Qui descritto è un protocollo per isolare e studiare ulteriormente i leucociti infiltranti della decidua basalis e della decidua parietalis - l'interfaccia materno-fetale umana. Questo protocollo mantiene l'integrità dei marcatori della superficie cellulare e produce un numero sufficiente di cellule vitali per le applicazioni a valle, come dimostrato dall'analisi della citometria a flusso.
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Articolo metodologico
L'isolamento dei leucociti di Human Interface materno-fetale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gravidanza è caratterizzata dalla infiltrazione di leucociti nei tessuti riproduttivi e all'interfaccia materno-fetale (basalis decidua e decidua parietalis). Questa interfaccia è il sito anatomico di contatto tra materna e tessuti fetali; Pertanto, è un sito immunologica di azione durante la gravidanza. Leucociti infiltranti all'interfaccia materno-fetale svolgono un ruolo centrale in impianto, manutenzione di gravidanza, e la tempistica di consegna. Pertanto, caratterizzazioni fenotipiche e funzionali di questi leucociti forniranno informazioni sui meccanismi che portano a disturbi della gravidanza. Diversi protocolli sono stati descritti per isolare leucociti infiltranti dai basalis decidua e parietalis decidua; Tuttavia, la mancanza di uniformità nei reagenti, enzimi, e tempi di incubazione rende difficile confrontare questi risultati. Descritto qui è un nuovo approccio che combina l'uso di dolci diss meccanici ed enzimaticitecniche ociation per preservare la vitalità e l'integrità dei marcatori extracellulari e intracellulari nei leucociti isolati dai tessuti umani all'interfaccia materno-fetale. A parte immunofenotipizzazione, coltura cellulare, e lo smistamento delle cellule, le future applicazioni di questo protocollo sono numerose e varie. Seguendo questo protocollo, i leucociti isolati possono essere utilizzati per determinare la metilazione del DNA, l'espressione di geni bersaglio, in funzionalità vitro leucociti (cioè, fagocitosi, citotossicità, la proliferazione delle cellule T, e plasticità, ecc), e la produzione di specie reattive dell'ossigeno all'interfaccia materno-fetale. Inoltre, utilizzando il protocollo descritto, questo laboratorio è stato in grado di descrivere nuove e rare leucociti all'interfaccia materno-fetale.
Introduzione
La gravidanza è caratterizzato da tre fasi distinte, immunologiche: 1) impianto e placentazione precoce associata ad una risposta pro-infiammatoria (cioè, l'impianto assomiglia un 'ferita aperta'); 2) il secondo trimestre e la maggior parte del terzo trimestre di gravidanza, quando omeostasi immunitaria è ottenuta attraverso uno stato prevalentemente antinfiammatoria all'interfaccia materno-fetale; e 3) il parto, uno stato pro-infiammatorio 1-7. Le cellule immunitarie svolgono un ruolo importante nella regolazione della risposta infiammatoria all'interfaccia materno-fetale in cui la loro abbondanza e il cambiamento di localizza....
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Protocollo
Questo protocollo è appropriato per leucociti isolamento dai basalis decidua e parietalis decidua in preparazione per immunofenotipizzazione mediante citometria di flusso. Inoltre, le cellule isolate possono essere utilizzati per la separazione delle cellule, colture cellulari, isolamento dell'RNA, e citologia. Prima di lavorare con i campioni di cui al presente protocollo, l'approvazione etica umana deve essere ottenuto dal Research Comitato Etico Locale e Institutional Review Boards. La raccolta e l'utilizzazione di campioni umani a fini di ricerca sono state approvate dai Institutional Review Board dell'Istituto Nazionale Eunice Kennedy Shriver....
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Risultati
. La dissezione dei tessuti umani all'interfaccia materno-fetale (basalis decidua e decidua parietalis) è mostrato in Figura 1 Questa procedura prevede la dissezione della piastra basale, che comprende le basale decidua (Figura 1A - D). Il basalis decidua è ottenuto rimuovendo villi placentare (lato fetale) dalla piastra basale (Figura 1C). Il parietalis decidua viene raccolto raschiando delicatamente la membrana corionica (Figura 1E
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Discussione
Caratterizzazione delle proprietà funzionali e fenotipiche di leucociti infiltranti all'interfaccia materno-fetale umano è essenziale per la comprensione dei meccanismi immunitari che portano a disturbi della gravidanza. Diverse tecniche sono state descritte per isolare leucociti dall'interfaccia materno-fetale durante la gravidanza umana 10,14,25,28,37,42,43. Tuttavia, ciascuna di queste tecniche è distinta, utilizza enzimi o combinazioni di enzimi diversi, richiede diversi tempi di dissociazione, no.......
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Dichiarazioni
Gli autori non rivelano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH / DHHS. Questo lavoro è stato supportato anche, in parte, dalla Wayne State University perinatale Iniziativa in materna, perinatale e la salute del bambino. Si ringrazia Maureen McGerty (Wayne State University) per la sua lettura critica del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dissection | |||
| Strumenti di dissezione sterili: forbici chirurgiche, pinze e pinzette a punta fine | Qualsiasi fornitore | 20012-027 | |
| 1X soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
| Piastre di Petri grandi e piccole | Qualsiasi fornitore | ||
| Dissociation | |||
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (soluzione di distacco cellulare) |
| Provette coniche sterili da 2 ml con chiusura di sicurezza | Qualsiasi | ||
| 50 ml Provette da centrifuga coniche | Any vendor | ||
| 100 µ filtri cellulari | m FALCON/Corning | 352360 | |
| Provette in polistirene a fondo tondo da 5 ml | Qualsiasi fornitore | ||
| Pipette di trasferimento | Qualsiasi fornitore | ||
| Provette C | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Cell Culture | |||
| RPMI terreno di coltura 1640 | Life Technologies | 22400-089( | 1X) (10% FBS e 1% P/S) |
| Vetrini per camera in plastica | Thermo Scientific | 177437 | |
| Incubatore | Thermo Scientific Corporation | HEPA Classe 100 | |
| Bagnomaria | Fisher Scientific ISOTEMP | 110 | |
| Contatore di cellule | Nexelcom | Cellometro Auto2000 | |
| Microscopio | Olympus | Olympus CKX41 | |
| Cell Separation | |||
| MS colonne | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Separatore cellulare | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 30 μ m filtri di pre-separazione | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
| Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml provette coniche con chiusura di sicurezza | Qualsiasi fornitore | ||
| MACS tampone | (0,5% di albumina sierica bovina, 2 mM EDTA e 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901( | Fc Block) |
| Anticorpi anti-antigene della superficie cellulare umana | BD Biosciences | (Tabella 1) | |
| Albumina sierica bovina | Sigma | A7906 | |
| LIVE/DEAD colorante di vitalità | BD Biosciences | 564406 | |
| tampone Lyse/Fix | BD Biosciences | 346202 | |
| tampone FACS | (0,1% BSA, 0,05% azoturo di sodio e 1X PBS, pH=7,4) | ||
| Tampone di colorazione | BD Biosciences | 554656 | |
| Soluzione di blu di tripano 0,4%Life | Technologies | 15250-011 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Terreni a gradiente di densità del 20% (1,077 + 0,001 g/ml) |
| Strumenti aggiuntivi | |||
| Incubatore con agitatore | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
| Citometro a flusso | BD Biosciences Centrifuga | LSR-Fortessa | |
| Beckman Coulter | SpinChron DLX | ||
| Sistema per vuoto | Qualsiasi fornitore | ||
| Dissociatore automatico dei tessuti | Miltenyi Biotec | dissociatore |
Riferimenti
- Kelly, R. W. Inflammatory mediators and parturition. Rev Reprod. 1 (2), 89-96 (1996).
- Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition--a review. Placenta. 24, Suppl A. S33-S46 (2003).
- Romero, R., et al.
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Ristampe e permessi
