La diffusione metastatica del cancro è la principale causa di decessi correlati al cancro. Forniamo una descrizione approfondita della nostra metodologia chirurgia sopravvivenza per stabilire un modello di sistema ortotopico singenici mouse "paziente-tipo" per lo studio dei meccanismi di metastatizzazione dei tumori di organi solidi.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
A "paziente-Like" ortotopico Singenico modello murino della carcinoma epatocellulare Metastasi
In questo articolo
Sommario
Abstract
La maggior parte dei decessi correlati al cancro sono causati dalle metastasi del cancro piuttosto che dal tumore primario stesso. Tuttavia, i meccanismi alla base delle metastasi tumorali non sono ancora chiari. I modelli animali sono essenziali per chiarire i meccanismi e per valutare nuove strategie per il trattamento dei tumori metastatici. Qui viene fornita una descrizione approfondita di un modello murino singenico ortotopico "paziente-simile" per esplorare i meccanismi di metastasi dei tumori degli organi solidi. Viene descritto l'impianto chirurgico di sopravvivenza di cellule di carcinoma epatocellulare di topo BNL 1ME A.7R.1 direttamente nel fegato (l'organo di origine) del ceppo di topo di laboratorio immunocompetente di tipo selvatico consanguineo, BALB/c. Il successo e la riproducibilità di questa metodologia ne raccomandano un uso diffuso per chiarire i meccanismi biologici delle metastasi del cancro degli organi solidi.
Introduzione
Il carcinoma epatocellulare (HCC) è uno dei tumori più letali, con prognosi infausta e bassa aspettativa di vita. Quasi tutti i decessi correlati al cancro sono dovuti alla diffusione metastatica della malattia dall'organo di origine ad altri organi distanti2-6. La progressione dell'HCC è un processo complesso. Pertanto, essere in grado di modellare il microambiente tumorale che si trova naturalmente nell'HCC metastatico in modelli animali può rivelarsi un modo efficace e utile per rivelare meccanismi rilevanti nell'uomo. 7Sfortunatamente, i meccanismi delle metastasi del cancro sono ancora in gran parte poco chiari. Pertanto, è necessario stabilire modelli animali che ci consentano di chiarire i meccanismi molecolari alla base delle metastasi di tumori come l'HCC3,5.
I sistemi modello murini sono un approccio molto utile per delineare meccanismi e valutare nuove strategie per il trattamento dei tumori umani metastatici5,8. I vari sistemi modello murini attualmente esistenti sono una testimonianza degli sforzi dei ricercatori per rappresentare correttamente la complessità della malattia5,8,9.
Ogunwobi e colleghi hanno recentemente utilizzato un approccio chirurgico di sopravvivenza per dimostrare la creazione di un nuovo modello murino singenico ortotopico per lo studio delle metastasi nell'HCC3. Il loro lavoro ha stabilito un modello murino "paziente-simile" che ricapitola le caratteristiche degli HCC aggressivi e metastatici3. Hanno inoltre dimostrato che questo sistema modello murino può essere utilizzato per studiare la biologia delle cellule tumorali circolanti e che questo ha il potenziale per ottenere nuove informazioni sui meccanismi delle metastasi del cancro3.
Lo scopo di questo articolo è descrivere in dettaglio la metodologia utilizzata per stabilire questo modello murino singenico ortotopico "paziente-simile" delle metastasi HCC3. Verrà descritta la metodologia per impiantare cellule HCC di topo BNL 1ME A.7R.1 direttamente nel fegato (l'organo di origine) del ceppo di topo di laboratorio immunocompetente di tipo selvatico consanguineo, BALB/c3 utilizzando la chirurgia di sopravvivenza. A differenza di altri modelli tumorali di xenotrapianto di topo in cui le cellule tumorali umane vengono impiantate in topi immunodeficienti, questo sistema è singenico ed è, quindi, adatto per studiare il ruolo del sistema immunitario nelle metastasi tumorali3,5,8. Questo approccio probabilmente otterrà un uso diffuso per lo studio dei meccanismi delle metastasi nei tumori degli organi solidi.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Etica Dichiarazione
Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato istituzionale animali (IACUC) di Hunter College della City University di New York.
Nota: Otto topi BALB / c sono stati usati in questa procedura sperimentale. Cinque topi BALB / c sono stati impiantati con 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 topo cellule di carcinoma epatocellulare per produrre i tumori primari. Tre topi BALB / c senza implantologia sono stati utilizzati come controlli. BNL 1ME A.7R.1 è una linea di cellule murine carcinoma epatocellulare che è stato derivato per trasformazione chimica dal murino non tumorigeniche linea cellulare di epatociti BNL CL.2. BNL 1ME A.7R.1 è stato ottenuto dalla American Type Culture Collection (ATCC).
1. Pre-chirurgia
- Assicurarsi che i topi per tutti gli interventi chirurgici di sopravvivenza sono in buona salute. Per assicurare che i topi sono sani, ispezionare segni di disidratazione tenting della pelle. Non usare i topi con qualsiasi evidenza di malattia o distress in questi esperimenti.
- Pesare topi per garantire che non siano sottopeso. Assicurarsi che il peso è di almeno 16-20 grammi.
- Preparare 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 cellule del mouse HCC per l'impianto per il mouse:
- Aspirare i media da 10 ml 60% - piatto di coltura di cellule confluenti il 70% delle cellule di carcinoma epatico di topo A.7R.1 BNL 1ME. Lavare due volte con 5 ml di PBS. Aggiungere 2 ml di tripsina al piatto e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato con aria e 5% di CO 2 per 5 min.
- Successivamente, pipette 10 ml tripsinizzate cellule in un emocitometro manuale per il conteggio delle cellule al microscopio a ingrandimento di 10X. Contare il numero totale di cellule trovate nei quattro angoli piazzali e moltiplicare il fattore di diluizione per il numero totale di cellule. Poi, dividere per il numero di quadrati contati e moltiplicare per 10 6 per la concentrazione cellulare (cellule per ml).
- Utilizzando il calcolo, raccogliere 5 milioni di cellule per topo in sterili1,5 ml microprovette. Etichettare provette da 1,5 ml microcentrifuga.
- Risospendere le 5 × 10 6 celle BNL 1ME A.7R.1 topo HCC in 100 ml di tampone fosfato salino (PBS). Tenere queste cellule in ghiaccio fino impianto in chirurgia.
- Svolgere attività necessarie per la preparazione di topi per la chirurgia come l'induzione dell'anestesia e capelli clipping lontano da attrezzature e materiali sterili per evitare la contaminazione.
- Un'anestesia generale nei topi per inalazione di isoflurano utilizzando un vaporizzatore isoflurano con ossigeno ad un flusso costante concentrazione di 1 L per min (circa. 2,1%). Nota: Il sistema è autosufficiente, e comprende un vaporizzatore di precisione, un apporto di ossigeno e un contenitore di carbone che è collegato a un circuito di respirazione necessario per gas / anestetici scavenging.
- Assicurarsi che l'anestesia sia adeguata per evitare che l'animale da subire dolore durante l'intervento chirurgico. Eseguire toe-pinch e osservare animali per non responsiveness per confermare l'anestesia.
- A quel tempo, cambiare la linea di valvole, la guarnizione alla casella e aperto al cono.
- Appena il mouse è anestetizzato, applicare una piccola quantità di una pomata oftalmica alle cornee come misura preventiva da essiccazione e danni.
- Successivamente, spostare l'animale alla zona di preparazione, con l'ogiva correttamente posizionati e connessi (per anestesia di mantenimento). Preparare il sito della incisione chirurgica per la chirurgia depilatoria in questa zona di preparazione.
- Assicurarsi che l'area di chirurgia è in una posizione libera di ogni altra attività.
- Assicurarsi che la superficie di lavoro è robusta e adeguatamente igienizzati, unsoiled e prima della chirurgia senza matasse di cavi. Posizionare un pezzo sterile lino o tray chirurgico su di esso.
- Assicurarsi che il campo operatorio è disponibile solo per persone che effettuano l'intervento chirurgico. Assicurarsi che la sala operatoria è pulita e spazzata con un detergente appropriato e spruzzato con un adeguato disinfectant.
- Assicurarsi che sia posizionato anche lontano da porte e finestre, come le correnti d'aria può diffondere la polvere che porta alla contaminazione del sito.
- Eseguire l'intervento chirurgico di sopravvivenza con strumenti sterili. O immergere gli strumenti in un disinfettante secondo le raccomandazioni del fabbricante o in autoclave. Utilizzare materiali sterili di base che sono pronti per l'uso.
- Strumenti separati in base alla funzione per aiutare a prevenire la contaminazione delle aree sterili.
- Shave circa 1 pollice intorno al sito di incisione (incisione mediana) per accedere al fegato dell'animale. Rimuovere il pelo dall'animale lontano dal sito chirurgico.
- Dopo la rasatura, strofinare la zona con un disinfettante e sapone (betadine scrub chirurgico) e lavare il disinfettante in eccesso con la soluzione di PBS sterile. Eseguire questo più volte, con l'intero processo di macchia della durata di circa 5 minuti. Rimuovere e scartato i guanti usati.
- In seguito, cambiare per indumenti protettivi, come SurgicAl abito, top scrub e maschera. Avanti, disinfettare le mani con soluzione macchia adeguata prima di indossare guanti chirurgici. Nota: Questo è un passo necessario per evitare spargimento e contaminare il sito chirurgico con potenziali contaminanti.
2. Chirurgia
- Fornire una fonte di calore esterna per calore durante l'intero periodo di anestesia. L'animale può verificarsi alcuni ipotermia a causa dell'anestesia provoca disturbi di termoregolazione; quindi, mantenere la temperatura corporea.
- Posare il mouse sulla sua schiena per tutta la chirurgia.
- Fissare gli arti anteriori, arti posteriori e la coda del mouse al tavolo operatorio con pezzi di nastri chirurgici.
- Fare una linea di incisione retta immediatamente inferiore al xyphisternum.
- Utilizzare uno sterile divaricatore chirurgica auto-mantenimento per esporre il fegato.
- Con una siringa con un ago 20G, lentamente e con attenzione iniettare 100 ml di PBS contenente 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1topo cellule HCC nel lobo destro del fegato.
- Dopo aver rimosso l'ago, applicare un tampone di cotone sterile per almeno 1 minuto per arrestare qualsiasi sanguinamento potenziale causa dell'alta vascolarizzazione del fegato.
- Chiudere il tessuto sottocutaneo con una sutura assorbibile seguita da chiusura pelle con clip chirurgiche. Successivamente, pulire la ferita ancora una volta con betadine scrub. Nota: Ciò garantirà la chiusura della ferita chirurgica.
- Sottocutanea dare 100 ml di soluzione fisiologica.
3. Post-chirurgia
- Subito dopo l'intervento chirurgico, trasferire il mouse in una gabbia pulita con una carta d'identità post-operatorio per notificare custodi della condizione del mouse. Fornire cibo e acqua. Nota: Nella nostra esperienza, un mouse che ha appena subito un intervento chirurgico se la passeranno meglio se alloggiati solo con cibo umido e acqua per il periodo di 24 ore dopo il primo intervento chirurgico.
- Tenere il caldo animale con una lampada di calore che genera calore non supera 38 ° C. USE un termometro per misurare la temperatura fino a quando il mouse è completamente recuperato.
- Casa l'animale in una gabbia, preferibilmente con biancheria da letto di carta per assicurare il comfort.
- Dopo il recupero iniziale, monitorare l'animale per segni di disagio, sanguinamento, dolore e angoscia. Dare buprenorfina (0,05 -0.1 mg / kg) per alleviare il dolore. Strettamente monitorare l'attività, comportamento e l'aspetto, così come l'acqua e il consumo di cibo per circa 2 ore. Se ambulatoriale, spostare l'animale torna alla zona per regolare un alloggio normale di topi e di continuare a monitorare a intervalli 6-12 hr per la post-operatorio 24 ore. Eseguire un controllo del peso se lo si desidera.
- Tuttavia, se l'animale sta avendo problemi recuperare, adottare le adeguate misure terapeutiche di supporto. Se i topi sono in grado di recuperare, umanamente eutanasia topi via di CO 2 asfissia e dislocazione cervicale. Seguire le linee guida istituzionali approvate per l'eutanasia.
- Post-operatorio, verificare la presenza di segni clinici di HCC che di solito è observable come significativa riduzione del body condition score. Nota: A questo punto, un tumore primario ha probabilmente sviluppato nel fegato e depositi metastatici hanno probabilmente sviluppata nei polmoni.
- A questo punto, sacrifica tutti i topi (sperimentale e di controllo) coinvolti nella sperimentazione per eutanasia umana. Sottoporre i topi all'anidride carbonica asfissia: molto lentamente rilasciare biossido di carbonio nella camera per un periodo di 5 -10 min. Ciò causerà arresto respiratorio.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Il fegato dei topi Balb / c sono stati impiantati con 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 cellule del mouse HCC. L'evidenza clinica di sviluppo HCC era osservabile 63 giorni dopo l'intervento. Di conseguenza, i topi sono stati umanamente eutanasia. Necroscopia è stata effettuata su topi eutanasia. I polmoni e il fegato sono stati asportati e un esame attento lordo è stata effettuata per identificare i tumori macroscopiche. In un mouse, un tumore superficiale è stata osservata sulla superficie del fegato con qualc...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
In questo articolo viene fornita una descrizione approfondita del metodo che è stato recentemente riportato da Ogunwobi e colleghi di successo creazione di un modello di topo singenici ortotopico di HCC metastasi (Figura 2) 3. Il tasso di tumori per questa procedura è generalmente elevata. Abbiamo già osservato un tasso di tumore al 100% 3. Tuttavia, il tasso di utilizzo può essere variabile a seconda della competenza del ricercatore. In un recente esperimento condotto da un nuovo ...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Pascal DuBois per aver corretto le bozze dell'articolo. Gli autori desiderano anche ringraziare il personale dell'Animal Facility dell'Hunter College della City University di New York. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione NIH RCMI all'Hunter College.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pinzetta per micro dissezione | Roboz | (RS-5040) | Punta 0,20 x 0,12 mm |
| Graefe Micro Dissecting Pincips, punta curva seghettata | Roboz | (RS-5111) | 1 X 2 denti, larghezza punta curva 0,6 mm |
| Micro Divaricatore per dissezione-Agricola (3 per 3 rebbi) | Roboz | (RS-6501) | Smussato 3 X 3 rebbi, profondità 4 mm, apertura 25 mm |
| Micro Divaricatore per dissezione-Goldstein (3 per 3 rebbi) | Roboz | (RS-6503) | Smussato, 3 x 3 rebbi, profondità 4 mm, apertura 19 mm |
| Calibro Jameson (misura i tumori) | Roboz | (RS-6466) | scala 80 mm/3 pollici, cromato |
| Forbici per micro dissezione, grandi ansori ad anello, lame diritte e affilate | Roboz | (RS-5852) | 23 mm, lunghezza 4 pollici, gambi piatti e anelli grandi |
| Bisturi con lame, per delicate procedure di dissezione | Roboz | (RS-9861-36) | |
| Manico per bisturi | Roboz | (RS-9884) | |
| Solid Littauer Stitch Sissors | Roboz | (RS-7074) | Lunghezza 4,5 pollici |
| Porta aghi marrone, per una facile legatura della sutura | Roboz | (RS-7960) | Mascella convessa, dentellature fini |
| Clip per ferite reflex da 7 mm con applicatore di clip reflex 7 | Roboz | (RS-9262) | metodo alternativo sicuro e sicuro per la chiusura della ferita |
| Vassoio per strumenti e coperchio | Roboz | RT-1350S | |
| Mini-clipper con lama staccabile | Roboz | (RS-5903) | |
| Germinator 500 (il Germ Terminator) Sterilizzatore a secco | Roboz | Ds-400, Ds-401, DS-501 | Per la decontaminazione rapida degli strumenti di micro-dissezione. Gli strumenti decontaminano entro 15 sec. |
| Aghi per microiniezione | VWR | BD305125 | 25G Ago |
Riferimenti
- Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a Chip. 14, 89-98 (2014).
- Ogunwobi, O. O., Liu, C. Therapeutic and prognostic importance of epithelial-mesenchymal transition in liver cancers: insights from experimental models. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 83, 319-328 (2012).
- Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS One. 8, e63765(2013).
- Ogunwobi, O. O., Liu, C. Hepatocyte growth factor upregulation promotes carcinogenesis and epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma via Akt and COX-2 pathways. Clinical and Experimental Metastasis. 28, 721-731 (2011).
- Fujiwara, S., et al. A novel animal model for in vivo study of liver cancer metastasis. World Journal of Gastroenterology : WJG. 18, 3875-3882 (2012).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11, 512-522 (2011).
- Heindryckx, F., Colle, I., Van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
- Zhang, L., et al. An in vivo mouse model of metastatic human thyroid cancer. Thyroid Official Journal of the American Thyroid Association. 24, 695-704 (2014).
- Menezes, M. E., et al. Genetically engineered mice as experimental tools to dissect the critical events in breast cancer. Advances in Cancer Research. 121, 331-382 (2014).
- Ogunwobi, O. O., Wang, T., Zhang, L., Liu, C. Cyclooxygenase-2 and Akt mediate multiple growth-factor-induced epithelial-mesenchymal transition in human hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 27, 566-578 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139, 1315-1326 (2009).
- Stolpe, A., Pantel, K., Sleijfer, S., Terstappen, L. W., den Toonder, J. M. Circulating tumor cell isolation and diagnostics: toward routine clinical use. Cancer Research. 71, 5955-5960 (2011).
- Saad, F., Pantel, K. The current role of circulating tumor cells in the diagnosis and management of bone metastases in advanced prostate cancer. Future Oncology. 8, 321-331 (2012).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
