Isolamento e propagazione di cellule tumorali circolanti da un mouse cancro modello

Sommario

È stato dimostrato che le cellule tumorali circolanti (CTC) svolgono un ruolo importante nelle metastasi tumorali. Qui, viene descritto un metodo per l'isolamento e la propagazione di CTC dal sangue intero di un modello di tumore murino singenico di metastasi da carcinoma epatocellulare (HCC).

Abstract

Le metastasi tumorali sono la principale causa di decessi associati al cancro. Studi recenti hanno dimostrato che le cellule tumorali circolanti (CTC) sono importanti nelle metastasi del cancro. Infatti, il numero di CTC è correlato alle dimensioni del tumore. Qui, viene fornita una descrizione dettagliata di una metodologia per l'isolamento e la propagazione di CTC da un modello murino singenico di carcinoma epatocellulare (HCC) che consente l'analisi a valle di meccanismi molecolari potenzialmente importanti delle metastasi del tumore d'organo solido. Questo metodo è efficiente e riproducibile. È una tecnica non invasiva e, quindi, ha il potenziale per sostituire la biopsia invasiva dei tessuti dell'uomo che può essere associata a complicanze. Pertanto, il metodo qui discusso consente l'isolamento e la propagazione delle CTC da campioni di sangue intero in modo che possano essere esaminate e caratterizzate. Ciò ha il potenziale per l'adattamento futuro per applicazioni cliniche come la diagnosi e la terapia mirata personalizzata.

Introduzione

La comunità di ricerca sul cancro è a conoscenza dell'esistenza di cellule tumorali circolanti (CTC) da quando è stata osservata per la prima volta da Thomas Ashworth nel 1869¹. Da allora, le CTC hanno dimostrato di essere importanti nelle metastasi tumorali e nella progressione della malattia^2-5. Oggi, i tumori solidi sono una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Le CTC sono cellule rare che originano da tumori primari e viaggiano attraverso il flusso sanguigno verso diversi organi, di cui solo una piccola frazione si sviluppa in metastasi^2-5. In particolare, esiste una correlazione positiva tra le dimensioni del tumore e il numero CTC^3,4.

Una comprensione della biologia CTC può contribuire alla ricerca di una terapia mirata. Inoltre, i CTC possono avere applicazioni diagnostiche. Per ottenere queste potenziali applicazioni cliniche, è necessario superare alcune sfide attuali nello studio delle CTC. Una sfida è legata al fatto che le CTC possono essere presenti come singole cellule o come cluster e possono anche essere in grado di modificare il loro fenotipo in risposta al microambiente del sangue². Inoltre, il rilevamento può essere molto impegnativo, in parte, a causa del basso numero di CTC (da poche a centinaia per millilitro) tra un miliardo di cellule ematologiche per millilitro nel sangue⁶. Tuttavia, negli ultimi anni, la ricerca sulle potenziali applicazioni cliniche delle CTC nei tumori degli organi solidi si è intensificata.

Nonostante questi sforzi, le sfide per studiare e comprendere il ruolo delle CTC persistono a causa della rarità delle CTC e dell'inadeguatezza degli strumenti tecnologici attualmente disponibili. Nonostante queste sfide, l'enorme potenziale per le applicazioni cliniche continua ad essere un incentivo a perseguire la ricerca sul ruolo delle CTC nelle metastasi del cancro.

Recentemente siamo riusciti a isolare e propagare in coltura cellulare CTC da un modello murino singenico ortotopico di metastasi 5 del carcinoma epatocellulare⁽HCC). Lo scopo del presente articolo è quello di descrivere in dettaglio tutti gli aspetti della metodologia di successo. L'importanza di questa metodologia risiede nel fatto che questo approccio può essere modificato al fine di isolare e propagare con successo in coltura CTC umane, aumentando così la possibilità di studi in vitro di biologia delle CTC.

Ci sono molteplici potenziali applicazioni cliniche per l'uso delle CTC. Le CTC possono essere utili per la prognosi, il monitoraggio della risposta, lo screening, il monitoraggio dinamico delle alterazioni molecolari del tumore e la terapia personalizzata⁴. Pertanto, una migliore comprensione della biologia delle CTC ha un alto potenziale di impatto clinico.

Protocollo

Etica Dichiarazione: Tutti gli studi su animali sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) di Hunter College della City University di New York.

1. Procedure di pre-esperimento

1. All'arrivo alla struttura animale, inizialmente ospitare 3 topi BALB / c ad una gabbia con un letto di top e trucioli di legno filtrata. Assicurarsi che i topi hanno libero accesso a cibo, Purina roditori chow, e acqua. Biancheria da letto e cibo devono essere cambiati due volte a settimana, mentre le gabbie devono essere puliti una volta a settimana.
2. Un'anestesia generale in topi usando un vaporizzatore isoflurano con ossigeno ad un flusso costante di 1 L per min. Il sistema è autosufficiente e comprende un vaporizzatore di precisione.
3. Posizione animale in una scatola di plastica che ha il vaporizzatore precisione e gas / sistema anestetico ad esso collegato. Inizialmente impostare il vaporizzatore di 2,5 fino a quando animale è incosciente, a questo punto abbassare il vaporizzatore a 2.
4. A quel tempo, accendere illinea di valvole, sigillandolo alla casella e aprendo al cono.
5. Spostare l'animale alla zona di preparazione, con l'ogiva posizionato correttamente e collegato (per anestesia di mantenimento).
6. Preparare 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 cellule del mouse HCC per l'impianto per il mouse. BNL 1ME A.7R.1 dovrebbero crescere in mezzo (10% FBS inattivato al calore, 1% di penicillina / streptomicina e 2 mM L-Glutammina) incubazione in un piatto di coltura cellulare a 37 ° C in un incubatore umidificato con aria e 5% CO _2.
7. Con una siringa con un ago G 20, impianto 100 pl di PBS contenente 5 x 10 ⁶ Bnl 1ME A.7R.1 cellule di carcinoma epatocellulare topo in un lobo di fegato di topi BALB / c per produrre i tumori primari. Post-impianto, la casa dei topi BALB / c in una gabbia con gli stessi requisiti di case come pre-impianto.
8. Al punto finale sperimentale, evidenza clinica di carcinoma epatocellulare è osservabile come riduzione significativa condizione corporeapunteggio (solitamente rilevata dopo 4 settimane). A questo punto, vi è un rischio che i tumori primari hanno sviluppato nel fegato mentre i depositi metastatici sono formati nei polmoni. Successivamente, avviare il processo di isolamento e propagazione delle cellule tumorali circolanti.

2. Raccolta di sangue intero per far circolare tumore isolamento delle cellule

NOTA: validato correttamente l'area chirurgia e assicurarsi che sia privo di disordine. Autoclavare tutti gli strumenti chirurgici o immergersi in una disinfettante secondo la raccomandazione del costruttore

1. Sacrifice topi eutanasia umana a sperimentale end-point (evidenza clinica di sviluppo del tumore). Euthanization di topi dovrebbe coinvolgere CO ₂ asfissia. Osservare i topi correttamente per confermare l'anestesia è distribuito correttamente. Il biossido di carbonio dovrebbe essere rilasciato lentamente nella camera per un periodo di 5 - 10 min, causando arresto respiratorio. Seguire per dissanguamento intracardiaca e cervicoAl dislocazione. ⁵
2. Utilizzare un ago 25 G attaccato ad una siringa da 1 ml per la raccolta di sangue intero. Heparanize la siringa con 0,01 ml di eparina. Puntura immediatamente la pelle con l'ago inferiore al xyphisternum a circa 45 °. Avanzare lentamente l'ago per perforare il cuore, e quindi abbassare l'angolo dell'ago. Costantemente tenere l'ago e la siringa sul posto, e tirare fuori 500 ml - 1000 ml di sangue intero dal cuore.
3. Rimuovere la siringa e l'ago e trasferire il sangue in una provetta apirogena 1,5 ml di pre-etichettati. Centrifugare il sangue intero raccolto in 1,5 ml provetta apirogena a 1.167 g per 5 min.
   NOTA: La centrifugazione separa il campione di sangue intero in tre strati: lo strato inferiore o ematocrito costituito da globuli rossi, un sottile strato intermedio di buffy coat, e uno strato superiore di plasma.
4. Rimuovere il plasma accuratamente pipettando e raccolta in una provetta da 1,5 ml apirogena esente separato per Further esperimenti come il rilevamento degli acidi nucleici cell-free ^7.
5. Per l'isolamento di cellule tumorali circolanti (CTC), raccogliere il buffy coat in un tubo di 1,5 ml apirogena separata in preparazione dei globuli rossi (RBC) lisi. Ciò è necessario rimuovere RBC residue nello strato buffy coat.

3. Ricetta per globuli rossi (RBC) Lysis Buffer

1. Fare una soluzione 1 L di tampone di lisi RBC.
2. Fare un 500 ml di cloruro di ammonio e 500 ml di Tris. Quindi mescolare per creare una soluzione 1 L di tampone di lisi degli eritrociti con una concentrazione finale di 155 mM di cloruro di ammonio e 10 mM di Tris.
3. Buffer la soluzione a pH 7,5. Conservare il tampone di lisi RBC a 2-8 ° C, e portare a RT immediatamente prima dell'uso.

4. RBC Lisi di Buffy Coat

1. Aggiungere 1 ml di tampone di lisi RBC al tubo di 1,5 ml apirogena sterile contenente il buffy coat raccolto.
2. Mescolare il contenuto della provetta dainvertendo più volte. Incubare si mescola della provetta per 5 minuti a RT in panchina. Centrifugare il contenuto misti per 5 min a 1167 x g.
3. Dopo centrifugazione, si otterrà un pellet biancastra. Scartare il surnatante rossastro lentamente e con attenzione in candeggina al 10%, senza alcuna interruzione al pellet. Se il pellet non è biancastra, rifare i passaggi 3,1-3,5. Aumentando il tempo di incubazione in tampone di lisi RBC a 10 - 15 min può anche essere utile.
4. Gettare i rifiuti biologici, una volta la decontaminazione dei rifiuti biologici nel 10% di candeggina è completo dopo 24 ore.

5. Propagazione in coltura cellulare

NOTA: Le cellule tumorali sono in genere in rapida crescita delle cellule dei globuli bianchi che sono abbondanti nel mix originale di cellule seminate nel piatto. A seguito di ripetute cambio di medium, e successive passaggi di CTC, tutti i globuli bianchi vengono rimossi e una popolazione relativamente puro di CTC rimane.

1. Doposcartando il supernatante in 10% di candeggina, lavare il pellet biancastra in 1 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), almeno una volta, e risospendere in mezzo di coltura completo per la propagazione in coltura cellulare.
2. Dopo lavaggio è completato, aggiungere 1 ml di mezzo completo di coltura A.7R.1 BNL 1ME (10% FBS inattivato al calore, 1% di penicillina / streptomicina e 2 mM L-Glutammina) al pellet e risospendere il pellet nel mezzo di coltura.
3. Seme il mix risospeso di cellule in un piatto di coltura cellulare. Incubare il piatto di coltura cellulare a 37 ° C in un incubatore umidificato con aria e 5% di CO _2.
4. Modificare il mezzo di coltura cellulare ogni due o tre giorni. Dopo cinque a sette giorni, CTC avrà aderito al piatto di coltura cellulare e ha iniziato a proliferare. Queste cellule rimangono vitali oltre 25 passaggi e dopo congelamento e scongelamento ripetuti cicli di ^5.

6. Verifica di carcinoma epatocellulare circolazione Tumor Cell Line

1. Eseguire apolymerase reazione a catena (PCR) basata su metodo, di amplificare un solo segmento di DNA specifico del gene β-globina topo per confermare che il romanzo ha stabilito linee cellulari CTC sono cellule di topo, come la linea di BNL impiantato 1ME A.7R.1 HCC originale. Metodo è stato originariamente descritto e validato da Steube et al. ^5,8
2. Eseguire immunostaining per la specifica per epatociti marcatore cAMP elemento sensibile binding protein 3-simile 3 (CREB3L3) utilizzando un anticorpo specifico. Ciò conferma che il romanzo CTC stabiliti sono infatti epatociti come la impiantato linea cellulare BNL 1ME A.7R.1 originale. ⁵

Risultati

La metodologia qui descritta ha dimostrato che CTC possono essere isolati. I topi sono stati umanamente eutanasia alla sperimentale punto finale. Il processo ha coinvolto anidride carbonica per asfissia, dissanguamento intra-cardiaca, e dislocazione cervicale. Uno schema di passi principali della procedura sono illustrati in Figura 2. Campioni di sangue intero prelevato da dissanguamento intra-cardiaca sono stati elaborati usando il protocollo descritto sopra. Dopo di che, la centrifuga...

Discussione

In questo studio, è stato descritto come isolare e propagare le CTC dal sangue intero di un topo singenico con HCC. L'obiettivo di questo lavoro è quello di migliorare gli studi in corso sui meccanismi delle metastasi tumorali.

Un fattore che contribuisce alla prognosi infausta di molti tumori è la mancanza di una diagnosi tempestiva e la conseguente diffusione diffusa della neoplasia3^. Le CTC originano da tumori primari e si diffondono attraverso il flusso sanguigno a organi dista...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Eparina Sale Sodico 1 g	VWR	89508-852
BTX Tubo Micro 1,5 ml Trasparente NS	VWR	89511-254	1,5 ml  apirogeno Eppendorf
Tubes Ago Sterile Disp BD 25 G x 1 in	VWR	BD305125	25 G Ago
Slp Tip SRNG 1 ml 200 ciascuno per confezione	VWR	BD309659	1 ml di punta per siringa
Siringa 1 ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	siringa da 1 ml
VWR Pinze Tessuto 6	VWR	82027-446	Pinze
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4 oz	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72	VWR	48311-703	Vetrini
VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm	VWR	48-382-128	Vetro di copertura
VWR Slide Box True North Fm Pu	VWR	89140-278	Slide Box
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	PAP pen
Water RNASe and DNAse free 2 L	VWR	101454-204	Tampone acqua privo di nucleasi
Tris Ultra Pure Grade 500 g	VWR	97061-796	Tris Buffer
Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg	VWR	97062-048	Tampone per cloruro di ammonio
Piatto per coltura tissutale per falco 60 x 15 mm	Piatto per coltura tissutale	VWR	353002
Candeggina germicida Clorox, normale	VWR	89501-620	Candeggina Clorox
PBS, 1x (soluzione salina tamponata con fosfato) senza calcio e magnesio (500 ml)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1x
DMEM, 1x  con 4,5 g/L di glucosio & L-glutammina senza piruvato di sodio	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1x terreno per cellule BNL 1ME A.7R.1
Siero fetale bovino	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Penicillina Streptomicina soluzione, 100x	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Penicillina Streptomicina
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	Centrifuga 13.000 giri/min

in polistirene