.3 mCd sm -2) per testare per buon collegamento elettrico tra gli elettrodi e il campione retina. Attendere 10 - 20 min prima di iniziare la raccolta di dati in modo che la temperatura e la funzione retinica raggiungere uno stato stabile.
    1. Scegli i parametri di stimolo secondo qualsiasi esperimento specifico e avviare la raccolta dei dati. Ad esempio, utilizzare la luce verde da -40 a 0 dB o da 0,1 fino a 1.000 mCd sm -2 per una famiglia risposta scotopic. Usa circa 2 a 3 log-unità più luminoso lampeggia registrazioni fotopiche dove aste devono essere soppressi dalla luce di fondo (3-30 Cdm -2) o un'unità flash sonda (circa 1,3 Cd sm -2 = 1 dB, vedi figura 3).
    2. Tuttavia, ricordare che gli esatti valori di intensità della luce potrebbe essere un po 'dipende dal sistema di calibrazione e condizioni sperimentali. Come regola generale, le intensità di scala in calo di 5 - 10 volte rispetto a in vivo registrazioni quando si utilizza la luce verde 17. Un coperchio nero con aperture sopra la retina (inclusi nel sistema adattatore commerciale) può essere utilizzato per ridurre la dispersione della luce nel portacampioni e facilitare omogenea e stimolo uguale dei due retine dalla sfera Ganzfeld dei sistemi commerciali in vivo.
      NOTA: Per le registrazioni di retina adattata al buio, le intensità dei lampi di prova utilizzati in un tipico esperimento di candeggina solo una frazione trascurabile del pigmento in modo che la mancanza di rigenerazione RPE-driven non è un problema. Inoltre, è stato precedentemente dimostrato che la rigenerazione pigmento cono può ancora avvenire nella retina isolata mediante la cella Müller ciclo visivo 20.
  3. Come esperimenti durano in genere da 30 minuti fino a diverse ore, monitorare la deriva della linea di base, il livello di rumore e la stabilità di risposta durante l'esperimento come movimenti di questi potrebbero indicare problemi tecnici.
    NOTA: L'aumento o la diminuzione del rumoreampiezze d risposta possono indicare bolle d'aria nei canali di perfusione o elettrodi, troppo bassa o alta temperatura, la soluzione di perdita / fuoriuscita o spostamento della retina.

4. Pulizia

  1. Staccare il supporto del campione dalle linee di perfusione, aprirlo e lavare la retina dalla carta da filtro. Rimuovere gli elettrodi e sciacquare con acqua distillata (non utilizzare etanolo). Pulire il supporto del campione (compresi i canali di perfusione) con etanolo e / o di acqua distillata. Tubazione perfusione Lavare accuratamente con> 70% di etanolo.
  2. Sciacquare la bottiglia di perfusione con acqua distillata (non utilizzare detergenti). L'etanolo può essere utilizzata anche per pulire la bottiglia.

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Risultati

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Abbiamo registrato risposte flash di tipo selvaggio adattata al buio (WT) C57BL / 6 retine topo seguendo i protocolli sperimentali sopra descritte ed illustrate in figura 1 utilizzando diverse soluzioni standard di perfusione (Figura 2). Le forme d'onda di risposta e la cinetica e sensibilità bastoncelli apparsi simili in Ames 'e mezzi di Locke (Figura 2A e B). D'altra parte, in soluzione di Ringer HEPES-buffered (senza bicarbonato o 5% CO 2/95%

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Discussione

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Dimostriamo qui i passaggi critici per l'ottenimento di alta qualità ex registrazioni vivo ERG contemporaneamente da due retine isolate del mouse utilizzando componenti in vivo del sistema ERG insieme ad un ex vivo adattatore ERG. In questo studio abbiamo perfusione entrambe le retine da animali con la stessa soluzione (sia Ames ', Locke o Ringer), ma è anche possibile perfusione ogni retina con una soluzione diversa per esempio, a scopo di test di droga. I pass...

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Dichiarazioni

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Washington University di St. Louis ha un accordo di licenza con Xenotec, Inc. e può ricevere una royalty dalla vendita dell'adattatore ex vivo.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH sovvenzioni EY019312 e EY021126 (vjk), EY002687 al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive presso la Washington University, e da Research per prevenire la cecità.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
In vivo Sistema ERGOcuScienceHMsERGwww.ocuscience.us/id77.html
In vivo Sistema ERGLKC TechnologiesUTAS-E 3000www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex adattatore vivoOcuScienceEx VIVO ERG adapterwww.ocuscience.us/id107.html
Microscopio per dissezioneNorth Central InstrumentsLeica M80Può utilizzare qualsiasi marca
emettitore IROpto Diode Corp.OD-50Lwww.optodiode.com
Prowler Visori notturniB.E. Meyers Electro OpticsD4300-IProdotto di livello militare.
Filtro rossoRosco LaboratoriesRoscolux #27 Medio RossoPuò essere utilizzato al posto del sistema IR
Luce frontale rossaOcuScienceERGX011www.ocuscience.us/catalog/i29.html
MicroscissorsWPI, Inc.500086www.wpiinc.com/
Dumont pinzette #5WPI, Inc.14101
Lame di rasoioMicroscopia elettronica Scienze72000www.emsdiasum.com
ScalaMetler ToledoAB54-S/FACTa href="http://www.sigmaaldrich.com/">Può utilizzare qualsiasi marcaMisuratore di
pH ed elettrodoBeckman CoulterpHI 350Può utilizzare qualsiasi marca
NaClSigma-AldrichS7653Può utilizzare qualsiasi marca
KClSigma-Aldrich60129Può utilizzare qualsiasi marca
MgCl2Sigma-Aldrich630201.0 M soluzione
CaCl2Sigma-Aldrich211141.0 M soluzione
EDTASigma-Aldrich431788Può utilizzare qualsiasi marca
HEPESSigma-AldrichH3375Può utilizzare qualsiasi marca
Bicarbonato di sodioSigma-AldrichS6297Può utilizzare qualsiasi marca
Ames mediumSigma-AldrichA1420Può utilizzare qualsiasi marca
BaCl2Sigma-AldrichB0750Può utilizzare qualsiasi marca
DL-AP4Tocris Bioscience101Può utilizzare qualsiasi marca
Acido succinico sale disodicoSigma-Aldrich224731Può utilizzare qualsiasi marca
Acido L-glutammicoSigma-AldrichG2834Può utilizzare qualsiasi marca
D-(+)-GlucosioSigma-AldrichG7528Può utilizzare qualsiasi marca
Terreno di coltura Leibovitz L-15Sigma-AldrichL4386Può utilizzare qualsiasi marca
di vitamine MEMSigma-AldrichM6895
aminoacidi MEMSigma-AldrichM5550
CarbogenAirgasUN31565% CO2
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Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armington, J. C. The Electroretinogram. , Elsevier Science & Technology Books. (1974).
  2. Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43(1908).
  3. Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J. Physiol. 77, 207-239 (1933).
  4. Penn, R. D., Hagins, W. A. Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave. Nature. 223, 201-204 (1969).
  5. Stockton, R. A., Slaughter, M. M. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).
  6. Robson, J. G., Frishman, L. J. Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram. Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).
  7. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).
  8. Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave. Nature. 227, 728-730 (1970).
  9. Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature. Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).
  10. Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
  11. Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).
  12. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).
  13. Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. J. Physiol. 167, 156-168 (1963).
  14. Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).
  15. Bastian, B. L., Fain, G. L. Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium. J. Physiol. 297, 493-520 (1979).
  16. Arden, G. B. Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina. J. Physiol. 256, 333-360 (1976).
  17. Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Res. 101, 108-117 (2014).
  18. Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
  19. Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
  20. Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
  21. Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
  22. Newman, E. A. Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells. Brain Res. 498, 308-314 (1989).
  23. Oakley, B. 2nd, Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina. Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).
  24. Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).
  25. Walter, P., Luke, C., Sickel, W. Antibiotics and light responses in superfused bovine retina. Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).
  26. Luke, M., et al. The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).
  27. Januschowski, K., et al. Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model. Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).
  28. Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses. J Vis Exp. , (2012).
  29. Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina. Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).
  30. Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments. J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).
  31. Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG. Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).
  32. Azevedo, A. W., Rieke, F. Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold. J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).
  33. Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).
  34. Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors. Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).
  35. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).
  36. Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics. J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).
  37. Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling. J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).
  38. Gouras, P., MacKay, C. J. Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).
  39. Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation. Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).

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