Iridium (III) luminescente sonda per il rilevamento della proteina malarica Biomarker istidina Rich Protein-II

Summary

I reagenti di rilevamento robusti sono sempre più necessari per lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici per la malaria. È stata progettata una sonda all'iridio (III) che emette un segnale luminescente di lunga durata in presenza di un biomarcatore proteico malarico ricco di istidina. La rilevazione della proteina, sia in soluzione che immobilizzata su una particella magnetica, offre flessibilità nell'applicazione.

Abstract

Questo lavoro descrive la sintesi di un non-emissivi, ciclometallati Ir (III), Ir (ppy) ₂ (H ₂ O) ₂ ⁺ (IR1), che provoca una rapida, segnale fosforescenti longeva quando coordinate per un histidine- contenente proteina immobilizzata sulla superficie di una particella magnetica. Sintesi di Ir1, in alte rese, è completo O / N e prevede la separazione del genitore ciclometallati Ir (III) dimero cloro-ponte in due equivalenti del complesso solvatato. Per confermare la specificità, diversi aminoacidi sono stati sondati per l'attività di coordinamento quando aggiunto alla sonda sintetizzato, e solo istidina suscitato un segnale di risposta. Utilizzando BNT-II, un peptide mimica ramificato del biomarker malarica Istidina Rich Protein II (pfHRP-II), la sonda di iridio è stata convalidata come strumento per il rilevamento HRP-II. Effetti tempra sono stati notati nella titolazione BNT-II / Ir1 rispetto alla L-istidina / Ir1, ma questi sono stati attribuiti al sterico e triPlet tempra Stato. Biolayer interferometria stata utilizzata per determinare la cinetica in tempo reale di interazione di Ir1 con BNT-II. Una volta che il sistema è stato ottimizzato, il limite di rilevazione di rcHRP-II utilizzando la sonda è risultato essere 12,8 nM in soluzione. Quando questa proteina era immobilizzato sulla superficie di una particella magnetica agarosio 50 micron, il limite di rilevazione era 14,5 nM. La risposta forte segnale di questa sonda inorganico, nonché la flessibilità di impiego in soluzione o immobilizzato su una superficie, possono prestarsi verso una varietà di applicazioni, da uso diagnostico all'imaging.

Introduction

Etichettatura colorimetrica e fluorescenti è un metodo importante per l'individuazione e la localizzazione di molecole biochimiche e dei processi ^1,2. I marcatori fluorescenti più comuni sono a basso peso molecolare, coloranti organici ^3,4, ma queste molecole non hanno sempre proprietà ottiche ideali. Coloranti fluorescenti sono inclini a photobleaching, spesso hanno piccoli spostamenti Stokes, e può avere sovrapposizioni di eccitazione e spettri di emissione. Etichettatura colorimetrico è spesso raggiunto con l'uso di etichette enzimatiche, che hanno un segnale amplificato utile immunodosaggio quantificazione ^5,6. Questi enzimi hanno anche i loro svantaggi, tra cui fotosensibilità, condizioni di reazione, e la shelf life breve substrato. Queste proprietà tendono a richiedere saggi immunologici e metodi di etichettatura di proteine ​​deve essere fatto in condizioni ben controllate utilizzano reagenti costosi.

Complessi di metalli di transizione emissivi sono stati esplorati come un approccio di etichettatura alternativa for rilevamento biochimica. In particolare, ciclometallati Ir (III) è stata studiata nel contesto di diodi luminosi organici (OLED) di rilevamento ^7-9 ossigeno ^10, Catalisi ^11, e proteine ​​/ cella colorazione ^12-14. Alta fotostabilità ed efficienza quantica rendono questa classe di sonde un buon candidato per il rilevamento di biomolecole ^15,16. In precedenza era emerso che ciclometallati Ir (III), nella forma [Ir (C ^ N) ₂ (solv) _2] ^+, irreversibilmente legano istidina e suscitare una risposta del segnale blu-verde ^12,17. Questi complessi sono non emissive nello stato solvento, ma quando istidina sposta le molecole di solvente e si lega al centro metallico, rilasciano un segnale fosforescente intenso dopo irradiazione onde lunghe UV. Questo segnale si verifica solo dopo sostituzione del legante, ed è il risultato di un elettrone tripletto relax allo stato fondamentale attraverso l'attivazione di trasferimento di carica metallo legante ⁽³ MLCT) e trasferimento al centro ligando ⁽³ LC) percorsi ^8,15. Questi complessi possono potenzialmente essere usati come sonde di rilevamento per le proteine ​​ricche di istidina.

Proteine ​​ricche di istidina e dei loro livelli di regolazione sono importanti in molte malattie, tra cui la cirrosi epatica, cancro e disordini thrombic. ¹⁸ Plasmodium falciparum istidina Rich Protein II (pfHRP-II), in particolare, è un biomarcatore ben validato per l'infezione parassita della malaria. Questa proteina è 67 kDa e contiene il 34% istidina, per lo più all'interno di caratteristici AHHAHHAAD ripetendo motivi ^19. Queste ripetizioni istidina possono legare ioni metallici liberi ¹⁹ e ²⁰ eme complessi nel sangue dell'ospite. pfHRP-II è comunemente rilevato in ambienti con scarsa risorsa utilizzando immunocromatografici test di diagnosi rapida (RDTs), ma questi test sono spesso imprecisi a causa delle condizioni del campione, bassa concentrazione di biomarker, standard di produzione poveri e la degradazione degli anticorpi ^21.

sonde fosforescenti a base di metallo, come il ciclometallati Ir (III) di cui sopra sono opzioni interessanti per la rilevazione di pfHRP-II a causa della loro legame selettivo di istidina e le loro proprietà stabili e di emissione efficiente. In questo lavoro, l'uso di [Ir (ppy) ₂ (H ₂ O) _2] ⁺ (IR1) per rilevare BNT-II, un peptide mimica ramificata di pfHRP-II viene esplorata ^22. Cinetica di questa interazione sono stati monitorati in tempo reale utilizzando le tecniche di interferometria biolayer. Il dosaggio è stato anche adattato per un on-tallone formato ELISA-tipo, dove sono stati raggiunti i limiti nanomolari di rilevamento. Questo test detiene vantaggi rispetto ELISA tradizionali perché può essere eseguito in meno di 2 ore con i reagenti senza anticorpi, invece del 4-5 hr e reagenti biologici richiesti con ELISA tipici.

Protocol

1. Sintesi di Iridium (III) Complesso

1. Pesare 53,6 mg (50 mmol) di [Ir (ppy) ₂ -Cl] ₂ e sciogliere in 5 ml di cloruro di metilene. Aggiungi questa soluzione in un beuta da ml 50 dotato di ancoretta.
2. Pesare 26,2 mg (100 mmol) di AgOTf e sciogliere in 5 ml di metanolo.
3. Aggiungere il AgOTf dissolto al [Ir (ppy) ₂ -Cl] ₂ soluzione e mescolare per 1 ora.
   Nota: un impasto color crema dovrebbe comportare.
4. Dopo 1 ora, filtrare la sospensione attraverso gel di silice in un bicchierino fiala di 25 x 95 mm ed evaporare solvente residuo mediante un evaporatore rotativo (5-10 minuti).
5. Una volta che la maggior parte del solvente viene rimosso, verificare che un residuo oleoso giallo rimane nel flaconcino. Per questo residuo, aggiungere 1 ml di metanolo di ri-sciogliere il prodotto e lyophilize 1-2 giorni per rendere il prodotto solido giallo.
6. Caratterizzare la Ir (ppy) ₂ (H ₂ O) ₂ ⁺ prodotto (IR1) da H ^{1 NMR (in CDCl _3), ESI e UV-Vis come descritto in precedenza. 23}

2. Interazioni di Ir1 con vari amminoacidi

1. Preparare una soluzione 2 mM di Ir1 in metanolo (MW 537,10 g / mol). Vortex per garantire la completa dissoluzione del solido.
2. Preparare 100 micron soluzioni delle seguenti aminoacidi e biomolecole in HEPES Buffered Saline (HEPES HBS, 100 mm, 137 mM NaCl, pH 7,4) Ala, Asp, Cys, His, Ile, Lys, Ser, Try, Val.
3. Pipettare 100 ml di ogni amminoacido in una piastra da 96 pozzetti neri. Aggiungere 100 ml di HBS alla piastra per servire come bianco.
4. Aggiungere 2,5 ml di soluzione 2 Ir1 mM ad ogni campione e agitare la piastra su un agitatore per 10 minuti.
5. Dopo 10 min, acquisire gli spettri di emissione dei campioni utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti (365 ex / em 400-700).
   1. Porre la piastra in strumento e aprire il software lettore di piastre per configurare un nuovo esperimento.
   2. Impostare la nuova experiment leggere una scansione di fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 365 nm e una larghezza della fessura di 9 nm con l'ottica nella posizione superiore.
   3. Leggi l'emissione 300-700 nm con un passo di 5 nm.
   4. Esportare i dati per l'analisi dei dati.
6. Trasferire i campioni ad un chiaro piastra a 96 pozzetti e immagine l'emissione con un Transilluminatore UV.

3. Titolazione di Ir1 con BNT-II

1. Preparare una soluzione madre 1 mM di BNT-II (MW 8233,6 g / mol) in HBS e una soluzione 2 mM di Ir1 in metanolo.
2. Dalla soluzione di riserva, preparare 1 ml di 100 mM BNT-II in HBS. Vortex la provetta per assicurarsi il campione viene miscelato.
3. Serialmente diluire il 100 mM BNT-II della metà in HBS ad una concentrazione finale di 1,56 mM BNT-II.
4. Aggiungere 100 ml di ogni diluizione, in triplice copia, con HBS che serve come un vuoto, ai pozzetti di una piastra ben 96. Per ogni campione, aggiungere 2,5 ml di 2 Ir1 mm.
5. Shake la piastra per 10 minuti su un agitatore.
6. Dopo aver agitato, leggere l'intensità di emissione a 510 nm (eccitazione a 365 nm) utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti.
   1. Porre la piastra in strumento e aprire il software lettore di piastre per configurare un nuovo esperimento.
   2. Impostare il nuovo esperimento di leggere un endpoint di fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 365 nm ed emissione lunghezza d'onda di 510 nm. Impostare la larghezza della fessura per entrambe le lunghezze d'onda a 9nm, con l'ottica nella posizione superiore.
   3. Leggere la piastra ed esportare i dati per l'analisi.
7. Trasferire i campioni ad un chiaro piastra a 96 pozzetti e immagine la titolazione usando un transilluminatore UV.

4. in tempo reale Kinetic analisi del sistema Ir1 / BNT-II Utilizzando Biolayer Interferometry

1. Aggiungere 200 ml di tampone cinetico (KB; 1x tampone fosfato con 0,02% Tween-20) a 8 pozzetti nella prima colonna di una piastra a 96 pozzetti nera e inserire la piastra nel sensore di plasticatitolare. Trasferire accuratamente 8 Ni (II) biosensori NTA alla prima colonna nel supporto di plastica in modo che le punte sono sospesi nei pozzetti di tampone. Posizionare il supporto di plastica nella parte sinistra dello strumento interferometria.
2. Preparare un 2 ml di una soluzione allo 0,5 micron di BNT-II in KB.
3. Preparare 500 ml di una soluzione al 10 micron di Ir1 in KB, e in serie diluire metà in giù a 0,156 micron di KB.
4. Per una nuova nera 96 ​​pozzetti, pipetta 200 ml di KB a tutti 8 pozzetti nella colonna A e C.
5. Nello stesso piatto, pipettare 200 ml di soluzione di 0.5μM BNT-II ai pozzetti nella colonna B.
6. Pipettare 200 ml di ogni diluizione di Ir1 in colonna D, a partire KB come il vuoto in D1 bene. Aggiungere le diluizioni in modo che i pozzi aumentano in concentrazione Ir1 lungo la colonna.
7. Inserire questa piastra nello strumento a destra della piastra contenente i sensori pre-bagnatura.
8. Nel software biolayer interferometria, ha istituito un Kinet baseesperimento ic definendo le punte piatto, di analisi, e dei sensori.
   1. Per definire la piastra, selezionare una colonna sullo schermo, fare clic destro e scegliere la definizione appropriata per i pozzi. Selezionare "Buffer" per le colonne A e C, "Load" per la colonna B, e "Campione" per la colonna D.
   2. Definire il test nella scheda successiva, aggiungendo le seguenti operazioni (Fare clic su "Aggiungi"): equilibrazione (su ordinazione), 60 sec; Caricamento in corso, 120 sec; Baseline, 60 sec; Associazione, 120 sec; e dissociazione, 300 sec. Selezionare il passo Equilibration e fare doppio clic su colonna A. Ripetere l'operazione per Loading (colonna B), Baseline (colonna C), Association (colonna D), e la dissociazione (colonna C). Selezionare i sensori Ni (II) NTA.
   3. Spostare alla scheda successiva e confermare che i sensori sono nella colonna A sul supporto del sensore in plastica.
   4. Confermare l'esperimento è descritto correttamente, inserire un nome di file, in modo che "esperimento ritardo" è selezionata, e premere "Go".
      Nota: A causa della natura automatizzata dello strumento, una volta che l'esperimento cinetica è delineato, si verificherà la procedura come programmato.
9. Una volta che la corsa cinetica è completa, elaborare i dati nel software di elaborazione disponibile.
   1. Fare doppio clic sulla cartella con il nome del file di interesse nella parte inferiore del pannello di sinistra. Quindi, fare doppio clic sulla cartella corrispondente alla voce "Cinetica" nella parte superiore del pannello. Passare alla scheda Elaborazione.
   2. Selezionare la casella Sottrazione a sinistra per aprire la schermata di selezione del sensore. Fare clic destro sul bene A4 e modificare il tipo di bene di riferimento Well.
   3. Seleziona la casella accanto a Allinea asse Y, e assicurarsi che il passo selezionato è Baseline. Specificare l'intervallo di tempo per essere gli ultimi cinque secondi della linea di base (circa 55-60 secondi).
   4. Selezionare la casella relativa correzione Inter-passo e selezionare Allinea a dissociazione. Assicurarsi che la casella Savitzky-Golay filtro viene controllato e premere il tasto di processo "Dati! ̶1;
   5. Passare alla scheda Analisi. Assicurarsi che "Associazione e dissociazione" è la selezione per i passaggi per analizzare e che il modello è di 1: 1. Selezionare un locale, in forma completa e premere "Curve Fit!"
   6. Evidenziare tutte le curve nella tabella e fare clic destro per impostare tutte le curve a un colore. Avanti, selezionare un fit (Full) globale, raggruppati per colore e Rmax scollegato dal sensore. Premere "Curve Fit!" Per ottenere i dati cinetici globali.

5.-tallone Rilevazione di BNT-II e rcHRP-II con Ir1

1. Preparare 1 ml ciascuna di una soluzione 1 mM di BNT-II e rcHRP-II in HBS con Tween (HBST; HBS con 0,025% Tween 20).
2. Serialmente diluire ogni proteina della metà in HBST ad una concentrazione finale di 15,6 nM.
3. Dispensare 100 ml di ogni diluizione, in triplice copia, in una piastra a 96 pozzetti bianco, con le diluizioni in ordine dal più basso al più alto concentrazione di una colonna.
4. Pipettare 10 ml di 50 micron Ni (II) NTA particelle magnetiche agarosio in ogni diluizione bene.
   1. Vortex la provetta contenente le particelle magnetiche dopo ogni pipettaggio per garantire le particelle rimangono sospese.
5. Porre la piastra su un agitatore per 15 minuti per incubare i campioni con le particelle.
6. Dopo questo periodo di incubazione, posizionare la piastra su un magnete piastra a 96 pozzetti e attendere 30 sec per le particelle di tirare dalla soluzione.
7. Utilizzando una pipetta multicanale, tirare fuori il campione originale e scartare come rifiuti. Rimuovere la piastra dal magnete.
8. Aggiungere 200 ml di HBST in ogni pozzetto usando la pipetta multicanale. Pompa il buffer su e giù diverse volte per lavare le particelle magnetiche.
9. Posizionare la piastra posteriore sul magnete e attendere 30 secondi per le particelle di tirare dalla soluzione.
10. Utilizzando la pipetta multicanale, tirare fuori i 200 ml di tampone e scartare come rifiuti. Rimuovere la piastra dal magnete.
11. Ripetere i punti 5.8 through 5.10 due volte per completare tre lavaggi delle particelle.
12. Aggiungere 100 ml di HBST ad ogni pozzetto contenenti particelle magnetiche seguiti da 2,5 ml di 2 Ir1 mm.
13. Incubare le particelle con Ir1 su un agitatore per 1 ora.
14. Dopo 1 ora, leggere l'intensità di emissione a 510 nm (eccitazione a 365 nm) utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti.
    1. Porre la piastra in strumento e aprire il software lettore di piastre per configurare un nuovo esperimento.
    2. Impostare il nuovo esperimento di leggere un endpoint di fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 365 nm ed emissione lunghezza d'onda di 510 nm. Impostare la larghezza della fenditura per entrambe le lunghezze d'onda di 9 nm, con l'ottica nella posizione superiore.
    3. Leggere la piastra ed esportare i dati per l'analisi.
15. Trasferire i campioni ad un chiaro piastra a 96 pozzetti e immagine la titolazione mediante una Transilluminatore UV.

Results

Come mostrato in figura 1, la sintesi del Ir1 solvento complesso splitting coinvolto del ponte cloruro nelle dimero genitore per precipitazione del cloruro sotto forma di AgCl insolubile e associazione di molecole d'acqua al centro metallico. La formazione di Ir1 stata confermata da H ¹ NMR e ESI. Inoltre, le bande UV-visibile caratteristici di legante metallo trasferimento di carica e π-π transizioni * sono stati assegnati allo spettro, convalidando ulteriormente la formazione di Ir1. Questo solvatato presenta complessi nessun personaggio emissivo quando eccitato a 365 nm.

Figura 1:. Sintesi e caratterizzazione di Ir1 reazione ponte Cloruro scissione Dichlorotetrakis (2- (2-piridinil) fenil) diiridium (III) per creare il complesso aquo Ir (ppy) ₂ (H ₂ O) ₂ + (IR1). Dopo aggiunta di L-His al complesso aquo in tampone acquoso, il segnale luminescente è acceso.

Una volta che il complesso è stato sintetizzato e caratterizzato, la selettività amminoacido è stato analizzato come descritto in precedenza utilizzando un iridio simile analogico ^17. Figura 2A mostra che solo istidina suscitato una risposta segnale a 510 nm, quando eccitato a 365 nm.

Figura 2: aminoacidi Selettività e titolazione di Ir1 con istidina Rich peptidi (A) Interazione di 200 micron di vari amminoacidi (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, la sua) con 50 micron. IR1 in HBS. Scansioni spettrali sono state prese 400-700 nm a una lunghezza d'onda di eccitazione di 365 nm in un nero 96 pozzetti. Segnale in unità di fluorescenza relativa (RFU) da tutti gli aminoacidi baggiunto che oltre istidina (tratteggiata traccia nera) è stato trascurabile. Le concentrazioni (B) nanomolari di BNT-II (▪) e rcHRP-II (♦) è stata titolata con Ir1 in HBS. Le ricche peptidi istidina sono state incubate con la sonda per 15 min in soluzione prima di leggere l'emissione a 510 nm dopo l'eccitazione con luce 365 nm. Limite di rilevazione è stato calcolato come il valore di x quando y = 3σ _vuoto.

Questo "interruttore on-" della fosforescenza della sonda di iridio si verifica perché lo stato eccitato di singoletto ⁽¹ MLCT / ¹ LC) del Ir (III) Bioconjugate subisce incrocio intersistema per la tripletta stato eccitato ⁽³ MLCT), quando istidina è coordinato al centro metallico. Questa sonda è stato applicato a BNT-II un peptide mimica del biomarcatore malaria Plasmodium falciparum istidina Rich Protein II (pf HRP-II). In una titolazione di BNT-II con Ir1, una risposta di segnale dipendente dalla concentrazione è stato osservato ( D di Ir1 legame BNT-II immobilizzato su una superficie di Ni (II) NTA è risultato essere 2,05 mM (Figura 3).

Figura 3: tempo reale Kinetic Analisi Ir1 con BNT-II Biolayer interferometria per analisi cinetica di varie concentrazioni di Ir1 vincolanti per BNT-II sulla superficie di un sensore di vetro (II) NTA Ni.. Dopo equilibrare i sensori in KB (regione A), i sensori sono caricati con 0,5 mM BNT-II (Region B). Una volta che il peptide è caricato sui sensori, una linea di base è stabilito (Region C) prima di misurare l'associazione Ir1 al BNT-II (Regione D). Dopoun periodo di associazione, i sensori sono posti di nuovo in KB per misurare la dissociazione (Regione E). L'intero processo di analisi cinetica richiede meno di 30 min.

Durante la transizione da un saggio basato soluzione su una piattaforma particella magnetica, la complessità della particella nel sistema doveva essere preso in considerazione. Si sapeva da precedenti lavori, che queste particelle si legano in modo efficiente il pf malaria biomarcatore HRP-II. ²⁴ tavole Fluorescent Black funzionato bene per il saggio soluzione descritto sopra, ma piatti bianchi erano più adatto per la piattaforma on-particelle di rilevamento, come si è visto in Figura 4A. In una piastra bianca, la luce viene riflessa nel campione, consentendo così di migliorare assorbanza per il Ir1 legata alla superficie della particella. Nel test on-particella, il limite di rilevazione di rcHRP-II è stato determinato in 14,5 nM (Figura 4B). Il limite di rilevazione per rcHRP-II in soluzione e-tallone erano statiscamente la stessa sulla base di un t-test non appaiati (p = 0,731).

Figura 4:. On-bead Rilevamento BNT-II e HRP-II (A) tra il segnale rilevato dal Ir1 vincolato al BNT-II sulla superficie di 50 micron Ni particelle di agarosio (II) NTA magnetici in un nero 96- pozzetti (linea continua) rispetto ad una piastra a 96 pozzetti bianco (linea tratteggiata). Le particelle erano eccitati con 365 nm di luce, e l'emissione è stata misurata a 510 nm. (B) Titolazione di rcHRP-II immobilizzato sulle particelle magnetiche e rilevato utilizzando Ir1. Limite di rilevazione è stato calcolato come value di x quando y = 3σ _vuoto.

Figura 5: Rappresentazione schematica del rilevamento in tallone di rcHRP-II con Ir1 schema generale di HRP-II legame alla superficie di Ni (II) NTA particelle e marcato con Ir1.. Le particelle vengono incubati con una ricca peptide istidina per 15 min. Dopo questo periodo di incubazione, le particelle vengono lavate con HBST utilizzando un magnete, per tirare le particelle dalla soluzione. Infine, le particelle di peptide legato vengono incubate con Ir1 per 1 ora prima di leggere l'emissione a 510 nm dopo l'eccitazione con luce 365 nm.

Discussion

Come strumenti diagnostici basati su microparticelle vengono alla ribalta della tecnologia diagnostica moderna, l'individuazione di biomolecole bersaglio direttamente sulla superficie della particella è un grande vantaggio. Metodi di rilevamento molecolari tradizionali, come ELISA e PCR, sono vantaggiosi, in quanto possono raggiungere molto bassi limiti di rilevazione ^25. Tuttavia, questi test richiedono ampi reagenti e protocolli lunghi. Questo test è stato progettato per simulare le interazioni di tipo ELISA a sandwich senza il tempo ei requisiti reagenti (Figura 5). Inoltre, il costo della sonda Ir1 per campione è stato stimato a circa un centesimo, mentre il costo di anticorpi per un tipico ELISA è $ 0,20-0,30 per campione.

Poiché i metodi sopra descritti si basano su una sonda iridio ciclometallati per il rilevamento del biomarker malarica, questa sonda non sarebbe suscettibile di modi di guasto comune ad altri metodi di rilevamento (es. Fluoroforo quenching e la degradazione degli anticorpi / enzima). Istidina è unico nelle sue caratteristiche di legame metallo. Il lavoro descritto sfrutta questo fenomeno sostituendo gli anticorpi in un tipico panino ELISA con contenenti metalli complessi. Ni (II) NTA cattura rcHRP-II sulla superficie della particella e Ir1 segnala la presenza della proteina. La fase più critica nel saggio sta permettendo le particelle magnetiche per mescolare con il campione e la sonda. In una piastra a 96 pozzetti ELISA, biomolecole e reagenti raggiungono l'equilibrio con la superficie bidimensionale del fondo del pozzo. Particelle magnetiche hanno la tendenza a stabilirsi dalla soluzione per il loro nucleo di ferro-ossido denso, che ridurrebbe i siti di legame disponibili. Così, le particelle devono essere miscelati durante il tempo di saggio per garantire la massima vincolante.

Nel progettare un reagente per la diagnosi di malattia, bisogna tenere presente forma di campione del paziente come pure la concentrazione fisiologica del biomarker. Permalaria, la concentrazione di pf HRP-II nel sangue di un paziente può variare da basso a alto picomolare nanomolare. Mentre questo saggio è clinicamente rilevante per i livelli più alti di infezione, il limite di rilevamento deve essere migliorata al fine di individuare i pazienti asintomatici con basso picomolare circolante pf HRP-II. Nei metodi descritti sopra, la "switch-on" segnale generato da Ir1 si verifica in presenza di istidina. Mentre il biomarker malarica è ricca di istidina, altre proteine ​​del siero, come albumina di siero umano e istidina ricca glicoproteina, risulterebbe in una risposta di segnale con la sonda. Ciò a sua volta portare a diagnosi di falsi positivi. Questo rende la cattura della proteina sulla superficie della particella un passo vantaggioso, in quanto la proteina di interesse può essere rapidamente estratto da un campione clinico. Inoltre, la progettazione di una sonda bifunzionale, che le coppie un ricco peptide istidina ad un elemento di riconoscimento molecolare robusta (es. Aptamer), Potrebbe aggiungere un altro strato di specificità del test. Il peptide dovrebbe essere caricato con iridio prima dell'accoppiamento al aptamer. In tale disegno, la sonda stabile Ir1 può ancora essere utilizzata mentre il raggiungimento dell'obiettivo specificità con aptamer. Ciò consentirebbe l'applicazione della sonda per rilevare nativa HRP-II in una matrice complessa (es. Plasma o sangue intero) e ridurre gli effetti vincolanti non specifici. Al fine di migliorare ulteriormente il segnale di test diagnostici rapidi, il dosaggio potrebbe essere incorporato in un sistema electrochemiluminescent (ECL), dove pf HRP-II può essere rilevata sulla RDTs come un visualizzatore ²⁶ elettrochimica. Questa sonda generazione iridio successivo sarebbe migliorare notevolmente la nostra on-bead ELISA per la rilevazione di biomarcatori di malattia.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dicholortetrakis(2-(2-piridinil)fenil)diiridio(III)	Sigma-Aldrich	658383
trifluorometanosolfonato d'argento	Sigma-Aldrich	176435
Gel di silice	Sigma-Aldrich	6858
L-Aminoacidi	Fisher Scientific	varia
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
BNT-II peptide	sintetizzato in house	N/A
ricombinante HRPII	Immunology Consultants Laboratory inc.	AGPF-55
Costar Piastra a 96 pozzetti in polipropilene nero	Fisher Scientific	07-200-567
Costar Piastra a 96 pozzetti in polipropilene bianco	Fisher Scientific	07-200-589
Grenier Piastra a 96 pozzetti in polipropilene nero	VWR	89089-582
Ni(II)NTA particelle di agarosio magnetico	Qiagen	36111
Ni(II)NTA sensori per interferometria a biostrati	ForteBio	18-5101
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet	ForteBio
Biotek Synergy H4 Lettore di micropiastre	Biotek
Fisher Transilluminatore Biotech	Fisher Scientific	FBDLT-88